第十七章高效液相色谱分析课件.ppt

1、第十七章高效液相色谱分析第十七章高效液相色谱分析17.1 概述概述17.2 HPLC仪器仪器 包括：高压输液装置包括：高压输液装置; 进样系统进样系统; 分离系统分离系统; 检测系统检测系统;辅辅助系统助系统17.3 流动相和固定相简介流动相和固定相简介17.4 高效液相色谱方法各论高效液相色谱方法各论 分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱亲和色谱17.1 概述概述 高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱法。按照固定相不同可分

2、为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色谱液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色凝胶渗透色谱谱)。此外，还有亲和色谱、平板色谱。此外，还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱薄层色谱)等。等。 早期液相色谱，包括早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径的工作，都是在直径15cm, 长长50500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在填充的固定相颗粒直径多在150200 m范围内。即使这样，范围内。即使这样，流速仍然很低流速仍然很低(7时，该检测器不够灵敏。时，该检测器不够灵敏。其它检测器还包

3、括：其它检测器还包括：MS、IR、Evaporative light scattering detector(光散射光散射)、极谱等。、极谱等。17.3 HPLC流动相和固定相简介流动相和固定相简介一、固定相载体一、固定相载体 由于各种由于各种HPLC分离方法的流动相均为液体，因分离方法的流动相均为液体，因此，此，HPLC通常是按照固定相载体或固定液的不同来通常是按照固定相载体或固定液的不同来分类的。分类的。1. 按承受压力按承受压力分分刚性固体刚性固体：SiO2为基质，耐压为为基质，耐压为7.01081.0109 Pa。可制成直径、形状和孔隙深度不同的颗粒；主要。可制成直径、形状和孔隙深度不

4、同的颗粒；主要用于吸附、分配和键合色谱用于吸附、分配和键合色谱；硬硬 胶胶：以聚合物为基质：以聚合物为基质(常用苯乙烯与二乙烯苯交联常用苯乙烯与二乙烯苯交联而成而成)，耐压上限为，耐压上限为3.5 108 Pa, 主要用于离子交换主要用于离子交换和尺寸排阻色谱。和尺寸排阻色谱。2. 按孔隙深度按孔隙深度分分表面多孔型表面多孔型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层多孔活性材料一层多孔活性材料(如硅胶、氧化铝、离子交换剂、如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等分子筛、聚酰胺等)。表面多孔型固定相的颗粒大。表面多孔型固定相的颗粒大(易易装柱装柱)、多孔层

5、厚度小且孔浅、多孔层厚度小且孔浅(渗透性好，出峰快渗透性好，出峰快)；但；但交换容量小。适于常规分离分析。交换容量小。适于常规分离分析。全多孔型全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成，因颗：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成，因颗粒极细，因而孔径小、传质快、粒极细，因而孔径小、传质快、 柱效高。特别适于复柱效高。特别适于复杂混合物的分离。杂混合物的分离。二、流动相二、流动相 与与GC流动相不同，流动相不同，HPLC流动相为溶剂，它既有流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一样，参与对组分的竞争，运载作用，又和固定相一样，参与对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。因此溶剂的选择对分离十分重

6、要。 液相色谱的流动相又称为淋洗液，洗脱剂。流液相色谱的流动相又称为淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；亲水性固定液常采用疏水性流动相，离状况；亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。液液色谱法，极性柱也称正相柱。 若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。两种类型分离柱上的出

7、峰顺序相反。 2 溶剂的特性参数溶剂的特性参数主要包括溶剂强度参数、溶解度参数和极性参数等，主要包括溶剂强度参数、溶解度参数和极性参数等，具体见具体见P357表表17.21 对流动相的要求对流动相的要求1）对待测物具一定极性和选择性；）对待测物具一定极性和选择性；2）使用）使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长(为什为什么？么？) ；使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折；使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别；光率有较大差别；3）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止

8、波长增加；加；4）化学稳定性好；）化学稳定性好；5）适宜的粘度。粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。）适宜的粘度。粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。1）、溶剂强度）、溶剂强度 在吸附色谱中，通常固定相是极性的硅胶或氧化铝，而在吸附色谱中，通常固定相是极性的硅胶或氧化铝，而溶剂是非极性的，或含有极性溶剂的混合溶剂。采用溶剂强溶剂是非极性的，或含有极性溶剂的混合溶剂。采用溶剂强度度0将溶剂排队，一般定义正戊烷的将溶剂排队，一般定义正戊烷的0为零，其它的见表。为零，其它的见表。0越大越大-溶剂极性越大溶剂极性越大-k越小。越小。2）、溶解度参数）、溶解度参数 在分配色谱中（例如为反相色谱），固

