基因工程产品分离纯化技术课件.pptx

1、基因工程产品分离纯化技术内容 一.基因工程表达产物的特点 二.基因工程药物分离纯化技术的要求 三.分离纯化的基本过程 四.如何选择分离纯化的方法 五.基因工程产品中试的研究一、基因工程表达产物的特点一、基因工程表达产物的特点 基因工程药物的分离、纯化非基因工程药物的分离、纯化非常重要。表达的产物都是多肽或常重要。表达的产物都是多肽或蛋白质蛋白质 。它的制得具有以下。它的制得具有以下 特点：特点：二、分离纯化的技术要求二、分离纯化的技术要求技术条件温和能保持产物生物活性。技术条件温和能保持产物生物活性。选择性好，能从复杂的混合物中有效的将选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达到较高

2、的纯化倍数。目的产物分离，达到较高的纯化倍数。收率要高。收率要高。两个技数间能直接衔接，两个技数间能直接衔接， 不需要对物料加以处理。不需要对物料加以处理。纯化过程要快，满足高纯化过程要快，满足高 生产率的要求。生产率的要求。细胞破碎与固液分离细胞破碎与固液分离细胞收集：细胞收集： 离心法、膜分离离心法、膜分离法。法。 细胞破碎：机械破碎法、非细胞破碎：机械破碎法、非机械破碎法。机械破碎法。 固液分离固液分离目的产物含有大量杂质必须进行分离目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。纯化。 蛋白质分离纯化方法的设计根据其蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。分子的理化性质和

3、生物学特性来决定。2. 目的产物的分离纯化目的产物的分离纯化 产产 物物 特特 性性 作作 用用 等电点等电点 决定离子交换种类及条件决定离子交换种类及条件相对分子量相对分子量 选择不同孔径的介质选择不同孔径的介质疏水性疏水性 与疏水、反相介质结合的程度与疏水、反相介质结合的程度生物特异性生物特异性 决定亲和配基决定亲和配基溶解性溶解性 决定分离体系及蛋白浓度决定分离体系及蛋白浓度稳定性稳定性 决定工艺采用温度及流程时间决定工艺采用温度及流程时间产物的特性在分离纯化中的作用产物的特性在分离纯化中的作用热原质的去除热原质的去除 热原质是肠杆菌科产生热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖）去除困

4、难。的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。水性可用疏水层析法。病毒的去除病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除。层析或过滤可将病毒去除。 三、分离纯化的基本过程三、分离纯化的基本过程 分离纯化原则分离纯化原则 分离策略分离策略 粗纯粗纯 色谱技术与精纯色谱技术与精纯（一）、分离纯化原则（一）、分离纯化原则要建立一个方便灵敏的蛋白检测方法，以估价每一步的提纯程度；分离步骤要尽可能少；初步分离要快速

5、，精纯要高分辨率；尽可能避免带入有害物质;每步需统计： 得率、纯度、纯化倍数（二）、分离纯化策略（二）、分离纯化策略（三）、粗纯（三）、粗纯How to break the bacteria cells?Ultrosonication High-pressure homogenizerSeperation and clarification Cross-flow filtration High-speed Centrifugation（四）精纯（四）精纯 除宿主来源除宿主来源DNADNA 除宿主来源蛋白质除宿主来源蛋白质 除宿主来源内毒素或致病因子除宿主来源内毒素或致病因子 除目的产物的异构体

6、除目的产物的异构体色谱技术的应用色谱技术的应用精纯的主要目的：精纯的主要目的： 基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通过固相的速率产生了差别，从而品中的各个成分通过固相的速率产生了差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。达到分离样品中各个成分的目的。 层析因固相介质不同又分为层析因固相介质不同又分为、和和等各种层析。等各种层析。色谱分离原理色谱分离原理 将作为固相成分的将作为固相成分的不溶性基质，例如葡不溶性基质，例如葡聚糖凝胶、纤维素、聚糖凝胶、纤

7、维素、树脂等填充到柱子中，树脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。用平衡液平衡。 然后加样品，再用然后加样品，再用适当的溶剂洗脱。适当的溶剂洗脱。 样品中各种成分通样品中各种成分通过柱子取决于与固相过柱子取决于与固相成分的相互作用，最成分的相互作用，最后以不同速率被洗脱后以不同速率被洗脱出来，达到将各个成出来，达到将各个成分分离的目的。分分离的目的。常用色谱分离技术 凝胶过滤（分子排阻）层析（GF，SEC） 离子交换层析（IEX） 疏水作用层析（HIC） 亲和层析（AC） 反相色谱层析（RPC）医学全在线( )（四）精纯（四）精纯（1 1）11Strategy/AC/1998/JB/. Daniel

