分子生物学常用技术及其应用课件.ppt

1、第十二章分子生物学常用技术分子生物学常用技术及其应用及其应用序言序言 21 21世纪是世纪是生命科学生命科学的世纪！的世纪！ 生物技术生物技术是当今发展最快、最活跃、是当今发展最快、最活跃、 对社会对社会与经济的发展有巨大推动力的高科技领域。其与经济的发展有巨大推动力的高科技领域。其中中基因工程基因工程和和发酵工程发酵工程是生物技术的核心。是生物技术的核心。 世界各国政府高度重视世界各国政府高度重视生物技术生物技术 我国政府将其列为信息通讯、航天、新能源、我国政府将其列为信息通讯、航天、新能源、 新材料等高科技领域的新材料等高科技领域的第二位第二位。可见其战略地位。可见其战略地位。 生物技术生

2、物技术正在改变人们的生活和观念正在改变人们的生活和观念 随着随着基因组计划基因组计划的接近完成及的接近完成及后基因组计划后基因组计划的的开展，借助计算机处理复杂信息的强大能力，开展，借助计算机处理复杂信息的强大能力，2121世世纪的纪的生物技术生物技术将会有更大发展，有些领域甚至可能将会有更大发展，有些领域甚至可能有重大突破。有重大突破。第一节第一节 自然界的基因转移和重组自然界的基因转移和重组一、接合一、接合二、转化二、转化三、转导三、转导四、转座四、转座质粒质粒DNA从一个细胞转移至另一细胞从一个细胞转移至另一细胞 通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞获得

3、新的遗传表型，使细胞获得新的遗传表型 病毒把某一细胞的病毒把某一细胞的DNA带至另一细胞，带至另一细胞，使后者获得新的遗传表型使后者获得新的遗传表型DNA片段从染色体的某处移位到另一处。片段从染色体的某处移位到另一处。 重组的类型：重组的类型：1. 位点特异性重组位点特异性重组(site-specific recombination)2. 同源重组同源重组（homologous recombination）四、基因四、基因重组重组(recombinant)不同不同DNA分子间发生的共价连接分子间发生的共价连接 同源区同源区AaBbBAabBAbaBaAbBb 机制机制1. 同源重组同源重组（h

4、omologous recombination）aA功能功能1. 在在减数分裂减数分裂过程中，同源染色体之间过程中，同源染色体之间进行交换，形成生物个（群）体的进行交换，形成生物个（群）体的多样性多样性。2. 是是DNA损伤修复损伤修复的重要机制之一。的重要机制之一。2. 2. 位点特异性的基因重组位点特异性的基因重组 由整合酶催化，由整合酶催化，重组仅在特定的基重组仅在特定的基因片段和位点上进行。因片段和位点上进行。 是是免疫球蛋白免疫球蛋白多样性的分子机制多样性的分子机制。第二节基因工程的工具工具酶和载体一、一、 常用的工具酶常用的工具酶 ( (一一) )限制性内切酶限制性内切酶( (re

5、striction endonuclease) - -切切基因工程的基因工程的手术刀手术刀功能：功能： 识别识别双链双链DNADNA中特异序列，该序列的特征为中特异序列，该序列的特征为4-64-6个核苷酸的个核苷酸的回文结构回文结构，并在识别序列内或附，并在识别序列内或附近近特异切割特异切割DNADNA，产生，产生粘性末端粘性末端或或平末端平末端。 根据需要在特定的位点精确切割根据需要在特定的位点精确切割双链双链DNADNA分子分子 没有没有限制性内切酶限制性内切酶的发现和应用，就的发现和应用，就很难有今天分子生物学与基因工程的快很难有今天分子生物学与基因工程的快速发展。速发展。 作用模式图：