9、定相是非极性的，在分配色谱中（例如为反相色谱），固定相是非极性的，溶剂是极性的，溶剂的作用更大，溶剂强度与溶剂的极性成溶剂是极性的，溶剂的作用更大，溶剂强度与溶剂的极性成反比。反比。 溶解度参数更好地代表溶剂的极性。溶解度参数更好地代表溶剂的极性。溶解度参数由四个部分组成溶解度参数由四个部分组成 = d + 0 + a + h其中：其中： d - -色散力色散力 o-偶极矩偶极矩 a , h -质子给予、接受的一种量度质子给予、接受的一种量度3)、选择性参数、选择性参数 P= log(Kg)e+log(Kg)d+log(Kg)n P-极性参数极性参数 Kg-与溶剂汽化自由能成比例的极性分布系数

10、。与溶剂汽化自由能成比例的极性分布系数。它分别根据乙醇（它分别根据乙醇（e）二噁烷（）二噁烷（d）和硝基甲烷（）和硝基甲烷（n）中的数据计算。中的数据计算。选择性参数选择性参数 xe= log(Kg)e/P xd = log(Kg)d/P xn = log(Kg)n/P 根据溶剂强度和极性参数分类、排队，只代表根据溶剂强度和极性参数分类、排队，只代表k值，值，对于难分离物质对，要根据溶质与溶剂之间的特殊对于难分离物质对，要根据溶质与溶剂之间的特殊作用才能分离。作用才能分离。 每种溶剂可以得到每种溶剂可以得到xe、xd、和、和xn三个数据，根据三个数据，根据数值在三角形平面坐标上找所在位置。位置

11、不同分数值在三角形平面坐标上找所在位置。位置不同分成八个区域，每个区域的溶剂有类似的性质。见成八个区域，每个区域的溶剂有类似的性质。见P359图图17.113、流动相选择、流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：常

12、用溶剂的极性顺序： 水水(最大最大) 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙丙酮酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙乙酸乙酯酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)17.4 高效液相色谱方法各论高效液相色谱方法各论 按分离原理可将按分离原理可将HPLC分为分配色谱、吸附色谱、离子交换分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱等。现在作分别介绍。色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱等。现在作分别介绍。一、分配色谱一、分配色谱1. 原

13、理原理： 根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配有不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。的过程。2. 流动相流动相: HPLC分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，根据流动相量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，根据流动相与固定相极性

14、的差别程度，可将液液色谱分为与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为正相分配色谱正相分配色谱（流（流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和和反相分配色谱反相分配色谱（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离）。适于非极性组分分离）。正相色谱正相色谱低极性流动相低极性流动相反相色谱反相色谱高极性流动相高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间时间时间时间时间待测物极性：待测物极性：ABC正、反相色谱中极性和保留时

15、间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系3. 固定相固定相 原则上，用于原则上，用于GC的固定相也可用于的固定相也可用于HPLC作固定相。但作固定相。但HPLC固固定液易流失，因此常用的只有几种，按极性由高到低为：定液易流失，因此常用的只有几种，按极性由高到低为： , -氧二氧二丙腈丙腈(ODPN)、聚乙二醇、聚乙二醇(PEM)、三甲撑二醇、三甲撑二醇(TMG)、十八烷、十八烷(C18)、角鲨烷角鲨烷(SQ)。 根据涂渍方法的不同，可将固定相分为根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型机械涂渍型和和化学键合型化学键合型，后者应用更为广泛。后者应用更为广泛。1）机械涂渍固定相）机械涂渍固定

16、相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型型(0.5-1.5%涂布量涂布量)或全多孔型载体或全多孔型载体(5-10%涂布量涂布量)上形成的液液色上形成的液液色谱固定相。该种固定相最大的不足是固定液易流失、分离稳定性及谱固定相。该种固定相最大的不足是固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。重现性差，不适合梯度淋洗。 为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱前置柱，该柱，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前

