定向生物合成课件.ppt
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- 定向 生物 合成 课件
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1、 根据微生物药物的生物合成原理根据微生物药物的生物合成原理发现微生物新药的方法和途径发现微生物新药的方法和途径n通过非基因定向改变、基因定向改变,以通过非基因定向改变、基因定向改变,以及组合生物催化的技术,或是改变原有微及组合生物催化的技术,或是改变原有微生物药物的生物合成途径,或是对原有的生物药物的生物合成途径,或是对原有的微生物药物(或先导化合物和中间体)进微生物药物(或先导化合物和中间体)进行生物催化,以发现微生物新药行生物催化,以发现微生物新药 . .产生菌产生菌前体物质前体物质(1) (1) 诱变处理诱变处理化学化学修饰修饰天然产物天然产物衍生物衍生物天然产物天然产物天然中间物天然中
2、间物天然产物天然产物衍生物衍生物 化学修饰化学修饰 生物转化与生物转化与 组合生物转化组合生物转化 阻断或非阻阻断或非阻断菌株断菌株定向与杂交定向与杂交生物合成生物合成微生物或微生物或酶转化酶转化天然产物天然产物类似物类似物 杂合杂合 工程菌工程菌突变生物突变生物合成合成组合生物合成组合生物合成(2) (2) 基因操作基因操作天然产物天然产物类似物类似物(1)(2)天然产物天然产物类似物类似物微生物药物生物合成微生物药物生物合成与微生物新药发现的基本途径与微生物新药发现的基本途径 n通过非基因定向改变的方法包括:定向生通过非基因定向改变的方法包括:定向生物合成、杂交生物合成、突变生物合成,物合
3、成、杂交生物合成、突变生物合成,以及生物转化与组合生物转化;以及生物转化与组合生物转化;n基因定向改变,即为组合生物合成。基因定向改变,即为组合生物合成。 一、非遗传操作的定向生物合成一、非遗传操作的定向生物合成与微生物新药的发现与微生物新药的发现n已有的研究表明,在抗生素等次级代谢产物生已有的研究表明,在抗生素等次级代谢产物生物合成中酶底物的特异性足以使结构相关的物合成中酶底物的特异性足以使结构相关的代谢产物在其发酵液中积累;代谢产物在其发酵液中积累;n但由于生物合成酶的底物专一性较低(宽泛但由于生物合成酶的底物专一性较低(宽泛性),其野生型菌株或阻断突变株的发酵过程性),其野生型菌株或阻断
4、突变株的发酵过程中添加一些已知结构类似物作为前体物质,可中添加一些已知结构类似物作为前体物质,可以产生含有与这种已知结构类似的新衍生物;以产生含有与这种已知结构类似的新衍生物;n这种获得新次级代谢产物的途径,可以被称之这种获得新次级代谢产物的途径,可以被称之为非遗传操作的定向生物合成为非遗传操作的定向生物合成 (directed (directed biosynthesis)biosynthesis)。 前体(前体(precursorprecursor)n即在微生物培养过程中,外源添加的某一即在微生物培养过程中,外源添加的某一化学物质,通过微生物的代谢,能够将其化学物质,通过微生物的代谢,能够
5、将其整体地或部分地整合到某一特定的次级代整体地或部分地整合到某一特定的次级代谢产物的分子中去的化合物,如苯乙酸或谢产物的分子中去的化合物,如苯乙酸或苯乙酰胺及苯氧乙酸等)。苯乙酰胺及苯氧乙酸等)。非遗传操作的定向生物合成非遗传操作的定向生物合成n这种在发酵过程中通过添加某种特定的前体物质,这种在发酵过程中通过添加某种特定的前体物质,使微生物的生物合成朝着将这些前体物质掺入到使微生物的生物合成朝着将这些前体物质掺入到产物分子的某一特定部位而产生过量的含有这种产物分子的某一特定部位而产生过量的含有这种前体的产物的方法,即为非遗传操作的定向生物前体的产物的方法,即为非遗传操作的定向生物合成。合成。n