6、作用模式图：1. 1. 产生产生55突出突出粘性末端粘性末端( (sticky end) )EcoR I*GAATTC*CTTAAG*55335533*G*C T T A A 55333355OHP A A T T C* G*55333355P OH 作用模式图：作用模式图：2. 2. 产生产生33突出突出粘性末端粘性末端Pst I*CTGCAG*GACGTC*5533553355333355OHP*C T G C A*G55333355OHPA C G T C* * * * * * * * * * * *G* * * * * * * * * * * * 作用模式图：作用模式图：3. 3. 产

7、生产生平末端平末端( (blunt end) )Alu I*AGCT*TCGA*5533553355333355OHP*AG*TC55333355 OHPCT*GA*限制性内切酶限制性内切酶用途：用途： 1.1.基因重组过程中切割基因重组过程中切割DNADNA以获取目的基以获取目的基 因片段，切割载体形成切口，使目的因片段，切割载体形成切口，使目的基因能插入载体中。基因能插入载体中。2.2.限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphysms, RFLP) )分析：遗传病的诊断，法医分析：遗传病的诊断，法医 DNA指纹分析

8、等。指纹分析等。3.3.构建构建DNADNA的物理图谱，基因定位，的物理图谱，基因定位，DNADNA的的 同源性分析等等。同源性分析等等。(二)DNA连接酶(DNA ligase) 基因工程的缝纫针 将两条双链DNA片段连接起来，实现 DNA的体外重组体外重组。功能：功能： 催化两条双链双链DNA分子的互补粘性末互补粘性末端端或平末端平末端的5磷酸磷酸基团与3羟基羟基形成磷磷酸酯键酸酯键。 也可将双链也可将双链DNA分子内部分子内部的单个切的单个切口口(无核苷酸空缺无核苷酸空缺)连接起来。还可作用连接起来。还可作用于于RNA，但效率很低。，但效率很低。 如需连接如需连接单链单链DNA或或RNA

9、，则需用，则需用RNA连接酶连接酶。DNA连接酶催化连接酶催化平末端平末端连接要比连接要比粘性末粘性末端端 效率低得多。效率低得多。DNA连接酶 EcoR I*GAATTC*CTTAAG*5353*G*C T T A A 5335OHPA A T T C* G*5335 P OHDNA连接酶连接酶作用模式图：作用模式图：1. 连接粘性末端粘性末端 作用模式图：作用模式图： 2. 连接平末端平末端Alu I*AGCT*TCGA*5353OHP5335 *TC *AG5335 OHPCT*GA*DNA连接酶连接酶(三三) 反转录酶反转录酶(Reverse Transcriptase) 功能：功能：

10、 以以RNA为模板，以带为模板，以带3-OH末端的末端的DNA片段为片段为引物引物， 沿沿5至至3方向合成方向合成DNA链链。3AAAAAAUCUGUCCUA5dNTPMg2+反转录酶反转录酶3AAAAAAUCUGUCCUA55TTTTTTTOH 3AGACAGGAT31. RNA指导的指导的DNA聚合酶活性聚合酶活性：5TTTTTTT 2. DNA指导的指导的DNA聚合酶活性聚合酶活性；核糖核；核糖核酸酶酸酶H活性；活性；DNA解旋酶活性等。解旋酶活性等。用途：用途：1. 反转录酶的最主要作用是以反转录酶的最主要作用是以mRNA为模板合成为模板合成互补互补DNA(complementary

11、DNA，cDNA)。2. 以单链以单链DNA或或RNA为模板制备为模板制备探针探针。功能：功能：( (四四) ) 核酸酶核酸酶S1S1 功能：功能： 水解水解双链双链DNA、RNA或或DNA-RNA杂交体中的杂交体中的单链部分单链部分。核酸酶核酸酶S1S1核酸酶核酸酶S1S1+ +核酸酶核酸酶S1S1(四)核酸酶S1 用途：用途：1. 除去除去双链双链DNA的的粘性末端粘性末端以产生以产生 平末端平末端；2. 除去除去cDNA合成时形成的合成时形成的发夹结构发夹结构；3. 分析分析RNA的茎环结构以及的茎环结构以及DNA- RNA分子的杂交情况等。分子的杂交情况等。 功能：功能： 催化催化脱氧

