蛋白质芯片研究进展课件.ppt

1、蛋白质芯片蛋白质芯片马晶 DNA DAY 2010-06-30内容提要内容提要蛋白质芯片概述蛋白质芯片概述蛋白质芯片的关键技术蛋白质芯片的关键技术蛋白质芯片的应用蛋白质芯片的应用展望展望Gel electrophoresis, northern/western blot (fluorescence/radio active label)X-ray crystallography 2D - mass spectrometryProtein microarraysSELDI MS protein chipsMethods for Protein Analysis蛋白质芯片的定义蛋白质芯片的定义生生

2、物物芯芯片片基因芯片基因芯片蛋白质芯片蛋白质芯片微流控芯片微流控芯片蛋白质芯片蛋白质芯片, 又称又称蛋白质阵列蛋白质阵列或或蛋白质微阵列蛋白质微阵列，是指以蛋白质，是指以蛋白质分子作为配基分子作为配基,将其有序地固定将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其他它用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。的相互作用关系。

3、蛋白质检测芯片蛋白质检测芯片蛋白质功能芯片蛋白质功能芯片 蛋白质芯片的分类蛋白质芯片的分类蛋白质芯片的关键技术蛋白质芯片的关键技术提出生物学问题提出生物学问题（实验目的）（实验目的）样品预处理样品预处理（重组蛋白，制备一、二级抗体，重组蛋白，制备一、二级抗体，荧光标记，配蛋白印记缓冲液）荧光标记，配蛋白印记缓冲液）生化反应生化反应化学偶合，加底物，化学偶合，加底物，反应温度和时间，反应温度和时间，冲洗条件冲洗条件检测检测（荧光和比色扫描或拍照，（荧光和比色扫描或拍照，参数设置）参数设置）数据分析和建模数据分析和建模（图象量化，标准化，图象量化，标准化，采集蛋白信息，建立模型）采集蛋白信息，建立

4、模型）1 12 23 34 45 5蛋白质芯片制备蛋白质芯片制备6 6蛋白质芯片的制备蛋白质芯片的制备1.固相载体及其处理固相载体及其处理 载体（滴定板、滤膜、凝胶、载载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片）玻片） 2.蛋白质的预处理蛋白质的预处理 选择具有较高纯度和完好生物活选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解性的蛋白进行溶解3.点制微阵列点制微阵列 可使用点制基因微阵列的商品化可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等点样仪或喷墨法等4.固定微阵列上的蛋固定微阵列上的蛋白样点白样点 膜为载体：芯片放入湿盒，膜为载体：芯片放入湿盒， 37C 1h 载玻片为载体：化学修饰产生醛载玻片为载体

5、：化学修饰产生醛 基固定蛋白基固定蛋白5.微阵列的封闭微阵列的封闭主要封闭试剂：主要封闭试剂：BSA或或Gly蛋白质芯片比较蛋白质芯片比较 表面表面 蛋白固定方式蛋白固定方式 优点优点 缺点缺点 PVDF 吸附吸附 无需蛋白修饰过程，高结合容量无需蛋白修饰过程，高结合容量 非特异吸附，分布随机非特异吸附，分布随机Nitrocellulose 吸附吸附 无需蛋白修饰过程，高结合容量无需蛋白修饰过程，高结合容量 非特异吸附，高背景，低密度非特异吸附，高背景，低密度 无需蛋白修饰过程，高密度，无需蛋白修饰过程，高密度， 非特异吸附，分布随机非特异吸附，分布随机 高分辨检测高分辨检测Epoxy-act

6、ivated 高密度，高分辨检测高密度，高分辨检测 分布随机，表面有吸附分布随机，表面有吸附PDMS nanowell 高密度，适合复杂的生化分析高密度，适合复杂的生化分析 Gold coated silicon 高密度，低背景，高密度，低背景，易与易与SPR或或MS 联用联用 分布随机，制作难，未商品分布随机，制作难，未商品化化Avidin coated 亲和结合亲和结合 蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白需生物素化蛋白需生物素化 Ni-NTA coated 亲和结合亲和结合 蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景

7、 蛋白需蛋白需His x6标记标记 表面蛋白分布均一容量表面蛋白分布均一容量Agarose thin film 制作难，未商品化制作难，未商品化3D gel pad吸附，共吸附，共价偶联价偶联Poly-lysine coatedAldehyde-coated共价共价偶联偶联扩散扩散 无需蛋白修饰过程，高结合容量无需蛋白修饰过程，高结合容量 蛋白质芯片的应用蛋白质芯片的应用u疾病诊断和预警疾病诊断和预警u药物开发药物开发 u蛋白质组学蛋白质组学 定量检测组织提取液中的肿瘤标记物定量检测组织提取液中的肿瘤标记物孵育后的微阵列荧光图孵育后的微阵列荧光图 A 含抗原含抗原 B 无抗原无抗原微阵列方法与

8、微阵列方法与ELISA方法检出结果比较方法检出结果比较疾病诊断疾病诊断uPA 尿激酶型纤溶酶原激活因子尿激酶型纤溶酶原激活因子PAI-1血浆纤溶酶原激活因子抑制因子血浆纤溶酶原激活因子抑制因子VEGT 血管内皮生长因子血管内皮生长因子高通量筛选蛋白高通量筛选蛋白-蛋白作用抑制剂蛋白作用抑制剂药物开发药物开发Jung SO, et al., Proteomics 2005, 5, 44274431.A 1500 个点阵的微阵列个点阵的微阵列B 局部点阵放大图及局部点阵放大图及SPR信号信号His6-RB/GST-E7相互作用抑相互作用抑制剂筛选微阵列图制剂筛选微阵列图加入加入His6-RB加入含

9、加入含 PepC抑制剂的抑制剂的His6-RB 人动脉平滑肌细胞蛋白谱人动脉平滑肌细胞蛋白谱蛋白质组学蛋白质组学揭示了揭示了oxidized low density lipoprotein诱导人动脉平滑肌细胞的作用模式诱导人动脉平滑肌细胞的作用模式细胞经细胞经oxidized low density lipoprotein作用后的蛋白谱作用后的蛋白谱检出检出298个蛋白个蛋白54个蛋白表达量发生变化个蛋白表达量发生变化4.7% 抗原（一组细胞抗原（一组细胞-细胞间相细胞间相互作用分子）表达上调；互作用分子）表达上调；13.4%抗原抗原（结构蛋白，体液响结构蛋白，体液响应蛋白）表达下降应蛋白）表

10、达下降存在的问题存在的问题n成本过高成本过高, 需一系列昂贵的尖端仪器需一系列昂贵的尖端仪器n芯片的标准化问题芯片的标准化问题 n提高芯片的特异性、简化样品制备和标记提高芯片的特异性、简化样品制备和标记操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除芯片背景对于结果分析的影响等等芯片背景对于结果分析的影响等等展望展望蛋白质芯片未来的发展重点蛋白质芯片未来的发展重点 l 建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法，建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法，高通量制备抗体并定义每种抗体的亲和特异性。高通量制备抗体并定义每种抗体的亲和特异性。 l 改进基质材料的表面处理技术以减少蛋白质的非特异改进基质材料的表面处理技术以减少蛋白质的非特异性结合。性结合。l 提高芯片制作的点阵速度；提供合适的温度和湿度以提高芯片制作的点阵速度；提供合适的温度和湿度以保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。l 研究通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像研究通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像与数据分析一体化。与数据分析一体化。 Thank you ！