(第二章)药物分析-光谱分析法的应用课件.ppt

1、*光谱分析法：光谱分析法：利用各种化学物质所具有的利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散发射、吸收或散射光谱系射光谱系的特征来确定物质的特征来确定物质性质、结构或含量性质、结构或含量的方法。的方法。第二章第二章 光谱分析法的应用光谱分析法的应用吸收光谱分析吸收光谱分析发射光谱分析发射光谱分析散射光谱分析散射光谱分析光谱分析光谱分析可见分光光度法可见分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法红外分光光度法红外分光光度法原子吸收光谱法原子吸收光谱法荧光分析法荧光分析法火焰光度法火焰光度法比浊法比浊法光是电磁波，其能量（辐射能）可以用波长来表示光是电磁波，其能量（辐射能）可以用波长来表示第二章第二章 光

2、谱分析法的应用光谱分析法的应用物质吸收可见光和紫外光则物质吸收可见光和紫外光则引起价电子跃迁引起价电子跃迁物质吸收红外光则物质吸收红外光则引起分子振动引起分子振动紫外光谱又称为电子光谱，红外光谱又称为分子振动光谱紫外光谱又称为电子光谱，红外光谱又称为分子振动光谱*分子吸收光谱分子吸收光谱：当光通过固体、液体或气体的透明层时，分：当光通过固体、液体或气体的透明层时，分子可以选择性地吸收一定波长的光，透过的光谱中就不出现子可以选择性地吸收一定波长的光，透过的光谱中就不出现这些波长的光，这种光谱称为吸收光谱。这些波长的光，这种光谱称为吸收光谱。紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法第一节第一节

3、可见可见紫外分光光度法的应用紫外分光光度法的应用 吸收光谱的吸收强度在实验上可用吸收光谱的吸收强度在实验上可用朗伯朗伯-比尔（比尔（Lambert-Beer）定律来描述。这条定律是吸收光的基本定律，也是吸）定律来描述。这条定律是吸收光的基本定律，也是吸收光谱测量的理论基础。收光谱测量的理论基础。 当一束单色光通过溶液时，由于溶液吸收了一部分光能，当一束单色光通过溶液时，由于溶液吸收了一部分光能，光的强度就要降低，溶液的浓度越大，液层的厚度越大，吸光的强度就要降低，溶液的浓度越大，液层的厚度越大，吸收的光能越多，光强度减弱也越显著，可用下式来表示：收的光能越多，光强度减弱也越显著，可用下式来表示

4、：第二章第二章 光谱分析法的应用光谱分析法的应用紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法吸收度与溶液的浓度及液层的厚度成正比；吸收度与溶液的浓度及液层的厚度成正比；*吸收系数（吸收系数（Absorptivity）：单位浓度、单位液层厚度的吸收度。）：单位浓度、单位液层厚度的吸收度。紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法摩尔摩尔吸收系数吸收系数：指指1升溶液中含有升溶液中含有1摩尔溶质，液层厚度为摩尔溶质，液层厚度为l cm时，时，在指定波长和一定条件（溶剂、在指定波长和一定条件（溶剂、pH、温度）下的吸收度，用、温度）下的吸收度，用表表示，单位是克分子示，单位是克分子-1厘米厘米-1。百

5、分吸收系数：百分吸收系数：指指100 m1溶液中含有溶液中含有1 g溶质，液层厚度溶质，液层厚度1 cm时，时，在指定波长和一定条件下所测得的吸收度，用在指定波长和一定条件下所测得的吸收度，用 或或 表示，表示，单位是克单位是克-1厘米厘米-1。摩尔吸收系数与百分吸收系数的相互关系为：摩尔吸收系数与百分吸收系数的相互关系为： %11cmA%11cmE101%11MEcmM：吸光物质的分子量（摩尔质量）。：吸光物质的分子量（摩尔质量）。紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法物质的吸收系数与溶剂的种类、溶液的物质的吸收系数与溶剂的种类、溶液的pH、温度以及波长有关，、温度以及波长有关，测定时必

6、需注意，测定时必需注意，表示吸收系数时这些条件应注明。表示吸收系数时这些条件应注明。测定吸收系数时，将仪器的波长调至最大吸收波长（测定吸收系数时，将仪器的波长调至最大吸收波长（max）处。）处。 紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法一、分析测定方法一、分析测定方法1吸收系数法吸收系数法在无标准品的情况下，利用在无标准品的情况下，利用 或或 进行定量。进行定量。从有关手册或药典中查得化合物的吸收系数，然后采用与标从有关手册或药典中查得化合物的吸收系数，然后采用与标准品相同的溶剂，配制样品溶液，在相同波长下测定准品相同的溶剂，配制样品溶液，在相同波长下测定A值，值，按下式计算百分含量：按下式