12、脱氧核糖核苷酸转移到核糖核苷酸转移到单链单链或或双链双链DNA分子的分子的3-OH末端上。末端上。1. 底物是底物是单链单链DNA或有或有3突出末端突出末端的的 双链双链 DNA。OH53Mg2+dNTP53(A、G、C、T)nnppi53OHMg2+dNTPnppi53(A、G、C、T)n 2.底物是底物是平端平端或或3 凹端凹端的双链的双链DNA。53Co2+dNTP53(A、G、C、T)nnppi53Co2+dNTPnppi53OHOH(A、G、C、T)n 用途：用途： 1. 主要作用是在载体或目的基因主要作用是在载体或目的基因 3末末端加上同源端加上同源多聚尾巴多聚尾巴，形成，形成人工

13、粘性人工粘性末端末端，便于，便于DNA重组。重组。2. DNA 3末端的末端的同位素标记同位素标记。(六) 核糖核酸酶H 水解水解DNA-RNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链。链。RNADNA核糖核酸酶核糖核酸酶HDNA用途：用途：功能：功能： 用用核糖核酸酶核糖核酸酶H部分部分水解水解mRNA-cDNA杂交分子中的杂交分子中的mRNA，使未，使未被水解的被水解的mRNA作为作为引物引物合成合成cDNA的第二链。的第二链。二、载体二、载体(vector) *目的基因目的基因进入进入原核或真核细胞并高效原核或真核细胞并高效复制复制 和和表达蛋白质表达蛋白质，需要装入，需要装入载体载体才能实现。

14、才能实现。* 作为基因工程载体所需具备的作为基因工程载体所需具备的基本条件基本条件：1. 能能自我复制自我复制，并具一定的拷贝数。，并具一定的拷贝数。2. 带有带有抗性基因抗性基因，便于筛选和鉴定。，便于筛选和鉴定。4. 带有带有强启动子强启动子，驱动目的基因在宿主，驱动目的基因在宿主 细胞内高效表达。细胞内高效表达。3. 在适当的位置有在适当的位置有单酶切位点单酶切位点，便于重，便于重 组操作。组操作。 1. 细菌质粒细菌质粒：最常用的用于目的基因克隆克隆或 表达表达的载体。2. 噬菌体噬菌体： 主要用于构建构建基因组DNA或 cDNA文库文库。3. M13噬菌体噬菌体：专用于Sanger双

15、脱氧DNA 测序测序4. 粘粒粘粒：用于克隆大片段克隆大片段DNA。5. 酵母质粒酵母质粒：用于在酵母酵母中表达目的蛋白。6. 病毒病毒：包括人或哺乳动物病毒、昆虫病毒及植物病毒。用于在真核细胞真核细胞中表达目的蛋白。基因工程载体的基因工程载体的种类种类和和用途：用途：(一) 质粒(plasmid) 细菌培养质粒扩增并表达蛋白质大肠杆菌染色质质粒定义定义:细菌染色质以外的双链环状DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。 AmprORITetrpBR322质粒质粒：一种克隆质粒ORI：复制起始点，保证高拷贝自我复制。结构：结构：Ampr, Tetr：两个抗性基因用于筛选阳性克隆。Pst I,

16、BamH I：两个单酶切位点用于插入目的基因 AmprLacZMCSpfxBlue: 克隆质粒MCS：Multiple Clonning Site提供多个单酶切位点用于克隆操作LacZ: 蓝白斑筛选阳性克隆 P(LacZ)MCSAmprLacZpRS426：原核细胞表达质粒P(LacZ)： LacZ启动子用于在原核细胞驱动目的基因的表达。 pcDNA3：真核细胞表达质粒Pcmv：CMV增强子/启动子 驱动目的基因在真核真核细胞细胞内表达BGH pA：加尾信号 目的基因转录后加上polyA尾尾，使其更稳定稳定。(二) 噬菌体(phage) 1. 噬菌体(phage)2. 粘粒(cosmid)3.