6、其基本原理是由于参与这些反应的生物合成酶的其基本原理是由于参与这些反应的生物合成酶的底物专一性较差,而能使外源添加的某些前体物底物专一性较差,而能使外源添加的某些前体物质竞争性地掺入到特定产物的分子中去。质竞争性地掺入到特定产物的分子中去。 定向生物合成与微生物新药的发现定向生物合成与微生物新药的发现n次级代谢产物合成酶的特点:次级代谢产物合成酶的特点:是一个由一系列酶参与催化的多酶体系。是一个由一系列酶参与催化的多酶体系。参与催化反应的酶的底物专一性比初级代参与催化反应的酶的底物专一性比初级代谢合成酶要差。谢合成酶要差。应用实例应用实例n应用非遗传操作定向生物合成的方法能够应用非遗传操作定向
7、生物合成的方法能够制备获得许多新的抗生素,其中目前已进制备获得许多新的抗生素,其中目前已进行工业化生产的有:行工业化生产的有:n青霉素青霉素G G和和V V;n培罗霉素;培罗霉素;n四环素和金霉素等。四环素和金霉素等。 青霉素定向生物合成青霉素定向生物合成.序号序号侧侧 链链 R R学学 名名俗俗 名名1 1对羟基苄青霉素对羟基苄青霉素青霉素青霉素X X2 2苄青霉素苄青霉素青霉素青霉素G G3 3戊烯戊烯22青霉素青霉素青霉素青霉素F F4 4戊青霉素戊青霉素青霉素二氢青霉素二氢F F5 5庚青霉素庚青霉素青霉素青霉素K K6 6丙烯巯甲基青霉素丙烯巯甲基青霉素青霉素青霉素O O7 7苯氧甲
8、基青霉素苯氧甲基青霉素青霉素青霉素V V8 84 4氨基氨基4 4羧基羧基丁基青霉素丁基青霉素青霉素青霉素N NNCHSCCHCH3CH3HCCNHOCRCOOHONCHSCCHCH3CH3HCCH2NOCOOH青霉素和青霉素和6APA分子结构及各种天然青霉素的结构与名称分子结构及各种天然青霉素的结构与名称青霉素分子的化学结构青霉素分子的化学结构6APA的化学结构的化学结构各种天然青霉素具有的侧链和名称各种天然青霉素具有的侧链和名称HOCH2CH2H3CCH2CHCHCH2H3C(CH2)3CH2H3C(CH2)5CH2H2CCHCH2SCH2CH3OCH(CH2)2CH2NH2HOOC培罗霉
9、素定向生物合成培罗霉素定向生物合成.培罗霉素定向生物合成培罗霉素定向生物合成可结合进入可结合进入BLMBLM的末端胺基部分的非天然胺基化合物的末端胺基部分的非天然胺基化合物.H2NCH2CH2NH2H2NCH2CHNH2CH3H2N(CH2)3NHCH3H2N(CH2)3N(CH3)2H2N(CH2)3N(CH3)2X-H2N(CH2)3NH(CH2)3N(CH3)2H2N(CH2)3N(CH2)3NH2CH3H2N(CH2)3NHCHCH3(CH2)2NH2H2N(CH2)3NH(CH2)3OHH2N(CH2)3NH(CH2)3OCH3H2N(CH2)3NH2N(CH2)3NH2N(CH2)
10、3NOH2N(CH2)2NNHH2N(CH2)3NHCH2*H2N(CH2)3NHCHCH3H2NCH2CH2NH2H2N(CH2)3NH* PEP的末端胺基的末端胺基四环类抗生素的定向生物合成四环类抗生素的定向生物合成R5R6R76去甲基四环素HHH(1)7氯6去甲基四环素HHCl(2)四环素HCH3H(3)5羟基四环素(土霉素)OHCH3H(4)7氯四环素(金霉素)HCH3Cl(5)OHR7OOHNH2OOOHHON(CH3)2HR6HR5HH789101166a10a55a11a44a12a12312微生物发酵产生的一些四环素类抗生素微生物发酵产生的一些四环素类抗生素四环类抗生素的定向生