7、计算百分含量： %11cmE%100)()(%11%11样品标样cmcmEELCEAcm%11LEACcm%11在有标准品的情况下：在有标准品的情况下：紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法2. 标准曲线法标准曲线法（常用）（常用）从待测物质的吸收光谱图上选定某一从待测物质的吸收光谱图上选定某一最大吸收波长，用一系列不同浓度的最大吸收波长，用一系列不同浓度的标准溶液在该波长处分别测定它们的标准溶液在该波长处分别测定它们的吸收度。用吸收度对浓度作图，吸收度。用吸收度对浓度作图，得得标标准曲线。在同样条件下测定样品溶液准曲线。在同样条件下测定样品溶液的吸收度，由标准曲线上可求出样品的吸收度，由

8、标准曲线上可求出样品溶液的浓度。溶液的浓度。总黄酮标准曲线00.10.20.30.40.50.600.20.40.60.8对照品溶液浓度吸光度 Absorbance紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法3. 直接比较法直接比较法（单点校正）（单点校正）凡溶液中待测物质吸收符合吸收定律，则配制一种浓度的标凡溶液中待测物质吸收符合吸收定律，则配制一种浓度的标准溶液，测其吸收度，再在同样条件下测样品溶液的吸收度，准溶液，测其吸收度，再在同样条件下测样品溶液的吸收度，根据下列公式求出样品溶液的浓度。根据下列公式求出样品溶液的浓度。标样标样CCAA样标样标AACC A标标为标准溶液吸收度为标准溶液吸

9、收度 C标标为标准溶液浓度为标准溶液浓度A样样为样品溶液吸收度为样品溶液吸收度 C样样为样品溶液浓度为样品溶液浓度紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法4联立方程法联立方程法若待测样品为两种以上不起化学反应的吸收物质，如其吸收光谱并不若待测样品为两种以上不起化学反应的吸收物质，如其吸收光谱并不互相重叠，可按单位组分分析方法，分别在各组分的最大吸收波长处互相重叠，可按单位组分分析方法，分别在各组分的最大吸收波长处测定，如其吸收光谱互相重叠，根据吸收度的加和性原则，混合物的测定，如其吸收光谱互相重叠，根据吸收度的加和性原则，混合物的吸收度为各组分吸收度之和，可在各组分的最大吸收波长处，分别测吸

10、收度为各组分吸收度之和，可在各组分的最大吸收波长处，分别测混合物吸收度，通过解联立方程的方法求得结果，如下式：混合物吸收度，通过解联立方程的方法求得结果，如下式： 1221紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法靛蓝和靛玉红的吸收光谱靛蓝和靛玉红的吸收光谱 靛蓝在靛蓝在608 nm处、靛玉红在处、靛玉红在544 nm处有最大吸收。处有最大吸收。根据根据Lambert-beer定律定律A=EC分别计算出分别计算出4个比吸光系数。个比吸光系数。当波长为当波长为608 nm时，时，E608靛蓝靛蓝34.6，E608靛玉红靛玉红6.9；当波长为当波长为544 nm时，时，E544靛蓝靛蓝19.6，E

11、544靛玉红靛玉红44.6。 当溶液为当溶液为2种物质的混合溶液时：种物质的混合溶液时：A608E608靛蓝靛蓝C靛蓝靛蓝+ E608靛玉红靛玉红C靛玉红靛玉红A544E544靛蓝靛蓝C靛蓝靛蓝+ E544靛玉红靛玉红C靛玉红靛玉红 推导出：推导出： C靛蓝靛蓝1.5410-3A6081.8710-4A544 C靛玉红靛玉红3.6510-3A5449.4110-4A6085双波长分光光度法双波长分光光度法假设假设a为干扰组分，为干扰组分，b 为被测组分，为被测组分，虚线则代表吸光度上反映的值。虚线则代表吸光度上反映的值。又设在又设在1和和2处干扰组分的吸光度处干扰组分的吸光度值相等，于是值相等

12、，于是 A值反映在值反映在1和和2处处b组分的吸光度差异。组分的吸光度差异。 XYx1x2y1紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法a的曲线在波长的曲线在波长1和和2处吸收度相等，处吸收度相等，Aa0；b物质的吸收曲线在物质的吸收曲线在Al和和A2处处A值相差很大，为值相差很大，为Ab;混合物在此二波长的混合物在此二波长的A即为即为b物质的物质的Ab（ ）;b物质的含量则可用在物质的含量则可用在1及及2处测得的处测得的Ab对浓度作图所得标准对浓度作图所得标准曲线上求出。曲线上求出。 bbAAA12紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法测定步骤：测定步骤： （1） 选择双波长。选择双波长

13、。先用标准品测出两组分各自的吸收曲线，选干扰先用标准品测出两组分各自的吸收曲线，选干扰组分的吸收曲线上某对称两点（等吸收波长）的波长组分的吸收曲线上某对称两点（等吸收波长）的波长1和和2，在此二在此二波长处待测组分的吸收度应有明显差别。波长处待测组分的吸收度应有明显差别。 （2） 配制不同浓度的配制不同浓度的待测标准品待测标准品，先在，先在1处测出处测出A1，再在，再在2处测出处测出A2，求出，求出A。用各种浓度下的用各种浓度下的A对浓度对浓度C作图，绘出标准曲线。作图，绘出标准曲线。 （3）混合物中待测组分的含量测定。）混合物中待测组分的含量测定。在在1和和2处分别测得混合物的处分别测得混合