17、 M13噬菌体1. 噬菌体 A WB DEF Z J att xis N cl cro O P Q SR 结构区 重组区重组区调控区裂解区cos位点位点 cos 位点位点ARAREcoRI目的基因EcoRIEcoRI插入型置换型筛选标记：筛选标记： 蓝白斑蓝白斑(LacZ)、噬菌斑噬菌斑等等。(1) 重组噬菌体重组噬菌体的分子量必须在的分子量必须在野生型噬野生型噬 菌体菌体 分子量大小的分子量大小的75%至至105%之间。之间。用途：用途：b.用于构建基因组或用于构建基因组或cDNA文库。文库。c.用于抗体库或随机肽库的构建。用于抗体库或随机肽库的构建。a.用作一般的克隆载体。用作一般的克隆载

18、体。2. 粘粒粘粒(cosmid) 组成：组成：2. 抗性基因；抗性基因；1. 质粒复制的起始位点质粒复制的起始位点(ORI)；3. 用于插入目的基因的单个酶切位点；用于插入目的基因的单个酶切位点；4. 噬菌体的噬菌体的cos位点位点。 可见，可见，cosmid是由质粒和是由质粒和 噬菌体的噬菌体的cos位点位点构建而成。构建而成。 特点：特点：1. 可插入长达可插入长达2741kb的外源基因，的外源基因，方便地用于方便地用于克隆大片段克隆大片段DNA。2. 加入加入 噬菌体噬菌体头部和尾部蛋白，可将头部和尾部蛋白，可将 粘粒包装成类似于粘粒包装成类似于 噬菌体噬菌体的具感染的具感染能力的颗粒

19、，方便地进入大肠杆菌。能力的颗粒，方便地进入大肠杆菌。3. 粘粒进入细菌后则完全失去粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体噬菌体 的功能，而表现的功能，而表现质粒质粒的特性。的特性。3. M13噬菌体噬菌体 噬菌体噬菌体正链正链复制复制复制型复制型DNA经经pII蛋白蛋白造缺口造缺口35经经pII蛋白蛋白剪切剪切释出单链释出单链DNA(正链正链)进入下进入下一循环一循环5335滚环复制滚环复制在细菌内的复制模式图在细菌内的复制模式图 M13噬菌体几个重要特点噬菌体几个重要特点：1. M13噬菌体噬菌体不溶解不溶解宿主细胞，只是宿主细胞，只是降降 低低宿主细胞的生长速度。宿主细胞的生长速度。2. M13

20、噬菌体能以噬菌体能以单链单链和和双链双链两种方式两种方式存在，因此可以用存在，因此可以用感染感染(经包装的单经包装的单链链DNA)和和转化转化(双链双链DNA)。3. 克隆的外源基因片段不宜大于克隆的外源基因片段不宜大于1000bp。 M13噬菌体用途噬菌体用途：1. DNA序列测定；序列测定；2. 制备单链制备单链DNA探针；探针；3. 用于定点突变的研究。用于定点突变的研究。第三节基因工程的步骤基因工程的基本步骤1.基因工程的上游技术上游技术：基因重组基因重组+连接转化、筛选和鉴定阳性克隆含重组子的阳性克隆载体目的基因分、切、接、转、筛2. 基因工程的下下游技术游技术：(1) 发酵工程(2

21、) 蛋白质的分离、纯化与质量鉴定 发酵条件(生物反应器结构、细菌培养温度、空气通量、pH及培养基成分等)的优化组合。基因工程的基本步骤一、一、 目的基因的制备目的基因的制备分分 (一一) 人工合成法人工合成法(也即化学合成法也即化学合成法) 本方法适用于本方法适用于分子量较小分子量较小的目的的目的基因基因 (100bp以内以内)。缺点：缺点： 2. 如目的基因如目的基因DNA序列需序列需通过氨基酸序通过氨基酸序 列推测列推测，难于保证与，难于保证与天然基因天然基因序列一序列一 致，往往导致致，往往导致表达效率大大降低表达效率大大降低。1. 只能合成较小片段的只能合成较小片段的DNA(100bp