8、ssonThree Phase Strategy - Ranking of Chromatography TechniquesThree Phase Strategy - Ranking of Chromatography TechniquesTechniqueCaptureIntermediatePolishingGFIEXHICACRPCConsiderationsLimited sample volumeLimited flow rate rangeProtein ligand is sensitiveto harsh cleaning conditionsUse of organic

9、solvents,loss of biological activity（四）精纯（四）精纯（2） 2-3步柱层析：离子交换（IEX）、疏水 （HIC）、凝胶过滤（GF） 尽量避免采用亲和层析（AC） 尽量避免采用反相层析（RPC） 除细菌内毒素用阴离子交换（AEX）AIEXTechniqueUltrafiltrationUFSuperdex 200 p.g.GFPurificationfactorQ Sepharose FF 10 times purification 82% yieldPhenyl Sepharose HPHICY.-F. Liao et al. (1996)J. Biol

10、. Chem. 271, 2834863622719Purification of recombinant a a-mannosidase from Pichia pastoris中试规模中压层析系统中试规模中压层析系统AKTA AKTA explorer 100explorer 100AKTA explorer 100AKTA explorer 100色谱系统工作流程色谱系统工作流程根据产物表达形式来选择根据产物表达形式来选择四、如何选择分离纯化的方法四、如何选择分离纯化的方法n 分泌型表达产物的发酵液体积很大分泌型表达产物的发酵液体积很大但浓度较低纯化前必须浓缩可用沉淀但浓度较低纯化前必须

11、浓缩可用沉淀和超滤法。和超滤法。n产物在周质表达是介于细胞内可溶性表产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达的一种形式达和分泌表达的一种形式, ,它可以避开可它可以避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白类杂质溶性表达蛋白和培养基中蛋白类杂质, ,在在一定程度上有利于分离纯化一定程度上有利于分离纯化. .为了获得周为了获得周质蛋白经低浓度溶菌酶处理后质蛋白经低浓度溶菌酶处理后, ,可采用渗可采用渗透压休克的方法来获得透压休克的方法来获得n可溶性表达产物破菌后的细胞上可溶性表达产物破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法，或离子交清，首选亲和分离方法，或离子交换层析。换层析。根据分离单元之间的衔接选择根

12、据分离单元之间的衔接选择 应选择不同机制的分离单元组成一应选择不同机制的分离单元组成一套分离工艺，尽早采用高效的分离手段。套分离工艺，尽早采用高效的分离手段。 u 先将最多的杂质去除，将费用最高、最先将最多的杂质去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段。费时的分离单元放在最后阶段。u随后采用高分辨率的操作单元（离子随后采用高分辨率的操作单元（离子交换层析和亲和层析）凝胶过滤放在最交换层析和亲和层析）凝胶过滤放在最后，这样可以提高分离效果。后，这样可以提高分离效果。u 层析分离次序的选择同样重要，合理层析分离次序的选择同样重要，合理的组合能提高分辨效率，并有利于各步的组合能提高分辨效率，并

13、有利于各步骤间的过渡。如离子交换层析、亲和层骤间的过渡。如离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤。析、凝胶过滤。 分离纯化工艺应遵循以下原则： 具有良好的稳定性和重复性 尽可能减少组成工艺的步骤 各技术步骤间要相互适应和协调根据分离纯化工艺的要求来选根据分离纯化工艺的要求来选择择工艺过程中尽可能少用试剂工艺过程中尽可能少用试剂 工艺所用时间要短工艺所用时间要短 工艺和技术必须高效收率高易操作工艺和技术必须高效收率高易操作能耗低能耗低 具有较高的安全性具有较高的安全性SDS- PAGE1. Total proteins2. High Salt3. Ion exchange4. Gel-filtrati

14、on5. Affinity 中试研究的概念与原则中试研究的概念与原则 中试的研究内容中试的研究内容 中试样品的用途中试样品的用途五、基因工程药物的中试研究五、基因工程药物的中试研究医学全在线( )一、中试研究的概念与原则一、中试研究的概念与原则 中试研究的概念：中试研究的概念： *从实验室阶段向生产阶段过渡的一个中从实验室阶段向生产阶段过渡的一个中 间阶段；间阶段； *是在中试规模下，对一系列工艺参数和是在中试规模下，对一系列工艺参数和 质量控制体系进行研究的过程；质量控制体系进行研究的过程； *目的是建立一条完全模拟生产实际状况目的是建立一条完全模拟生产实际状况 的小型质控与生产流水线。的小