14、物的A1及及A2，求出，求出A，由标准曲线上查出浓度即为待测组分浓度。，由标准曲线上查出浓度即为待测组分浓度。 紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法可见光区的波长范围为可见光区的波长范围为400760 nm，人的视觉可以察觉，人的视觉可以察觉。 二、可见分光光度法分析二、可见分光光度法分析若两种颜色的光按其适当的强度比例混合后可若两种颜色的光按其适当的强度比例混合后可成为白色，则这两种光色被称为互补色，如绿成为白色，则这两种光色被称为互补色，如绿与紫红、黄与蓝、橙与青蓝、红与青。与紫红、黄与蓝、橙与青蓝、红与青。有色溶液呈现的不同颜色，就是由于物质对光具有色溶液呈现的不同颜色，就是由于物

15、质对光具有选择性吸收所造成的，例如高锰酸钾溶液由于有选择性吸收所造成的，例如高锰酸钾溶液由于吸收波长为吸收波长为500560 nm（绿色光）而显紫红色。（绿色光）而显紫红色。 紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法可见分光光度法就是利用有色物质吸收光能的特性来测定物质含量的可见分光光度法就是利用有色物质吸收光能的特性来测定物质含量的方法方法。药物药物内的各种有效成分或主成分内的各种有效成分或主成分，可用此方法进行分析可用此方法进行分析的条件：的条件：1. 成分成分本身有色本身有色；2. 或与一定显色试剂作用后可形成有色物质或与一定显色试剂作用后可形成有色物质；3. 并并且在一定浓度范围内，

16、溶液的吸收度与浓度符合朗伯且在一定浓度范围内，溶液的吸收度与浓度符合朗伯-比尔定律比尔定律。 紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法1. 黄酮类成分的测定黄酮类成分的测定 （1）标准曲线：）标准曲线：精密称取精密称取120下干燥至恒重的下干燥至恒重的无水芦丁无水芦丁10mg，用，用30%乙醇定容于乙醇定容于100ml容量瓶中。分别取上述溶液容量瓶中。分别取上述溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于于10ml容量瓶中，加入容量瓶中，加入0.3ml 5亚硝酸钠溶液亚硝酸钠溶液，放置，放置6min，加入加入10硝酸铝溶液硝酸铝溶液0.3ml，放置，放置 6min，再加入，再加入

17、1mol/l的氢氧化钠溶的氢氧化钠溶液液4.0ml，30%乙醇定容至刻度，乙醇定容至刻度，摇匀，放置摇匀，放置15min， 510nm处测定处测定吸光度，吸光度，绘制标准曲线。绘制标准曲线。标准曲线方程为：标准曲线方程为：Y=0.0018+1.0926X X：所测的吸光度：所测的吸光度 Y：总黄酮的浓度：总黄酮的浓度R=0.9998总黄酮标准曲线00.10.20.30.40.50.600.20.40.60.8对照品溶液浓度吸光度 Absorbance紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法 （2）测定步骤：）测定步骤：精密称取样品精密称取样品5g，提取，浓缩至近干，提取，浓缩至近干，蒸蒸馏水

18、溶解后过滤。馏水溶解后过滤。滤液用正丁醇萃取至无黄酮反应为止。减滤液用正丁醇萃取至无黄酮反应为止。减压回收正丁醇至近干，压回收正丁醇至近干，加加30乙醇溶解，乙醇溶解，过滤，移至过滤，移至50ml容量瓶中，用容量瓶中，用30乙醇定容至刻度，稀释乙醇定容至刻度，稀释25倍。精密吸取倍。精密吸取3ml于于10ml容量瓶中，按上述显色方法显色，用容量瓶中，按上述显色方法显色，用754紫外紫外可见分光光度计于可见分光光度计于510nm处测吸光度。处测吸光度。（3）样品测定）样品测定 2、环烯醚萜类（桃叶珊瑚苷）的测定、环烯醚萜类（桃叶珊瑚苷）的测定（1）标准曲线：）标准曲线：精密称取精密称取10mg标

19、准品于容量瓶中配成标准品于容量瓶中配成1mg/ml母液，母液，分别吸取分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml，加蒸馏水至，加蒸馏水至1ml，依次加，依次加入入1ml Apstahl、1ml冰醋酸冰醋酸、2ml乙醇乙醇到到5ml，80水浴中加热显色水浴中加热显色30min，中间摇动，中间摇动23次；次；取出流水冷却取出流水冷却1min，然后在，然后在601nm处处用用754型紫外型紫外-可见分光光度计测溶液可见分光光度计测溶液吸光度吸光度A；以浓度与相应的吸光度作；以浓度与相应的吸光度作标准曲线。标准曲线为：标准曲线。标准曲线为：Y=0.11605A+0.00033 R=0.