17、，预先被固定液饱和。前，预先被固定液饱和。2）化学键合固定相）化学键合固定相 化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。这种固定相分离机理既不是简单的吸附，也淋洗等特点。这种固定相分离机理既不是简单的吸附，也不是单一的液液分配，而是二者兼而有之。化学键合的表不是单一的液液分配，而是二者兼而有之。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以以分配机理分配机理为主。为主

18、。 通常，化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇通常，化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）。基）。二、化学键合相色谱法（二、化学键合相色谱法（CBPC） 采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，合相色谱。由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子k值范围宽的样值范围宽的样品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离

19、。它适用于种类繁多样品的分离。1键合固定相类型键合固定相类型 用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基的硅醇基(Si一一OH)与有机分子成键与有机分子成键,即可得到各种性能的固定即可得到各种性能的固定相。一般可分三类相。一般可分三类（1）疏水基团疏水基团 如不同链长的烷烃（如不同链长的烷烃（C8和和C18）和苯基等）和苯基等（2）极性基团极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3）离子交换基团离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺基，季铵盐如作为阴离子交换基团的胺基，季铵盐,作作为阳离子交换为阳

20、离子交换 基团的磺酸等。基团的磺酸等。时间，时间，min固定相：固定相：C1固定相：固定相：C8固定相：固定相：C18硅胶硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。2键合固定相的制备键合固定相的制备（1）硅酸酯（硅酸酯（Si一一OR）键合固定相键合固定相,它是最先用它是最先用于液相色谱的键合固定相。用醇与硅醇基发生酯于液相色谱的键合固

21、定相。用醇与硅醇基发生酯化反应：化反应： SiOHROHSiORH20 由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良好的传质特性有良好的传质特性,但这些酯化过的硅胶填料易但这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的水解且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的流动相。流动相。 共价键健合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸酯共价键健合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏反应不方便；当使用水溶液时，必好。缺点是格氏反应不方便；当使用水溶液时，必须限制须限制pH在在48范围内。范围内。OHSiSOCl2ClSi+HgBrSiSi

22、NHCH2CHNH2H2NCH2CH2NH2（2）SiC或或Si一一N共价共价 键合固定相，制备反应：键合固定相，制备反应： （3）硅烷化（）硅烷化（SiOSiC）键合固定相）键合固定相制备反应：制备反应： OHSiClSiR3+SiO(ROSiR3)SiR3+ HCl这类键合固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优这类键合固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在点。能在70以下，以下，pH=28范围内正常工作，应用较广泛范围内正常工作，应用较广泛. 3. 正相和反相键合色谱法正相和反相键合色谱法固定相极性小固定相极性小 如硅胶如硅胶-C18， ，硅胶硅胶-苯基；苯基； 流动相

23、极性大流动相极性大 甲醇甲醇-水、乙腈水、乙腈-水、水和无机盐的缓冲液。水、水和无机盐的缓冲液。 反相键合色谱法反相键合色谱法 分析对象分析对象 多用于多环芳烃多用于多环芳烃(PAHs)等低极性化合物分离；改变流等低极性化合物分离；改变流动相配比，动相配比，也可分离极性化合物；缓冲液可用于易离也可分离极性化合物；缓冲液可用于易离解的化合物，如有机解的化合物，如有机有机酸、有机酸、有 有机 机碱和酚碱和酚类 类。 。 固定相极性固定相极性大 大 硅胶硅胶-OH(或双或双-OH)， ，硅胶硅胶-CN 流动相极性流动相极性小 小 烃类烃类+适量极性溶剂适量极性溶剂(CHCl3， ，CH3OH， ，C

24、H3CN) 正 正相键合色谱法相键合色谱法 分析对象分析对象 多用于极性或中等极性化合物的分离。多用于极性或中等极性化合物的分离。还可用于分离还可用于分离异构体、异构体、极性不同的化合物以及不同类型的化合物。极性不同的化合物以及不同类型的化合物。 4.离子型键合相色谱法离子型键合相色谱法 当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如一种离子交换基团，如一SO3H 一一CH2NH2、COOH、一一CH2N(CH3) Cl等时，就形成了离子性键合相色谱的等时，就形成了离子性键合相色谱的固定相；流动相一般采用缓冲溶液。其分离原理与离固

25、定相；流动相一般采用缓冲溶液。其分离原理与离子交换色谱类同。子交换色谱类同。 三、液一固吸附色谱法三、液一固吸附色谱法(LSAC) 液一固吸附色谱是以液一固吸附色谱是以固体吸附剂固体吸附剂作为固定相，吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。来进行分离的。1分离原理分离原理 当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试