15、型质控与生产流水线。 生产的批量要达到一定的规模，以满足检定、稳定生产的批量要达到一定的规模，以满足检定、稳定性研究、非临床研究和临床试验需要性研究、非临床研究和临床试验需要 工艺要稳定（观察工艺要稳定（观察3-5批）、工艺规模可同等条件放批）、工艺规模可同等条件放大大 需建立生产全过程的质控体系需建立生产全过程的质控体系 要符合要符合GMP条件条件 要符合成本控制原则要符合成本控制原则中试研究的原则：中试研究的原则：二、中试研究的内容二、中试研究的内容三、中试样品的用途三、中试样品的用途 注册检定与标准复核（注册检定与标准复核（1-3批，原液与成品批，原液与成品6倍全检定用倍全检定用量）量）

16、 标准品或参考品制备标准品或参考品制备 非临床研究非临床研究 临床试验临床试验 稳定性研究（原液与半成品）稳定性研究（原液与半成品）作作 业业 基因工程表达产物的特点是什么？基因工程表达产物的特点是什么？ 如何根据产物的特性来设计分离纯化路线？如何根据产物的特性来设计分离纯化路线？ 分离纯化应遵循的原则是什么？分离纯化应遵循的原则是什么？ 中试的概念、原则分别是什么？中试的概念、原则分别是什么？谢谢 谢！谢！医学全在线( )(1) (1) 凝胶过滤层析凝胶过滤层析 此法又称为分子筛层析。凝胶过此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺

17、形成的凝胶琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。结构。 Sephadex G10-G200(Sephadex G10-G200(葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶) ) SepharoseSepharose2 2B,4B,6B(B,4B,6B(琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶) ) Sephacryl S100,S200,S300,S400Sephacryl S100,S200,S300,S400 ( (聚丙烯酰胺葡聚糖凝聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶胶) )分子筛层析的工作原理分子筛层析的工作原理带网孔的带网孔的葡聚糖珠葡聚糖珠小分子进入小分子进入葡聚糖珠内葡聚糖珠内大分子不

18、大分子不能进入珠能进入珠内，经珠内，经珠之间缝隙之间缝隙流出流出凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意凝胶过滤层析过程示意图图小分子小分子大分子大分子凝胶基质凝胶基质凝胶凝胶珠珠1 1、根据不同分子量选择不同凝胶、根据不同分子量选择不同凝胶a.Sephadex: 交联葡聚糖交联葡聚糖 G-10，15，25，50，75，100，150，200；得水值；得水值 X 10b.Sepharose：琼脂糖凝胶：琼脂糖凝胶 Bio-Gel Ac.Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛：聚丙烯酰胺凝胶分子筛d.Sephacryl：用：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶亚甲双

19、丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶凝胶过滤的过程凝胶过滤的过程凝胶柱的选择凝胶柱的选择2 2、 凝胶的前处理凝胶的前处理a. 溶胀：溶胀：称取适量凝胶干粉，用约称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水倍蒸馏水浸泡浸泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。上层悬浮物及蒸馏水。b. 碱洗碱洗：用用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。后用蒸馏水洗至中性。c. 酸洗酸洗：用用0.5 M HCl 溶液浸泡半个小时，然后溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。用蒸馏水洗至中性。d. 平衡：平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液

20、用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同。与起始缓冲液相同。a. 将层析柱垂直固定，加入适将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。量溶剂排走空气。b. 将平衡好的凝胶搅匀，连续将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至倾入柱中，待其自然沉降至1/41/3高时打开下端出口，高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续侵入让溶剂慢慢流出，继续侵入凝胶至沉降到所需高度。装凝胶至沉降到所需高度。装柱时要注意操作压。柱时要注意操作压。c.用用3-5倍柱床体积的起始缓冲倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使交换剂充分平衡，液走柱，使交换剂充分平衡，柱床稳定。柱床稳定。3、 装柱装柱4 4、样品上柱、洗

21、脱、收、样品上柱、洗脱、收集集 a. 如图装好层析装置，打开下端出如图装好层析装置，打开下端出口，使溶液流出至刚好达到凝胶口，使溶液流出至刚好达到凝胶胶面胶面b. 沿柱壁缓慢加入沿柱壁缓慢加入2ml样品，打开下样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁。冲液洗涤柱壁。c.打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。d. 用自动部分收集器自动或手动收用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。集，合并同一高峰各管。5 5、凝胶的再生及保存、凝胶的再生及保存再生再生 用过的凝胶经用过