22、以以内内)。 ( (二二) )反转录法反转录法 本法是本法是应用得最多应用得最多的获取目的获取目的基因的方法。但的基因的方法。但前提前提是目的基因是目的基因的序列已知，至少部分已知。的序列已知，至少部分已知。 (二)反转录法：方案：AAnATTnT 55mRNA 反转录酶mRNAcDNA3TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3DNA poly IcDNA核酸酶S1双链cDNA35 35 5加热变性加入特异性引物DNA聚合酶重复上述步骤扩增出大量的产物聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction，PCR) (三三)直接从直接从染色体染色体DNA中分离中分离+ 本方法较适用于制

23、备本方法较适用于制备原核生物原核生物目的基目的基因，因，其原因为：其原因为： 1. 真核细胞染色体真核细胞染色体DNA有丰富的有丰富的内含内含 子子，在原核细胞中转录后不能剪接。，在原核细胞中转录后不能剪接。 2. 真核细胞的基因多数为真核细胞的基因多数为单拷贝单拷贝，难，难 于分离到足够的目的基因。于分离到足够的目的基因。 根据染色体根据染色体DNA的的限制性内切酶图限制性内切酶图谱谱，用合适的限制性内切酶切割染色体，用合适的限制性内切酶切割染色体DNA，分离，分离目的基因目的基因。 (四四) 从从基因文库基因文库(gene library)中获取中获取基因组文库：基因组文库：G-文库文库c

24、DNA文库：文库： c-文库文库 (常用常用)方法：方法：基因文库基因文库 用目的基因上的一段用目的基因上的一段DNA做成做成探针探针与文库中的与文库中的DNA作作核酸杂交核酸杂交，从基因，从基因文库中文库中“钓出钓出”有目的基有目的基因的克隆。因的克隆。(一)粘性末端连接用同一种或两种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因二、构建DNA重组体-接本法适用于在质粒和目的基因上有相同单或双酶切位点(二)平末端连接 质粒产生平末端的内切酶DNA连接酶产生粘性末端的内切酶核酸酶S1目的基因重组质粒产生粘性末端的内切酶核酸酶S1 本法适用于在质粒和目的基因上没有相没有相同同的酶切位点！(三)

25、用接头连接 用同一种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因+DNA连接酶接头(linker) 本法适用于在质粒和目的基因上没有相没有相同同的酶切位点！(四)尾接法 DNA连接酶重组质粒质粒目的基因内切酶末端转移酶 +dGTP末端转移酶 +dCTP 本法适用于在质粒和目的基因上没有相没有相同同的酶切位点三、将重组体三、将重组体(子子)导入宿主细胞导入宿主细胞-转转 1. 重组质粒重组质粒的导入方法的导入方法大肠杆菌大肠杆菌CaCl204感受态细胞感受态细胞重组质粒重组质粒 转化转化transformation含含重组质粒重组质粒的大肠杆菌的大肠杆菌三、将重组体导入宿主细胞三、将重组体导

26、入宿主细胞2. 重组重组病毒病毒或重组或重组噬菌体噬菌体的导入方法的导入方法重组重组病毒病毒重组重组噬菌体噬菌体加入病毒的加入病毒的某些蛋白组分某些蛋白组分具有感染能力的具有感染能力的病毒病毒或或噬菌体噬菌体颗粒颗粒真核细胞真核细胞原核细胞原核细胞转染转染(transfection)四、重组体的筛选与鉴定四、重组体的筛选与鉴定-筛筛 AmprTerr1. 插入失活插入失活: 例例1 在在Tetr中插入目的基因中插入目的基因 在质粒固有在质粒固有的功能基因的功能基因内插入内插入目的目的基因基因，则该，则该基因不能表基因不能表达有功能的达有功能的蛋白质。蛋白质。 AmpTet1 2 34 5 63

