凯氏定氮法课件.ppt
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1、第第3章章 食品营养组成专用仪器分析技术食品营养组成专用仪器分析技术生科学院3.1蛋白质专用仪器分析技术蛋白质专用仪器分析技术n蛋白质是食品中的主要营养成分, 是食品及饲料等行业生产与研究中的常检项目。蛋白质的传统测定方法有凯氏定氮法、双缩脲法、福林-酚试剂(lowry)法和考马斯亮蓝(Bradfold)法等,近年来,国内外研究集中在染料结合分光光度法、金属-染料结合分光光度法、液相色谱法、毛细管电泳法等。蛋白氮与非蛋白氮蛋白氮与非蛋白氮n蛋白质含量主要通过测定含氮物质来确定。乳中的氮含量包括蛋白态氮(Portein nitrogen,NP)和非蛋白态氮(Non-portein nitroge
2、n,NPN),其中前者占95%,后者约占5%。蛋白质是乳中的主要含氮物质;乳中还有其它含氮物,主要来源于乳中的氨、尿素、肌酸、肌酸酐、尿酸、乳清酸、多肽、马尿酸、氨基酸和其它成分,这些成分构成了所谓的非蛋白氮。乳真蛋白(True Protein,TP)即除了非蛋白态氮以外的蛋白态氮所计算得到的蛋白,正常情况下,天然乳中真蛋白的含量少于粗蛋白。非蛋白氮测定意义非蛋白氮测定意义n2001年,国际标准化组织和国际乳品联合会发布了乳制品中非蛋白氮测定的标准方法,该法提出了蛋白氮和非蛋白氮的分离方法,弥补了凯氏定氮法不能区分蛋白氮和非蛋白氮的缺陷,该方法我国于2008年等同引用。非蛋白氮测定意义非蛋白氮
3、测定意义n传统上乳蛋白测定采用凯氏定氮法,它测定的是乳中总氮的含量,再乘以乳蛋白氮与蛋白质的换算系数6.38,即为乳蛋白质含量。这样得到的蛋白质含量被定义为粗蛋白(crude Protein,CP),因为它含有蛋白氮和非蛋白氮。随着乳的计价更倚重真白质,对测定真蛋白(TP)则变得越来越重视,因为只有真蛋白才有营养价值。n随着分析手段的不断进步,如何准确、快速、高效、低成本的测定蛋白质含量,是食品行业面临的重要问题之一,也是检测技术发展的重要方向。基于此,采用新型指示剂,并结合指示剂的生物技术,可准确、快速、便携、高效准确的检测出牛奶中的蛋白含量。3.1.1凯氏定氮法凯氏定氮法n凯氏定氮法是18
4、33年由Kieldhal首先提出的,是最为经典的蛋白质测定方法,测定结果的准确度和精密度都很高,适宜于测定固态或液态的样品。直到现在,在国内外仍然应用普遍。3.1.1.1凯氏定氮法的基本原理凯氏定氮法的基本原理n含氮的有机物与浓硫酸共同加热时,其中的碳、氢等元素被氧化成二氧化碳和水逸出,有机氮转化为氨,并进一步与硫酸结合生成硫酸铵。通常称此过程为“消化”。n但是这个反应进行得比较缓慢,通常需要加入硫酸钾来提高反应液的沸点,并加入硫酸铜作为催化剂,以促进反应的进行,指示消化终点的到达。n浓碱可以使消化液中的硫酸铵分解,游离出氨,水蒸气将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中,硼酸吸收氨后使溶
5、液的氢离子浓度降低,然后用标准无机酸滴定,直到恢复溶液中原来氢离子浓度为止,最后根据所消耗标准酸的当量数计算出待测物中的总氮量,再乘以蛋白质系数即为蛋白质的含量。直接法与间接法直接法与间接法n在测定粗蛋白的基础上,美国科学家于二十世纪九十年代己完成由凯氏定氮分析乳中真蛋白的方法。主要有直接法和间接法,直接法的原理为采用最终浓度为10%w/v的三氯醋酸沉淀乳中的蛋白质,用过滤法除去非沉淀部分的三氯醋酸溶液和非蛋白态氮成分,将滤渣收集起来,用传统的方法进行定氮。间接法则与直接法相反,先测定乳中的总蛋白,再测定其非蛋白态蛋白,总蛋白减去非蛋白态蛋白则得到真蛋白含量。3.1.1.2凯氏定氮法的优缺点凯