20、9976紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法 （2）测定步骤：）测定步骤：精密称取烘干样品精密称取烘干样品5g，提取、浓缩、，提取、浓缩、用蒸馏用蒸馏水定容于水定容于50ml容量瓶中，离心容量瓶中，离心5min，取上清液，取上清液1ml于于25ml容量容量瓶中稀释后，取稀释液瓶中稀释后，取稀释液1ml，依次加入，依次加入4ml乙醇、乙醇、2ml对二甲氨对二甲氨基苯甲醛试剂基苯甲醛试剂（艾氏试剂）、（艾氏试剂）、2ml冰醋酸冰醋酸，用蒸馏水定容到，用蒸馏水定容到10ml，充分摇匀；在，充分摇匀；在80水浴中加热显色水浴中加热显色30min，中间摇动，中间摇动23次；取出试管，管内溶液根据浓

21、度不同呈现不同深度的蓝次；取出试管，管内溶液根据浓度不同呈现不同深度的蓝色，流水冷却色，流水冷却1min，然后在，然后在601nm处用分光光度计测溶液吸光处用分光光度计测溶液吸光度度A；以标准曲线和校正方程计算样品中桃叶珊瑚苷含量。；以标准曲线和校正方程计算样品中桃叶珊瑚苷含量。（3）样品测定）样品测定 紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法1、显色化合物的吸收光谱、显色化合物的吸收光谱桃叶珊瑚桃叶珊瑚苷与苷与Epstahl试剂在乙试剂在乙醇和醋酸溶液中形成的有色化醇和醋酸溶液中形成的有色化合物的最大吸收波长为合物的最大吸收波长为601nm，吸收曲

22、线见图。吸收曲线见图。桃叶珊瑚苷的分光光度法测定具体步骤桃叶珊瑚苷的分光光度法测定具体步骤4005006007000.30.20.1A /nm桃叶珊瑚甙与桃叶珊瑚甙与Epstahl试试剂形成的显色化合物在乙剂形成的显色化合物在乙醇和醋酸中的吸收光谱醇和醋酸中的吸收光谱紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法2、显色剂的用量、显色剂的用量桃叶珊瑚甙含量在桃叶珊瑚甙含量在2.010-2g/L以内时，加以内时，加1mL Epstahl试剂可试剂可使使1mL试液中的桃叶珊瑚苷完全形成稳定的有色化合物。显试液中的桃叶珊瑚苷完全形成稳定的有色化合物。显色剂较少时，吸光度偏低；较多时影响不大。色剂较少时，

23、吸光度偏低；较多时影响不大。紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法3、冰醋酸用量、冰醋酸用量在醋酸浓度较小时，随醋酸浓度的增大，显色溶液的吸光度在醋酸浓度较小时，随醋酸浓度的增大，显色溶液的吸光度增加较多，醋酸浓度较大时，增大醋酸的浓度，显色溶液的增加较多，醋酸浓度较大时，增大醋酸的浓度，显色溶液的吸光度增加较少。测定中吸光度增加较少。测定中1mL试液加入试液加入1mL醋酸为宜。醋酸为宜。加入醋酸还可加快显色反应速度加入醋酸还可加快显色反应速度。紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法4、显色溶剂的选择、显色溶剂的选择在水溶液中显色，溶液为浑浊的蓝色，在水溶液中显色，溶液为浑浊的蓝色，并

24、很快沉淀。并很快沉淀。试验发现加入试验发现加入95乙醇，显色溶液为清彻的深蓝色，无沉淀。乙醇，显色溶液为清彻的深蓝色，无沉淀。表明乙醇能够增大显色化合物的溶解度而使其稳定，表明乙醇能够增大显色化合物的溶解度而使其稳定，因此采因此采用乙醇为显色溶剂。用乙醇为显色溶剂。测定中测定中1mL试液加人试液加人2mL 95乙醇为宜。乙醇为宜。紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法5、显色温度和显色时间、显色温度和显色时间显色反应温度过高，溶液沸腾，使溶剂损失严重，以显色反应温度过高，溶液沸腾，使溶剂损失严重，以80水水浴显色为宜。浴显色为宜。在该温度下显色在该温度下显色2530 min后，显色溶液的吸

25、光度不再增加。后，显色溶液的吸光度不再增加。紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法6、显色化合物的稳定时间、显色化合物的稳定时间在拟定实验条件下，显色化合物的吸光度在显色后在拟定实验条件下，显色化合物的吸光度在显色后1h无变化，无变化，10 h后，吸光度略有减小。后，吸光度略有减小。Epstahl试剂试剂的配制：的配制：对二甲氨基苯甲醛对二甲氨基苯甲醛0.25 g，冰醋酸，冰醋酸50 g，35% H3PO4 5 g，水，水20 mL 。紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法7、样品分析、样品分析称取称取1.000g干燥杜仲叶粉末，用干燥杜仲叶粉末，用60%乙醇提取乙醇提取3次，提取液于