26、样分子（性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分用）于是，在要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分用）于是，在固定相表面发生竞争吸附固定相表面发生竞争吸附: X + nSad = Xad + nS达平衡时,有 nadnadadSXSXK其中其中Kad为吸附平衡常数为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。难于洗脱。Kad值小值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此

27、得以分离。据此得以分离。Kad值可通过吸附等温线数据求出。值可通过吸附等温线数据求出。 2固定相固定相 吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。最多。 在高效液相色谱法中，在高效液相色谱法中，表面多孔型表面多孔型和和全多孔型全多孔型都都可作吸附色谱中的固定相，它们具有填料均

28、匀、粒度可作吸附色谱中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小。孔穴浅的优点，能极大地提高柱效。但表面多孔小。孔穴浅的优点，能极大地提高柱效。但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全多孔型微粒填料。型微粒填料。3、流动相、流动相 一般把吸附色谱中流动相称作一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂洗脱剂。在吸附。在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱剂的极性强极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（弱可用溶剂强度参数（ 0 ）来衡量

29、。）来衡量。 0越大，表示越大，表示洗脱剂的极性越强。洗脱剂的极性越强。表表17-4列出一些常用溶剂在氧化列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的铝吸附剂中的0值。在硅胶吸附剂中值。在硅胶吸附剂中0值的顺序相同，值的顺序相同，数值可换算（数值可换算（0硅胶硅胶=0770氧化铝氧化铝）。）。 (四）离子交换色谱法（四）离子交换色谱法（IEC） 此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进

30、行分离。它不仅适用无机离用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。用范围较广。 1离子交换原理离子交换原理 离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的亲和力的差别差别来实现分离的。其固定相采用来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂离子交换树脂，树脂上，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的

31、离子可与树脂上可游离的平衡离子进行物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：可逆交换，其交换反应通式如下：阳离子交换阳离子交换： RSO3-H+M+RSO3-M+ H+阴离子交换：阴离子交换： RNR3+Cl-+X-RNR3+X-+ Cl-一般形式：一般形式： R一一AB RBA达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）：反应的选择系数）： 式中式中Ar，Br 分别代表树脂相中洗脱剂离子（分别代表树脂相中洗脱剂离子（A）和试样离子（和试样离子（B）的浓度，）的浓度，A、B则代表它们在溶则代表它们在溶液中

32、的浓度。离子交换反应的选择性系数见从表示液中的浓度。离子交换反应的选择性系数见从表示试样离子试样离子B对于对于A型树脂亲和力的大小：型树脂亲和力的大小：KB/A越越大大，说明说明B离子交换能力越离子交换能力越大大，越易保留而难于洗脱。一，越易保留而难于洗脱。一般说来，般说来，B离子电荷越离子电荷越大大，水合离子半径越，水合离子半径越小小，KB/A值就越值就越大大。rrABABABK/ 对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的一价离子的KB/A值按以下顺序：值按以下顺序：Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+二价离子的顺序为：二价离子的顺序为：Ba 2+Pb

33、2+Sr 2+Ca 2+Cd 2+Cu 2+，Zn 2+Mg 2+对于季胺型强碱阴离子交换树指，各阴离子的选择性顺序为：对于季胺型强碱阴离子交换树指，各阴离子的选择性顺序为： ClO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-OH- HCO3-H2P04-IO3-CH3COOF2固定相固定相 作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树合成树脂脂（聚苯乙烯）、（聚苯乙烯）、纤维素纤维素和和硅胶硅胶。而离子交换剂又有。而离子交换剂又有阳离阳离子子和和阴离子阴离子之分。再根据官能基的之分。再根据官能基的离解度大小离解度大小还有强弱

34、之还有强弱之分分按离子交换剂类型分四种：按离子交换剂类型分四种： 按固定相制作方法可分为：按固定相制作方法可分为： 多孔型离子交换树脂多孔型离子交换树脂(包括微孔型和大孔型包括微孔型和大孔型)； 表面多孔型表面多孔型(包括薄膜型）离子交换树脂；包括薄膜型）离子交换树脂； 离子交换键合型。离子交换键合型。 类型类型 官官能能团团 强强阳阳离离子子交换交换剂剂 -SO3- 阳阳离离子子交换交换剂剂 弱弱阳阳离离子子交换交换剂剂 -CO2- 强强阴阴离离子子交换交换剂剂 -NR3+ 阴阴离离子子交换交换剂剂 弱弱阴阴离离子子交换交换剂剂 -NH2+ 1）多孔型）多孔型： 聚苯乙烯聚苯乙烯+二乙烯苯交

