限制性核酸内切酶课件.ppt
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1、第二章第二章 基因工程的工具酶基因工程的工具酶一、限制性核酸内切酶的发现一、限制性核酸内切酶的发现第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制限制 (restriction)修饰修饰 (modification) 限制性核酸内切酶的生物学功能:自我保护功能限制性核酸内切酶的生物学功能:自我保护功能(只只切外来的切外来的DNA,自身,自身DNA被甲基化后切不动被甲基化后切不动)核酸酶:水解断裂多核苷酸链的两个相邻核苷酸的核酸酶:水解断裂多核苷酸链的两个相邻核苷酸的3,5磷酸二酯键磷酸二酯键核糖核酸酶(核糖核酸酶(RNase):):脱氧核糖核酸酶(脱氧核糖核酸酶(DNase):):核酸外切酶
2、(核酸外切酶(exonuclease):):核酸内切酶(核酸内切酶(endonuclease):): 限制性核酸内切酶:限制性核酸内切酶: 二、限制性核酸内切酶的分类二、限制性核酸内切酶的分类主要特性主要特性I I 型型II II 型型III III 型型限制修饰限制修饰蛋白结构蛋白结构异源三聚体异源三聚体同源二聚体同源二聚体异源二聚体异源二聚体切割位点切割位点距识别序列距识别序列1 1kbkb处随机性切割处随机性切割识别序列内或识别序列内或附近特异性切附近特异性切割割距识别序列下距识别序列下游游24-2624-26bpbp用途用途无应用价值无应用价值应用广泛应用广泛无应用价值无应用价值平末端
3、平末端粘性末端粘性末端1单位酶活性单位酶活性(1unit 1U):在最适反应条件在最适反应条件下下1小时完全切割小时完全切割1ugDNA样品的酶量。样品的酶量。同序同裂酶同序同裂酶( (识别及酶切位点相同识别及酶切位点相同):同序异裂酶同序异裂酶( (识别位点相同但酶切位点不同识别位点相同但酶切位点不同):同尾酶同尾酶( (酶切位点不同但产生相同的粘性末酶切位点不同但产生相同的粘性末端端):):酶切位点的计算:酶切位点的计算:四核苷酸识别序列:四核苷酸识别序列:4 44 4 = 256= 256六核苷酸识别序列:六核苷酸识别序列:4 46 6 = = 409640962 2个假设:个假设:a
4、a 随机排列;随机排列;b GCb GC含量含量50%50%如:如:用用BglBgl(A(A/GATC/T)/GATC/T)酶切酶切DNA49KbDNA49Kb): : 理论上的切点数:理论上的切点数: 49000/4096=1 49000/4096=12 2个个 实际情况?实际情况?三、限制性核酸内切酶的命名1973年年H.Smith和和D.Nathans提议提议每一种酶都由产生并纯化生出该酶的细菌的种属名中的三个每一种酶都由产生并纯化生出该酶的细菌的种属名中的三个英文字母合起来代表:英文字母合起来代表: 第一个字母采用细菌属名的第一个字母大写;第一个字母采用细菌属名的第一个字母大写; 第二
5、和第三个字母小写,采用细菌种名的前两个字母;第二和第三个字母小写,采用细菌种名的前两个字母;如大肠杆菌(如大肠杆菌(Escherichia coli)用)用Eco表示,代表从表示,代表从大肠杆菌中分离出的限制性内切酶。大肠杆菌中分离出的限制性内切酶。第四个字母表示菌株的类型(大小写均有),如第四个字母表示菌株的类型(大小写均有),如EcoR中的中的R代表大肠杆菌代表大肠杆菌R株。株。如果一个菌株有几种限制酶,则在代表菌株的字母后用罗马如果一个菌株有几种限制酶,则在代表菌株的字母后用罗马数字表示。数字表示。思考题:思考题:流感嗜血杆菌(流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)