27、和和5 是是阳性克隆阳性克隆1 2 34 5 6例例1：四、重组体的筛选与鉴定四、重组体的筛选与鉴定ApmrMCSLacZ1. 插入失活插入失活： 例例2 在在Laz中插入目的基因中插入目的基因 X-gal蓝色化合物蓝色化合物 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶Lac-Z基因基因例例2：蓝白斑筛选：蓝白斑筛选 2. 2. 菌落原位杂交菌落原位杂交覆盖覆盖滤膜滤膜取下沾取下沾有有菌落菌落的滤膜的滤膜 裂解、裂解、 变性、变性、固定等固定等与与探针探针杂交杂交放射性放射性自显影自显影1 2 34 5 63 3和和5 5是阳性克隆是阳性克隆 五、基因工程的下游技术五、基因工程的下游技术( (一一) ) 细菌发酵

28、细菌发酵( (二二) ) 蛋白质的分离、纯化与质量鉴定蛋白质的分离、纯化与质量鉴定 发酵条件发酵条件( (生物反应器的结构、细菌生物反应器的结构、细菌培养的温度、空气的通量、培养的温度、空气的通量、pHpH及培养基及培养基成分等成分等) )的优化组合。的优化组合。六、基因工程中几个棘手的问题六、基因工程中几个棘手的问题 1. 原核细胞的原核细胞的RNA聚合酶聚合酶不能识别不能识别 真核细胞的真核细胞的启动子启动子。2. 原核细胞原核细胞不能剪接不能剪接真核细胞真核细胞 带带内含子内含子的的mRNA。3. 原核细胞原核细胞表达出的表达出的真核细胞蛋白质真核细胞蛋白质 往往往往无活性无活性。4.

29、用用真核细胞表达系统真核细胞表达系统虽然可以表达虽然可以表达有活性有活性的蛋白质，但其的蛋白质，但其产量太低产量太低，成本成本太高太高。第四节第四节 基因工程在医学上的应用基因工程在医学上的应用 v 现代医学越来越重视现代医学越来越重视活性蛋白质活性蛋白质在预防在预防 和治疗疾病中的作用。和治疗疾病中的作用。v 基因工程基因工程可大量生产可大量生产天然稀有存在天然稀有存在的的 重要的重要的肽或蛋白质肽或蛋白质。v 基因工程基因工程可根据人的意愿设计生产出可根据人的意愿设计生产出 天然不存在的有重要生物活性的天然不存在的有重要生物活性的肽或肽或 蛋白质。蛋白质。v 人类基因组计划人类基因组计划及

30、及后基因组计划后基因组计划的成果的成果 将为将为基因工程基因工程提供难于估量的广阔发展提供难于估量的广阔发展 空间。空间。 一、基因工程生产的药品 1.基因工程疫苗 乙肝，丙肝，爱滋病，流行性感冒，出血热，人乳头瘤病毒，巨细胞病毒等。 结核，麻风，霍乱，痢疾，肺炎等。 血吸虫，疟疾等。 各种肿瘤疫苗。 2. 人体活性因子人体活性因子 干扰素干扰素(IFN)： 白细胞介素白细胞介素(IL)： 生长因子：生长因子： 集落刺激集落刺激 因子因子(CSF)：IFN- ，IFN- ，IFN- 。IL-1，2，313。 神经生长因子，表皮生长神经生长因子，表皮生长因子，成纤维细胞生长因因子，成纤维细胞生长

31、因子等。子等。干细胞干细胞-CSF，粒细胞，粒细胞-CSF，粒细胞粒细胞-巨噬细胞巨噬细胞-CSF。 2. 人体活性因子人体活性因子 红细胞生成素红细胞生成素(EPO)，超氧化物歧，超氧化物歧化酶化酶(SOD)，组织纤溶酶原激活物，组织纤溶酶原激活物(tPA)等。等。v 激素激素v 治疗心血管及血液病的活性肽治疗心血管及血液病的活性肽胰岛素，生长激素，生长抑制激素等。胰岛素，生长激素，生长抑制激素等。 v 主要发展趋势主要发展趋势 完善现有的原核和真核细胞表达体系完善现有的原核和真核细胞表达体系 建立新的表达体系建立新的表达体系 改进和发展大规模改进和发展大规模动动、植物细胞植物细胞培培养技术