35、联，分微二乙烯苯交联，分微孔型和大孔型。交换基团多孔型和大孔型。交换基团多交换交换容量大，稳定。但易溶胀，传质慢、容量大，稳定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析速度慢。柱效低、分析速度慢。2）表面多孔型：）表面多孔型： 薄膜型薄膜型=惰性核惰性核+树脂薄层树脂薄层(1-2 m) 多孔型多孔型=惰性核惰性核+硅胶微球硅胶微球+树脂薄树脂薄层。层。 克服了多孔型离子交换树脂的不克服了多孔型离子交换树脂的不足，但交换容量低，柱子易超负荷。足，但交换容量低，柱子易超负荷。3）离子交换键合相）离子交换键合相：利用化学反应：利用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。将离子交换基团键合到惰性载体表面。载体

36、可以是薄壳玻珠，也可以是多孔载体可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。使用后者为载体，可得到硅胶微粒。使用后者为载体，可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子。性能稳定、耐压、高柱效的柱子。微孔型微孔型 大孔型大孔型微孔微孔微孔微孔薄膜型薄膜型 表面多孔型表面多孔型离子交换层离子交换层惰性核惰性核惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂覆离子交换剂硅胶层涂覆3. 流动相流动相 离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液(有一定有一定pH和离子强度和离子强度) ，通过改变，通过改变pH、缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比、缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂

37、等条件来控制分配比k，改变交换剂的选择性，进而影响样品待测物的分离。，改变交换剂的选择性，进而影响样品待测物的分离。pH值值：影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。当组分以：影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。当组分以分子形式存在时，则不被保留；离子分数越高，保留值越大。常用的有柠分子形式存在时，则不被保留；离子分数越高，保留值越大。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。离子强度离子强度I：对保留值的影响比：对保留值的影响比pH更大。组分保留值受流动相中盐类总浓更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。增加外加阴或阳

38、离子将增加它们对度控制。增加外加阴或阳离子将增加它们对R+或或R-的竞争能力，使组的竞争能力，使组分保留值减小。通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物分保留值减小。通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。质对交换剂的亲和能力不同。有机溶剂有机溶剂：外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越：外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。配离子配离子L：当大量：当大量L、组分、组分X随流动相进入柱后，发生配位剂交换：随流动

39、相进入柱后，发生配位剂交换：RM-L+X RM-X+L该法用于分离各种氨基酸或碱类。该法用于分离各种氨基酸或碱类。五、离子色谱法（五、离子色谱法（IC） 离子色谱法是由离子色谱法是由离子交换色谱法离子交换色谱法派生出来的一种分离派生出来的一种分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。限制。 为了解决这一问题，为了解决这一问题，1975年年Small等人提出一种能同等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换分时测定多种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换分离柱后加一根离柱后加一根抑制柱抑制柱，抑制柱中装填

40、与，抑制柱中装填与分离柱分离柱电荷电荷相反相反的的离子交换树脂离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。这种色谱技术用电导检测器可直接检测各种离子的含量。这种色谱技术称为离子色谱。若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑称为离子色谱。若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交换剂的分离往后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生

41、换剂的分离往后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反应：两个重要反应： R+OH-H+Cl- R+Cl十十H2O R+一一OH-M+Cl-M+OHR+Cl- 由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+转变成相转变成相应的碱，由于应的碱，由于OH-离子的淌度为离子的淌度为Cl-离子的离子的26倍，提高了所测阳离倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理。子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也

42、有相似的作用机理。 该法的该法的不足之处在于不足之处在于：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度。因此有人提出了使用电导率很低的溶液展宽，降低分离度。因此有人提出了使用电导率很低的溶液(如苯如苯甲酸盐稀溶液甲酸盐稀溶液)作流动相。作流动相。 在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型离子色谱或称双在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生，而且谱带在通过抑制柱后会柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生，而且谱带在通过抑制柱后会加宽，降低了分离度。后来，加宽，降低了分离度。后来，Frits等人提出