6、d菌株菌株有三种限制酶,分别怎么表示?有三种限制酶,分别怎么表示?Hind I、HindII、HindIIIBaciUus amyloliquefaciens H Streptomyces albus I一、天然一、天然DNADNA的制备的制备 1 1、天然、天然DNADNA的来源的来源染色体染色体DNADNA病毒和噬菌体病毒和噬菌体DNADNA质粒质粒DNADNA线粒体和叶绿体线粒体和叶绿体DNADNA第二节第二节 DNADNA分子片段化分子片段化2、天然、天然DNA的提取的提取 准备生物材料。准备生物材料。裂解细胞。裂解细胞。分离和抽提分离和抽提DNA。二、二、DNA的纯化的纯化 琼脂糖凝
7、胶电泳洗脱法琼脂糖凝胶电泳洗脱法 适用于小剂量适用于小剂量DNA的纯化和酶切的纯化和酶切DNA片片段的回收。段的回收。三、三、 DNA的浓缩的浓缩 乙醇沉淀法乙醇沉淀法在含一价阳离子的在含一价阳离子的DNA溶液中加入溶液中加入2体体积的无水乙醇,使积的无水乙醇,使DNA沉淀沉淀(-20,时间在时间在30min以上)以上)通过离心收集沉淀的通过离心收集沉淀的DNA溶于适量的溶于适量的TE缓冲液或无菌水中缓冲液或无菌水中四、限制性核酸内切酶反应四、限制性核酸内切酶反应1 1、限制性核酸内切酶反应缓冲液、限制性核酸内切酶反应缓冲液 2、单酶切法、单酶切法 若若DNA样品是环状样品是环状DNA分子,完
8、全酶切后,产分子,完全酶切后,产生与识别序列数(生与识别序列数(n)相同的相同的DNA片段数,并且片段数,并且DNA片段的两末端相同片段的两末端相同 若若DNA样品本来就是线形样品本来就是线形 DNA片段,完全酶切片段,完全酶切的结果,产生的结果,产生n 1个个 DNA片段数,其中有两个片片段数,其中有两个片段的一端仍保留原来的末端段的一端仍保留原来的末端 3、双酶切法、双酶切法 应先用需要较低盐浓度缓冲液的酶进行切割,然后调节缓冲应先用需要较低盐浓度缓冲液的酶进行切割,然后调节缓冲液的盐浓度,再加入需要较高盐浓度缓冲液的酶进行切割。液的盐浓度,再加入需要较高盐浓度缓冲液的酶进行切割。 如果两
9、种限制性核酸内切酶的最适反应温度不同,则应先用如果两种限制性核酸内切酶的最适反应温度不同,则应先用最适反应温度较低的酶进行切割,升温后再加入第二种酶进最适反应温度较低的酶进行切割,升温后再加入第二种酶进行切割。行切割。 若两种限制性核酸内切酶的反应系统相差很大,会明显影响若两种限制性核酸内切酶的反应系统相差很大,会明显影响双酶切结果,则可以在第一种酶切割后,经过凝胶电泳回收双酶切结果,则可以在第一种酶切割后,经过凝胶电泳回收需要的需要的DNADNA片段,再选用合适的反应系统,进行第二种限制片段,再选用合适的反应系统,进行第二种限制性核酸内切酶的切割。性核酸内切酶的切割。4、部分酶切 当某种限制
10、性核酸内切酶在待切割的当某种限制性核酸内切酶在待切割的DNA分子上有多个分子上有多个识别序列,并且其中一个识别序列正好在切割后需要回收待识别序列,并且其中一个识别序列正好在切割后需要回收待用的用的DNA片段上,若完全酶切,势必将此待用的片段上,若完全酶切,势必将此待用的DNA片段从片段从中切断。在此情况下,对中切断。在此情况下,对DNA样品进行部分酶切,经过凝胶样品进行部分酶切,经过凝胶电泳,根据待用电泳,根据待用DNA片段的大小,可回收待用的片段的大小,可回收待用的DNA片段片段 5、DNA分子的限制性图谱五五 、影响核酸内切限制酶活性的因素、影响核酸内切限制酶活性的因素(1)DNA的纯度的
11、纯度(2)DNA的甲基化程度的甲基化程度(3)酶切消化反应的温度)酶切消化反应的温度(4)DNA的分子结构的分子结构 (5)星星活性)星星活性 第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶 一、一、DNA聚合酶概述聚合酶概述 DNA聚合酶(聚合酶(polymerase): 以以DNA或或RNA为模板催化合成互补新链的酶。大多需为模板催化合成互补新链的酶。大多需要一个引物来起始互补新链的合成。要一个引物来起始互补新链的合成。 间断间断(discontinuity):在在DNA的一条链上某一位置两的一条链上某一位置两个相邻的核苷酸之间的磷酸二酯键发生断裂。个相邻的核苷酸之间的磷酸二酯键发生断裂。缺刻缺刻(ni
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