6、氏定氮法的优缺点n凯氏定氮法是测定总有机氮的最准确的方法,是各种蛋白质含量测定方法的基础。经过不断的研究改进,该法具有应用范围广、灵敏度高、回收率较好、使用仪器设备简单等优点。但是该法操作费时,消化一个样品至少需要2个小时,完成整个操作流程一般需要5个小时左右,并且在消化过程中产生大量的有害气体(二氧化硫)污染工作环境,危害操作人员的身体健康。所以该法一般只能在实验室中由训练有素的实验员来完成。n凯氏定氮法是生化研究中最基本的分析方法之一。为了达到能快速分析控制、减少环境污染、简化操作过程、缩短测定时间等目的,人们又陆续创立了不少快速测定蛋白质的方法。如双缩脲法、福林一酚法、紫外分光光度法、考
7、马斯亮蓝法、近红外光谱法等。3.1.2 UDY染料染色法染料染色法n UDY染料染色法只结合蛋白质包括酪蛋白和乳清蛋白,UDY采用蛋白与一定pH的橙酸12染料结合的原理测定乳中的氨基酸,如精氨酸、组氨酸和赖氨酸,其中多肽链长度须在5个氨基酸以上。其红色的色泽随结合的蛋白质含量而变化,色泽的减退与蛋白的浓度呈反比,因此只要在一定的波长下测定其色泽的程度,即可计算得到蛋白的浓度。3.1.3红外法红外法n红外法采用的是不同分子的物质与特定波长下的反应,因此既可以测定总蛋白,亦可以测定真蛋白,应用时以标定的物质为基础。UDY法只结合蛋白质的部分多肽键,其读数较凯氏定氮法低。由于红外测定的为真蛋白,因此
8、读数亦较凯氏定氮法低。n红外法可分析乳中的总蛋白和真蛋白,目前美国大多数实验室采用红外分析仪测定乳中真蛋白,但在2000年以前以及世界上大部分国家,目前仍分析总蛋白。因为红外不能直接测定乳中的非蛋白态氮,红外仪器分析必须用凯氏定氮法来标定。直接凯氏法测定粗蛋白,乳中非蛋白态氮的测定则通过上述间接法测定,然后将真蛋白加上非蛋白态氮得到的蛋白与红外分析仪作校对。因为非蛋白态氮的蛋白值与粗蛋白的比值不是恒定的,而随脲的含量变化而变化,这样如果用红外或其它仪器测定粗蛋白时就会有较大的误差。不同蛋白质含量测定方法的比较3.2蛋白质快速检测仪蛋白质快速检测仪n基于蛋白质多种多样的检测方法,可以应用于蛋白质
9、检测的检测仪有很多,这些检测仪按作用可分为专用型和多用型。专用型只用于蛋白质检测的检测仪,而多用型是既可以检测蛋白质也可以检测其他类型物质的检测检测仪。3.2.1多用型蛋白质分析仪多用型蛋白质分析仪 n多用型蛋白检测仪使用的检测方法所针对的理化性质并非蛋白质才有,如近红外光谱吸收和氮元素守恒。这类检测仪不仅能够检测蛋白质,还可以用在其它的具有相同性质的物质监测分析上。3.2.2专用型蛋白质分析仪专用型蛋白质分析仪n专用型蛋白质分析仪,使用的检测原理是基于蛋白质所独有的理化性质,或者是相比于其他物质而言蛋白质能表现得更加明显。专用型蛋白质分析仪主要是根据蛋白质跟不同物质的结合会产生与之相对应的颜
10、色这一机理来研制的。3.3 基于定氮原理的蛋白质快速检测器基于定氮原理的蛋白质快速检测器n3.3.1.1国外研发的蛋白质快速检测仪国外研发的蛋白质快速检测仪 n氮元素法是当前蛋白质检测的主要标准,因此长期以来国内外研发的蛋白质检测仪主要是以凯氏定氮仪和燃烧定氮仪这两种为主。n长期以来,像其它类型检测仪一样,在我国占据主要优势的是进口多用型蛋白质分析仪,国际上几大分析检测仪的厂商都有相关的产品。从近几年的国内检测仪市场销售情况来看,进口的燃烧定氮仪种类稀少,而进口凯氏定氮仪种类很多。3.3.1.1国外研发的蛋白质快速检测仪国外研发的蛋白质快速检测仪n在进口的燃烧定氮仪里,比较新的检测仪是荷兰Sk
11、alar公司生产的 Primacs-SN型杜马斯燃烧型定氮仪。该企业生产的检测仪,使用的燃烧炉是竖直形式的,与之配合的竖直的自动进样系统,该型号检测仪具有检测迅速、检测灵敏度高、全自动运行等特点,而且检测无废液废气排出,可以实现无污染无危害的检测。该型号检测仪对氮元素的检测范围是 0200mg,检测限值小于 0.01%,重复性误差不高于 0.5%,单个样品检测所需要的时间大概在 35min 之间。该型号检测仪装配有 20 位的自动取样进样装置,具备一套完整的数据分析和处理软件,还配有天平数据接口,可将检测数据自动录入。同时检测的原始数据不仅可以自动储存,还可以通过网络连接将其发送到实验室内的数