26、次，提取液于50mL容量瓶定容。容量瓶定容。分别吸取分别吸取100L桃叶珊瑚苷溶液和提取液，加入桃叶珊瑚苷溶液和提取液，加入Epstahl试剂，试剂，80加热加热30min显色。显色。在在601nm测定吸光度，根据工作曲线计算桃叶珊瑚甙的含量。测定吸光度，根据工作曲线计算桃叶珊瑚甙的含量。紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法3、药物中、药物中多糖的多糖的分光光度法分光光度法分析分析1、标准曲线的制备、标准曲线的制备多糖在浓多糖在浓HCl作用下，水解成单糖，和作用下，水解成单糖，和3,5-二硝基水杨酸缩合成有色化二硝基水杨酸缩合成有色化合物，合物，可用分光光度法于适宜波长处测定多糖含量，本

27、法简便，显色稳可用分光光度法于适宜波长处测定多糖含量，本法简便，显色稳定，灵敏度高，重现性好。定，灵敏度高，重现性好。取葡萄糖标准品配置成一系列不同浓度的标准溶液，分别加入取葡萄糖标准品配置成一系列不同浓度的标准溶液，分别加入 3,5-二硝二硝基水杨酸试剂，混匀，放入基水杨酸试剂，混匀，放入90水浴中加热水浴中加热10min，取出，流水冷却，取出，流水冷却，用蒸馏水定容，摇匀，于用蒸馏水定容，摇匀，于492 nm处测吸光度。得处测吸光度。得回归方程：回归方程：C112.4942A36.0148 , R =0. 9979。 式中：式中：C标准溶液浓度（标准溶液浓度（g/mL），），A吸光度。吸光

28、度。紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法2、提取物中多糖的含量测定、提取物中多糖的含量测定精密称取多糖提取物精密称取多糖提取物100mg（或从材料中提取多糖），用蒸馏水（或从材料中提取多糖），用蒸馏水定容至定容至10 mL，精密吸取，精密吸取0.5mL。加入加入6 mol/L的的HCl 10 mL，沸水浴加热水解沸水浴加热水解30min，冷却后用，冷却后用6 mol/L的的NaOH调调pH至中性，加入至中性，加入2 mL 3,5-二硝基水杨酸试剂，二硝基水杨酸试剂，另取一支试管以另取一支试管以蒸馏水和蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸试剂为空白对照，二硝基水杨酸试剂为空白对照，充分混合后于充分

29、混合后于90水浴中显色水浴中显色10min，492nm测定测定A值，值，以标准曲线计算酸性多糖的含量。以标准曲线计算酸性多糖的含量。紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法作用？作用？Why?紫外紫外- -可见可见分光光度法分光光度法原理：原理：3,5-二硝基水杨酸在中性或偏碱性条二硝基水杨酸在中性或偏碱性条件下与还原糖共热后被还原成棕红件下与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物（色的氨基化合物（3-氨基氨基-5-硝基水硝基水杨酸），在一定范围内，还原糖的杨酸），在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈正比。量和反应液的颜色呈正比。 三、紫外分光光度法分析三、紫外分光光度法分析利用紫外分光

30、光度法进行定量分析具有快速、灵敏度等优点。利用紫外分光光度法进行定量分析具有快速、灵敏度等优点。一般测试范围在一般测试范围在1至至0.1 ppm，准确度可在，准确度可在2以内。以内。本法不需要显色剂，因而不受显色剂、温度及显色时间等因素本法不需要显色剂，因而不受显色剂、温度及显色时间等因素的影响，操作简便。的影响，操作简便。待测成分在紫外光区（待测成分在紫外光区（200400nm）有吸收，并在测试浓度范）有吸收，并在测试浓度范围内服从朗伯围内服从朗伯-比尔定律者，均可选用。比尔定律者，均可选用。 紫外紫外分光光度法分光光度法常用中药主成分的紫外吸收波长常用中药主成分的紫外吸收波长紫外紫外分光光

31、度法分光光度法纸色谱分离纸色谱分离-紫外分光光度法测阿魏酸紫外分光光度法测阿魏酸展开剂：水展开剂：水洗脱剂：洗脱剂：95%乙醇乙醇分析波长：分析波长：330 nm00.050.10.150.20.250.300.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8对照品溶液浓度吸光度紫外紫外分光光度法分光光度法紫外紫外分光光度法分光光度法第二章第二章 光谱分析法的应用光谱分析法的应用分光光度法分光光度法第二章第二章 光谱分析法的应用光谱分析法的应用分光光度法分光光度法第二章第二章 光谱分析法的应用光谱分析法的应用分光光度法分光光度法第二节第二节 红外分光光度法的应用红外分光光度法的应用

32、*红外分光光度法（红外分光光度法（1nfrared Spectrophotometry）：是以红外区）：是以红外区域电磁波连续光谱作为辐射源照射样品，记录样品吸收曲线的一域电磁波连续光谱作为辐射源照射样品，记录样品吸收曲线的一种物理光学分析方法，又称红外吸收光谱法。种物理光学分析方法，又称红外吸收光谱法。红外光谱区一般分为三个区域，近红外光区，波长红外光谱区一般分为三个区域，近红外光区，波长0.752.5 m；中红外区，波长中红外区，波长2.525m；远红外区，波长；远红外区，波长25500 m。 红外分光光度法红外分光光度法红外吸收光谱突出特点是具有高度的特征性，除光学异构体红外吸收光谱突出