22、的凝胶经0.5M的的NaOH和和HCl溶液溶液分别处理后可以恢复其性能分别处理后可以恢复其性能凝胶的保存方法凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠叠氮钠 或或0.002%双氯苯双胍己烷双氯苯双胍己烷返回返回 如果被分离的样品中各个成分受溶液如果被分离的样品中各个成分受溶液pH的影响，有时带的影响，有时带正电荷，有时带负电荷，此时就可利用离子交换层析方法进行正电荷，有时带负电荷，此时就可利用离子交换层析方法进行样品的分离。样品的分离。 离子交换层析的固相是离子交换层析的固相是离子交换体离子交换体，包括离子交换树脂、，包括离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。 带

23、有带有SO3 或或COO基团，通常以基团，通常以SO3Na 或或COOH形形式出现的叫做阳离子交换基式出现的叫做阳离子交换基； 带有带有N（C2H5）基团通常以）基团通常以N（C2H5）Cl出现的叫做出现的叫做阴离子交换基阴离子交换基。(2) (2) 离子交换层析离子交换层析阳离子交换基阳离子交换基强酸性，聚苯乙烯树脂强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂阴离子交换基阴离子交换基强碱性，聚苯乙烯树脂强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨乙基纤维素弱碱性，二乙氨乙基纤维素：蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所：蛋白质是

24、由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH 值。值。当当pI pH时，蛋时，蛋白质带净正电荷。白质带净正电荷。已知蛋白已知蛋白X等电点为等电点为7，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。答案答案：建立阴离子交换柱，比如建立阴离子交换柱，比如Q-Sepharose。用。用pH8.5的缓的缓冲液平衡柱子，同时蛋白冲液平衡柱子，同时蛋白X溶解于溶解于pH8.5的缓冲液中，在此的缓冲液中，在此pH值下蛋白值下蛋白X带有负电，将

25、含有蛋白带有负电，将含有蛋白X的混合液上样，然后的混合液上样，然后用起始液冲洗，蛋白用起始液冲洗，蛋白X会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。阳阳离离子子交交换换层层析析过过程程离子交离子交换树脂换树脂蛋白质蛋白质高离子高离子强度洗强度洗脱液洗脱液洗高离子高离子强度洗强度洗脱液洗脱液洗加加样样平平衡衡液液洗洗收集收集返回返回(3) (3) 疏水层析疏水层析疏水层析疏水层析疏水层析疏水层析返回返回 依赖于蛋白质和它的配体（依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分）之间的相互作用来分离的。离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是配体通常指的是能与另

26、一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。 当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后的蛋白质首先被洗

27、脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高层析就可使蛋白质的纯化提高1000至至10000倍。倍。(4) (4) 亲和层析亲和层析亲和色谱颗粒亲和色谱颗粒具有极强的专一性具有极强的专一性含配体溶液含配体溶液收集目的蛋白收集目的蛋白 洗下未结合的蛋白洗下未结合的蛋白混合蛋白样混合蛋白样品品平衡液平衡液带有配体的树脂带有配体的树脂珠（或胶粒）珠（或胶粒）亲和层析过程亲和层析过程返回返回流动相极性固定相极性流动相极性固定相极性色色谱谱根根据据极极性性分分类类流动相极性固定相极性

28、流动相极性固定相极性反相色谱反相色谱正相色谱正相色谱返回返回固定相：烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS柱或C18柱就是最典型的代表，其极性很小。 适于分离非极性、弱极性离子型样品，是当今液相色谱的最主要分离模式。 固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。 适于分离脂荣、水溶性的极性、强极性化合物 当外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物常常聚集在一起形成大约 0.51m的折光小体，称包涵体。包涵体中大部分（占 50以上）是克隆表达的产物，这些产物的一级结构是正确的，但没有经过正确折叠形成天然的高级结构，因此没有生物学活性。 包涵体必须经过溶解复性才能得到具有生物学活性的目的蛋白。 1、什么是包涵体？、什么是包涵体？2、何谓复性？、何谓复性？复性是非折叠形式的变性蛋白在适当环境中折叠成活性蛋白的过程，它是从包涵体纯化重组活性蛋白过程中最关键、最复杂的步骤。 医学全在线( )