12、据管理系统。目前,该型号的蛋白质检测仪在国内市场上报价在3040 万元之间。3.3.1.1国外研发的蛋白质快速检测仪国外研发的蛋白质快速检测仪3.3.1.1国外研发的蛋白质快速检测仪国外研发的蛋白质快速检测仪n杜马斯燃烧法是国际上常用于蛋白质含量测定的方法。样品燃烧后生成的氮氧化物在钨上还原为分子氮,分子氮由二氧化碳载气运送到TCD热导检测器,氮含量引发一种电子测量信号,经过标准物质独立校正被测样品中氮含量,然后转换为蛋白质的含量。从原理上看,如不对样品进行预处理,该方法与凯氏定氮法同样也无法区分蛋白质氮和非蛋白质氮。3.3.1.1国外研发的蛋白质快速检测仪国外研发的蛋白质快速检测仪n通过市场
13、调查,其它的几种在国内市场上销售的燃烧定氮仪大致分为以下几种:美国 THERMO SCIENTIFIC公司的FLASH 2000型总氮/蛋白质分析仪、美国 LECO公司的FP528/FP628型蛋白质检测仪、意大利 VELP公司的NDA701型杜马斯燃烧定氮仪、意大利Eurovecto公司的EA3027-Port蛋白质分析仪、德国 Elementar 公司的 Rapid Ncube 和 Rapid NIII/vario型杜马斯燃烧定氮仪和德国Gerhardt公司的Dumatherm DT型燃烧定氮仪等。这些仍在市售的燃烧定氮仪,其检测灵敏度和测量范围都与 Primacs-SN型杜马斯燃烧定氮仪
14、的相差很小,只是自动化程度、人性化设计和数据分析处理等方面不尽相同,这一类型检测仪的市售价都在 30 万人民币左右。3.3.1.1国外研发的蛋白质快速检测仪国外研发的蛋白质快速检测仪n而相比于进口燃烧定氮仪,进口的凯氏定氮仪的种类就更显繁多,较为突出的检测仪有德国 Behr 公司生产的 S 系列凯氏定氮仪、德国 OMNILAB 公司生产的 FOODALY D5000 型全自动凯氏定氮仪和瑞典 Nils Foss 公司生产的 Kjeltec 8400 型全自动凯氏定氮仪等。 nBehr S 系列凯氏定氮仪主要由三部分组成,分别是滴定部分、蒸馏部分和消解部分,而蒸馏部分和消解部分各自都有 5 种不
15、同的配备。Behr S 系列凯氏定氮仪的检测范围在0.1200mg 之间,重复误差不高于 1%,市售价约在 1020 万元之间。3.3.1.1国外研发的蛋白质快速检测仪国外研发的蛋白质快速检测仪nFOODALY D5000 型全自动凯氏定氮仪配备有消解装置,集滴定、蒸馏、冷却和尾气系统抽取于一体。该检测仪的检测范围为 0.1200mg,重复误差小于 1%。除此之外,该检测仪具备有故障诊断报警系统,当出现缺酸碱、缺少稀释溶液和消化管位置不正确等情况时,检测仪会停止运行同时发出灯光报警,市售价约在 2030 万元之间。 nKjeltec 8400 型凯氏定氮仪按照其自动进样装置分为两种,20 位自
16、动进样检测仪和60 位自动进样检测仪。但无论是哪一种的该型号检测仪,都具备有全自动检测功能,进样、检测、处理结果等一系列操作均自动完成,可以直接显示处理后的结果。该检测仪的检测范围在 0.1200mg 之间,重复度不超过 1%,市售价在 1020 万元之间。3.3.1.2国内研发的蛋白质检测仪国内研发的蛋白质检测仪n近十几年来,国产蛋白质检测仪快速发展,国内多家公司推出可用于蛋白质检测的多用型检测仪。由于燃烧定氮仪在生产设计方面需要较高的技术支持,目前国内还没有相关的检测仪。凯氏定氮仪有相关产品近百种,其中具有代表性的国产凯氏定氮仪的有上海沛欧分析检测仪公司的 SKD-100 型凯氏定氮仪、济
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