33、特点是具有高度的特征性，除光学异构体外，每种有机化合物都有自己的红外吸收光谱。外，每种有机化合物都有自己的红外吸收光谱。有机化合物中各官能团在某一区域出现吸收谱带的位置相对有机化合物中各官能团在某一区域出现吸收谱带的位置相对恒定，不受或少受分子中其它部分的影响，这种谱带称为相恒定，不受或少受分子中其它部分的影响，这种谱带称为相应官能团的特征吸收，可用于有机官能团的鉴定。应官能团的特征吸收，可用于有机官能团的鉴定。 第二章第二章 光谱分析法的应用光谱分析法的应用红外分光光度法红外分光光度法红外光谱主要应用在定性鉴别上，若两个样品的光谱完全相红外光谱主要应用在定性鉴别上，若两个样品的光谱完全相同，

34、可以判断它们是同一化合物。同，可以判断它们是同一化合物。若峰数不多，且外形较钝，则可靠性较差。若峰数不多，且外形较钝，则可靠性较差。红外光谱是整个化合物的分子鉴别，红外光谱是整个化合物的分子鉴别，红外光谱的红外光谱的“指纹指纹”区区更具有鉴别化合物的特征。更具有鉴别化合物的特征。一、定性分析一、定性分析 第二章第二章 光谱分析法的应用光谱分析法的应用红外分光光度法红外分光光度法1.山药山药 2. 参署参署 3.木薯木薯 4.番薯番薯1.山药山药2. 参署参署3.木薯木薯4.番薯番薯第二章第二章 光谱分析法的应用光谱分析法的应用红外分光光度法红外分光光度法 利用红外分光光度计进行定量分析，它的理

35、论基础仍然是朗伯利用红外分光光度计进行定量分析，它的理论基础仍然是朗伯-比尔定律。但有以下缺点。比尔定律。但有以下缺点。1、 光源强度和检测器灵敏度比可见和紫外光谱仪小。光源强度和检测器灵敏度比可见和紫外光谱仪小。2、 吸收池是由氯化钠等组成，比较脆弱、其厚度不易确定，表吸收池是由氯化钠等组成，比较脆弱、其厚度不易确定，表面状态也经常改变。面状态也经常改变。3、 红外光谱中红外光谱中最大不超过最大不超过103，可见和紫外吸收光谱中的，可见和紫外吸收光谱中的值可值可达达105 ，红外光谱的灵敏度低。，红外光谱的灵敏度低。二、定量分析二、定量分析S-410光栅透射型近光栅透射型近红外分光光度计红外

36、分光光度计 傅立叶变换红外傅立叶变换红外光谱仪光谱仪 IR200 含量测定方法含量测定方法:1、基线法、基线法在吸收峰两侧选基点在吸收峰两侧选基点P和和Q，两点连线称为基线，两点连线称为基线，通过峰顶通过峰顶t作垂线作垂线rs则：则： 由由rs与与ts线的长度，可求出样品在此波长下的线的长度，可求出样品在此波长下的吸收度。依次配制一系列不同浓度的样品溶液，吸收度。依次配制一系列不同浓度的样品溶液，在同样的波长下测定吸收度，绘制标准曲线，在同样的波长下测定吸收度，绘制标准曲线，利用工作曲线求出样品的浓度。利用工作曲线求出样品的浓度。含量测定方法含量测定方法:2、固体样品吸收度法：、固体样品吸收度

37、法：最简便的方法是绘制最简便的方法是绘制KBr片中样品的工作曲线。片中样品的工作曲线。设设s为压片的面积，为压片的面积，L为厚度，为厚度，m为压片中样品的量，在压片中的为压片中样品的量，在压片中的样品浓度将为：样品浓度将为：SLmC SEmCLA/E比尔定律：比尔定律：同一模具压片，同一模具压片，S为常数为常数E/Sk，则，则Amk。在片中，样品的吸收度只与片中样品的量有关，而与片的厚度无关。在片中，样品的吸收度只与片中样品的量有关，而与片的厚度无关。制备一系列不同含量的片，测定吸收度，而后绘制工作曲线。制备一系列不同含量的片，测定吸收度，而后绘制工作曲线。3、峰高法：、峰高法：P96第二章第

38、二章 光谱分析法的应用光谱分析法的应用第三节第三节 荧光分析法的应用荧光分析法的应用 用一种波长的光（如紫外光）照射某物质时，物质的分子吸用一种波长的光（如紫外光）照射某物质时，物质的分子吸收了该波长的光后，在很短的时间内（延迟几纳秒至几微秒）发收了该波长的光后，在很短的时间内（延迟几纳秒至几微秒）发射出较照射波长长的光，即为荧光。因而荧光光谱是发射光谱。射出较照射波长长的光，即为荧光。因而荧光光谱是发射光谱。利用物质分子结构不同，所吸收的紫外光波长与发射的荧光波长利用物质分子结构不同，所吸收的紫外光波长与发射的荧光波长也有所不同的特性，可鉴别物质。也有所不同的特性，可鉴别物质。 荧光分析法具