43、采用抑制柱的离子色谱等人提出采用抑制柱的离子色谱体系，而采用了电导率极低的溶液，例如体系，而采用了电导率极低的溶液，例如110-4510-4moldm-3苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相，称为苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相，称为非抑制型非抑制型离子色离子色谱或单柱离子色谱。谱或单柱离子色谱。六、离子对色谱法（六、离子对色谱法（IPC） 离子对色谱主要用来分离离子对色谱主要用来分离强极性强极性有机酸和有机碱。有机酸和有机碱。1. 原理原理：将与待测物离子：将与待测物离子A电荷相反的离子电荷相反的离子B（称为（称为对离子对离子或或反离子反离子）加入到流动相（常为加入到流动相（常为有机

44、相有机相）中，使待测离子）中，使待测离子A与对离子与对离子B形成离子形成离子对对AB，该，该AB离子对离子对的性质与的性质与A离子离子或或B离子离子的性质不同，即间接改的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。变了待测离子的保留特性。例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流动相中加入例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流动相中加入与待测离子与待测离子A-有相反电荷的离子有相反电荷的离子B+： 由于离子对由于离子对AB具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测离子测离子A1，A2，A3.因与因与B离子间的成对能力不同，而形成不同离子

45、间的成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分疏水性的离子对，使得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的。离的目的。 有机相有机相水相水相水相水相BABA2键合相反相离子对色谱法键合相反相离子对色谱法 离子对色谱法类型很多，根据流动相和固定相的极性可离子对色谱法类型很多，根据流动相和固定相的极性可分为分为反相反相离子对和离子对和正相正相离于对色谱法。其中以离于对色谱法。其中以键合反相键合反相离子离子对色谱法最重要。这种色谱法的固定相采用对色谱法最重要。这种色谱法的固定相采用非极性非极性的的疏水疏水键键合相如十八烷基键合相（合相如十八烷基键合相（O

46、DS）等，流动相为加有）等，流动相为加有平平衡离子（反离子）衡离子（反离子）的的极性极性溶液（如甲醇一水或乙睛一水）。溶液（如甲醇一水或乙睛一水）。 根据离子对生成反应式，平衡常数根据离子对生成反应式，平衡常数 KAB可表示为可表示为水相水相有机相BABAKAB 根据定义，溶质的分配系数根据定义，溶质的分配系数 水相水相有机相BKABAKAB根据上两式，有根据上两式，有 式中式中为相比率。容量因子为相比率。容量因子k随随KAB和和B+水相的增大水相的增大而增大。而增大。 键合相反相离子对色谱法操作简便，只要改变流键合相反相离子对色谱法操作简便，只要改变流动相的动相的pH值、平衡离子的浓度和种类

47、，就可在较大范值、平衡离子的浓度和种类，就可在较大范围内改变分离的选择性，能较好解决难分离混合物的围内改变分离的选择性，能较好解决难分离混合物的分离问题。此法发展迅速，应用较广泛分离问题。此法发展迅速，应用较广泛.1水相BKVVKkABMS（七）尺寸排阻色谱法（七）尺寸排阻色谱法（SEC）尺寸排阻色谱法又称尺寸排阻色谱法又称凝胶色谱法凝胶色谱法，主要用于，主要用于较大分子较大分子的分离。的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸分子的尺寸和和形状形状不同来不同来实

48、现分离的。实现分离的。尺寸排阻色谱被广泛应用于尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分析大分子的分析，即用来分析大分，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。它具有其他液相色谱所没有子物质相对分子质量的分布。它具有其他液相色谱所没有的特点：的特点：(1) 保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息。信息。(2) 保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器器(3) 固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿

49、命长。保留分子，因此柱寿命长。(4) 不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于大于10才能得以分离。才能得以分离。1分离原理分离原理 尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。其固定相为化学情性多孔物质色谱方法。其固定相为化学情性多孔物质凝胶，凝胶，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有它类似于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子去而被排阻，较

50、早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先柱。这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。后由柱中流出。2. 固定相固定相类型类型 材料材料 型号型号 特点特点 流动相流动相 葡萄糖凝胶葡萄糖凝胶 Sephadax 水水 软性凝胶软性凝胶 聚苯乙烯聚苯乙烯 Bio-head-S 溶胀溶胀,小分小分子分离子分离 有机溶剂有机溶剂 聚苯乙烯聚苯乙烯 Styragel 有机溶剂有机溶剂 半刚性凝胶半刚性凝胶 聚乙酸酯聚乙酸酯 Emgel(OR) 溶胀溶胀较小较小流速较小流