32、养技术q 应用应用转基因转基因动、植物作为动、植物作为生物反应器生物反应器高产量、高质量、低成本生产名贵生物高产量、高质量、低成本生产名贵生物药物。药物。 二、二、 基因诊断基因诊断 q 基因诊断的基因诊断的概念概念q 基因诊断所应用的基因诊断所应用的主要技术主要技术 聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR) 将将痕量的难于检测到的特定的痕量的难于检测到的特定的基因片段基因片段成成百万地百万地特异地扩增特异地扩增。 核酸探针技术核酸探针技术 用已知的与疾病相关或特异的核酸片段用已知的与疾病相关或特异的核酸片段(探针探针)与待测与待测样品样品作核酸作核酸杂交杂交，检测，检测样品样品是否是否有该特征性有

33、该特征性DNA片段以及量的多少。片段以及量的多少。 Southern Blot: 印迹印迹DNA Northern Blot: 印迹印迹RNA 原位杂交技术原位杂交技术 寡核苷酸探针技术寡核苷酸探针技术 RT-PCR PCR-单链构象多态分析单链构象多态分析(PCR-SSCP)核酸探针技术核酸探针技术q 基因诊断的基因诊断的疾病谱：疾病谱： 遗传性疾病，感染性疾病，心血管遗传性疾病，感染性疾病，心血管疾病，肿瘤，疾病，肿瘤，.q 发现并获得某种疾病的发现并获得某种疾病的特异性特异性基因基因是是基因诊断的基础。基因诊断的基础。 人类基因组计划，后基因组计划，人类基因组计划，后基因组计划，特别是特

34、别是疾病基因组计划疾病基因组计划将极大地推将极大地推动这一进程。动这一进程。三、基因治疗三、基因治疗(gene therapy) v 基因治疗的基因治疗的策略策略1.1.基因置换基因置换：以：以正常正常基因基因替换替换缺陷缺陷基因。基因。 一切通过基因水平的操作而达到，一切通过基因水平的操作而达到， 治疗疾病目的疗法。治疗疾病目的疗法。2.2.基因补偿基因补偿：导入正常基因，：导入正常基因，补偿补偿缺缺 陷陷基因的功能。基因的功能。3.3.基因失活：基因失活：用用反义核酸反义核酸封闭封闭有害基有害基因因的表达。的表达。v 定义：定义： 4. 免疫免疫基因治疗基因治疗：将将免疫增强因子基因免疫增

35、强因子基因(如如MHC，IL)导入肿瘤细胞，提高其免疫原导入肿瘤细胞，提高其免疫原性。性。 5. 活化前体药物活化前体药物基因治疗：基因治疗： 向肿瘤细胞导入一种基因，该基因产物为向肿瘤细胞导入一种基因，该基因产物为一种酶一种酶，它可将，它可将无细胞毒的药物前体无细胞毒的药物前体转化为转化为有有毒性的药物毒性的药物，从而将细胞杀死，也称，从而将细胞杀死，也称自杀基因自杀基因治疗治疗。 6. 耐药耐药基因治疗：基因治疗： 将将抗药物毒性的基因抗药物毒性的基因导入对化疗药物敏感导入对化疗药物敏感的组织细胞的组织细胞(如骨髓干细胞如骨髓干细胞)，提高其对药物的，提高其对药物的耐受性耐受性。 1. 1. 目的基因的目的基因的表达水平表达水平太低或难于太低或难于精确控制。精确控制。2. 2. 目的基因的目的基因的转移转移和和表达表达缺乏足够的缺乏足够的 靶向性。靶向性。3. 3. 对基因对基因表达调控表达调控、基因表达、基因表达产物产物的功能的功能的认识还很少、很肤浅。的认识还很少、很肤浅。目前基因治疗面临的目前基因治疗面临的问题问题