39、有灵敏度高（浓度可低至荧光分析法具有灵敏度高（浓度可低至10-4g/m1）、选择性）、选择性好、试样量少（几十微克或几十微升）等特点。好、试样量少（几十微克或几十微升）等特点。 不足之处是干扰因素较多且实验条件严格。不足之处是干扰因素较多且实验条件严格。 第二章第二章 光谱分析法的应用光谱分析法的应用荧光分光光度法荧光分光光度法一、一、激发光谱与荧光光谱激发光谱与荧光光谱任何发荧光的分子都具有两个特征光谱：激发光谱和荧光光谱。任何发荧光的分子都具有两个特征光谱：激发光谱和荧光光谱。*激发光谱：激发光谱：将激发荧光的光源（紫外光或可见光）用单色器分将激发荧光的光源（紫外光或可见光）用单色器分光，

40、测定样品对每一波长的激发光所发射的荧光强度，以激发光光，测定样品对每一波长的激发光所发射的荧光强度，以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，就可得到荧光物质的激波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，就可得到荧光物质的激发光谱。发光谱。 *荧光光谱：用选好的最大荧光光谱：用选好的最大激发波长作光源，让物质发激发波长作光源，让物质发生的荧光通过单色器分光，生的荧光通过单色器分光，测定每一个波长的荧光强度，测定每一个波长的荧光强度，以荧光强度对荧光波长作图，以荧光强度对荧光波长作图，得荧光光谱。得荧光光谱。第二章第二章 光谱分析法的应用光谱分析法的应用荧光分光光度法荧光分光光度法二、荧光和分子结构

41、的关系二、荧光和分子结构的关系 产生荧光的首要条件是物质分子必须具有电子吸收光谱的产生荧光的首要条件是物质分子必须具有电子吸收光谱的特征结构，其次是必须具有一定的荧光效率和合适的环境特征结构，其次是必须具有一定的荧光效率和合适的环境。 荧光通常发生于具有共轭双键体系的分子，体系中电子共荧光通常发生于具有共轭双键体系的分子，体系中电子共轭度越大，非定域轭度越大，非定域电子越易被激发，就越易产生荧光，且荧电子越易被激发，就越易产生荧光，且荧光光谱将向长波长方向移动光光谱将向长波长方向移动。 任何有利于提高任何有利于提高电子共轭程度的结构改变，都能提高荧电子共轭程度的结构改变，都能提高荧光效率、或使

42、荧光波长红移。例如蒽：荧光效率光效率、或使荧光波长红移。例如蒽：荧光效率0.36：荧光波：荧光波长长402nn，9-乙烯基蒽：荧光效率乙烯基蒽：荧光效率0.76；荧光波长；荧光波长432nm。第二章第二章 光谱分析法的应用光谱分析法的应用荧光分光光度法荧光分光光度法 三、荧光强度三、荧光强度 荧光强度与样品浓度呈线性关系，与物质本身的荧光效率荧光强度与样品浓度呈线性关系，与物质本身的荧光效率及激发光强度成正比。及激发光强度成正比。 荧光效率愈大，荧光强度愈强。荧光效率愈大，荧光强度愈强。 激发光源愈强，产生的荧光愈强，检测灵敏度愈高。但很激发光源愈强，产生的荧光愈强，检测灵敏度愈高。但很强的光

43、源易使样品光分解，通常使用中等强度的激发光。强的光源易使样品光分解，通常使用中等强度的激发光。 化合物的摩尔吸收系数越大，其产生的荧光强度越强。化合物的摩尔吸收系数越大，其产生的荧光强度越强。第二章第二章 光谱分析法的应用光谱分析法的应用荧光分光光度法荧光分光光度法四、测定仪器四、测定仪器 测定荧光的仪器，常用的有目测荧光计、光电荧光计测定荧光的仪器，常用的有目测荧光计、光电荧光计和荧光分光光度计等。其基本结构都是由激发光源、单和荧光分光光度计等。其基本结构都是由激发光源、单色器、样品池与检测系统组成的。色器、样品池与检测系统组成的。 荧光分光光度计基本结构和原理图荧光分光光度计基本结构和原理

44、图Aminco Bowman Series2型荧光分光光度计型荧光分光光度计 第二章第二章 光谱分析法的应用光谱分析法的应用荧光分光光度法荧光分光光度法五、影响荧光强度的外界因素五、影响荧光强度的外界因素*1、溶剂、溶剂 溶剂的极性显著地影响荧光物质的荧光强度。通常溶剂极性增大，溶剂的极性显著地影响荧光物质的荧光强度。通常溶剂极性增大，对对n-共扼的荧光物质，共扼的荧光物质，n-*跃迁所需能量增加，跃迁儿率减少，荧跃迁所需能量增加，跃迁儿率减少，荧光强度减弱，光强度减弱，这些物质的荧光测定，宜用非极性溶剂。这些物质的荧光测定，宜用非极性溶剂。 相反，对相反，对-*共扼的荧光物质，共扼的荧光物质

45、， -*跃迁所需能量减小，跃迁跃迁所需能量减小，跃迁几率增加，荧光强度增强。几率增加，荧光强度增强。 含有重原子的溶剂如四溴化碳、碘乙烷等，使化合物的荧光大含有重原子的溶剂如四溴化碳、碘乙烷等，使化合物的荧光大为减弱，应尽可能避免使用这类溶剂。为减弱，应尽可能避免使用这类溶剂。 通常配制溶液时，使用的溶剂除水外，常用的还有乙醇、环乙通常配制溶液时，使用的溶剂除水外，常用的还有乙醇、环乙烷、四氯化碳、氯仿等。烷、四氯化碳、氯仿等。这些溶剂中常含有荧光杂质，影响测定，必这些溶剂中常含有荧光杂质，影响测定，必须经过净化处理后方可使用。须经过净化处理后方可使用。 第二章第二章 光谱分析法的应用光谱分析

46、法的应用荧光分光光度法荧光分光光度法2、温度：、温度： 通常溶液的荧光强度随温度的降低而增强通常溶液的荧光强度随温度的降低而增强。 如荧光素钠的乙醇溶液，在如荧光素钠的乙醇溶液，在0以下每降低以下每降低10、荧光效率增、荧光效率增加加3。这主要是因为在溶液温度下降时，介质粘度增加，荧。这主要是因为在溶液温度下降时，介质粘度增加，荧光物质分子与溶剂分子的碰撞也随之减少的缘故。光物质分子与溶剂分子的碰撞也随之减少的缘故。 随着温度的升高，荧光降低的主要原因是由于分子内的能量随着温度的升高，荧光降低的主要原因是由于分子内的能量转移作用，即将激发能转为基态的振动能，或通过碰撞将能量转移作用，即将激发能

47、转为基态的振动能，或通过碰撞将能量转移给其它分子。另一原因可能是激发分子与溶剂分子之间发转移给其它分子。另一原因可能是激发分子与溶剂分子之间发生某些可逆的光化学反应生某些可逆的光化学反应。第二章第二章 光谱分析法的应用光谱分析法的应用荧光分光光度法荧光分光光度法3、溶液的、溶液的pH 当荧光物质为带有酸或碱功能团的芳香化合物，或为金属络合物时，当荧光物质为带有酸或碱功能团的芳香化合物，或为金属络合物时，溶液溶液pH值的变化将对溶液中荧光物质的荧光强度发生影响。值的变化将对溶液中荧光物质的荧光强度发生影响。 例如苯酚是弱酸，在酸性溶液中以分子形式存在，呈现荧光，但例如苯酚是弱酸，在酸性溶液中以分

48、子形式存在，呈现荧光，但在碱性溶液中则以苯酚阴离子形式存在，却不呈现荧光。在碱性溶液中则以苯酚阴离子形式存在，却不呈现荧光。 又如镁和又如镁和8-羟基喹啉羟基喹啉-5-磺酸钠，在磺酸钠，在pH 8以上时形成络合物，呈现以上时形成络合物，呈现荧光。当荧光。当pH下降到下降到5.7以下，络合物解离，荧光也消失。以下，络合物解离，荧光也消失。 还有些荧光物质在酸性或碱性介质中，因水解而使荧光强度发生还有些荧光物质在酸性或碱性介质中，因水解而使荧光强度发生改变，也有的因发生环的破裂或链的断开而引起荧光强的变化。改变，也有的因发生环的破裂或链的断开而引起荧光强的变化。第二章第二章 光谱分析法的应用光谱分

49、析法的应用荧光分光光度法荧光分光光度法六、定量分析方法六、定量分析方法荧光分析的定量方法与分光光度法基本相同，荧光分析的定量方法与分光光度法基本相同，比分光光度法比分光光度法灵敏度高，但精密度较差，易受系统误差的影响。灵敏度高，但精密度较差，易受系统误差的影响。 常用方法有标准曲线法，直接比较法、制备荧光衍生物常用方法有标准曲线法，直接比较法、制备荧光衍生物测定法、淬灭荧光测定法、化学发光免疫分析法、激光荧光测定法、淬灭荧光测定法、化学发光免疫分析法、激光荧光光谱法、导数荧光光谱法等。光谱法、导数荧光光谱法等。第二章第二章 光谱分析法的应用光谱分析法的应用误差及处理误差及处理第四节第四节 误差

50、及其处理误差及其处理误差是衡量定量分析准确性高低的一个尺度。误差是衡量定量分析准确性高低的一个尺度。一、绝对误差和相对误差一、绝对误差和相对误差1、绝对误差、绝对误差测量值测量值(x)与真实值与真实值()的差值称为绝对误差的差值称为绝对误差(absolute error)，用，用符号符号表示。表示。 = x- (绝对误差可正也可负，绝对误差可正也可负，代表的意义代表的意义?)2、相对误差、相对误差绝对误差与真实值的比值称为相对误差（绝对误差与真实值的比值称为相对误差（relative error）。）。相对误差反映误差在真实之中所占的比例，用百分率或千分率来相对误差反映误差在真实之中所占的比例