11、物合成四环类抗生素的定向生物合成 在生产在生产金霉素金霉素时需添加氯化物作为前体,时需添加氯化物作为前体,而当生产而当生产四环素四环素时,则必须要在发酵培养时,则必须要在发酵培养基中添加氯离子抑制剂,如溴化物或基中添加氯离子抑制剂,如溴化物或M-M-促促进剂等,从而抑制金霉素的合成而得到四进剂等,从而抑制金霉素的合成而得到四环素产物。环素产物。 另外,用金色链霉菌在发酵的金霉素过程另外,用金色链霉菌在发酵的金霉素过程中添加适量的甲基化反应抑制剂如磺胺嘧中添加适量的甲基化反应抑制剂如磺胺嘧啶钠,能够获得啶钠,能够获得去甲基金霉素。去甲基金霉素。 杜拉克丁的定向生物合成杜拉克丁的定向生物合成OH3
12、COOHOOH3CH3COOOOCH3OH3COYXCH3R2OCH3R1OH1754222325CH3杜拉克丁的定向生物合成杜拉克丁的定向生物合成组分R1R2XY备注A1aA1bA2aA2bB1aB2bB2aB2bOCH3OCH3OCH3OCH3OHOHOHOHCH=CHCH=CHCH2CH(OH)CH2CH(OH)CH=CHCH=CHCH2CH(OH)CH2CH(OH)25-环己烷基环己烷基-B225-环己烷基环己烷基-B1OHOHCH2CH(OH)CH=CH外源添加环外源添加环己烷羧酸钠己烷羧酸钠CH3C2H5CH3C2H5CH3C2H5CH3C2H5CH3CH3CH3CH3CH3CH3
13、CH3CH3非基因改变定向生物合成的研究进展非基因改变定向生物合成的研究进展 尽管近年来基因改变的定向生物合成尽管近年来基因改变的定向生物合成发展很快,但利用非遗传操作定向生物合发展很快,但利用非遗传操作定向生物合成原理寻找新的生理活性物质的研究还在成原理寻找新的生理活性物质的研究还在不少实验室继续进行,特别是对一些肽类不少实验室继续进行,特别是对一些肽类如如环孢菌素环孢菌素A A、aureobasidinsaureobasidins及糖肽类如及糖肽类如替考拉宁产生菌替考拉宁产生菌的定向生物合成研究取得的定向生物合成研究取得了很大的进展。了很大的进展。二、添加外源酶抑制剂的杂交生物合成二、添加
14、外源酶抑制剂的杂交生物合成与微生物新药的发现与微生物新药的发现n 杂交生物全成(杂交生物全成(hybrid biosynthesishybrid biosynthesis)似乎可以)似乎可以理解为是理解为是一种一种“强化强化”的非遗传定向生物合成的非遗传定向生物合成,如,如在苦霉素产生菌生酵过程中添加聚乙酰途径中在苦霉素产生菌生酵过程中添加聚乙酰途径中-酮酯酰基合成酶抑制剂酮酯酰基合成酶抑制剂线兰菌素线兰菌素(cerulenin(cerulenin) ),使其失去合成链霉素大环内酯苷元使其失去合成链霉素大环内酯苷元(picronolide(picronolide) )的能力而只能合成糖基。同时
15、在发酵过程中添加泰的能力而只能合成糖基。同时在发酵过程中添加泰乐菌素大环内酯苷元乐菌素大环内酯苷元(protylonolide(protylonolide) ),使其与苦,使其与苦霉素生产菌产生的糖基结合,得到一种被称之为霉素生产菌产生的糖基结合,得到一种被称之为M4365G1M4365G1的杂合抗生素的杂合抗生素(hybrid antibiotic)(hybrid antibiotic)。 杂交生物合成与微生物新药的发现杂交生物合成与微生物新药的发现OHOMeNHOMeMe葡萄糖1CH3COOH6CH3CH2COOHMeMeOOOHMeOHMeMeOMe2CH3COOH5CH3CH2COHC
16、H3CH2CH2COOHS.fradia KA427 NO.261ProtylonolidePicronolideOMeOMeHOMeOHMeMeDesosamineOMeNHOMeMeOMeOMeHOMeMeMeOOMeNHOMeMeMeMeOOOHMeOMeMeOMePicromycin DDesosaminyl Protylonolide(M4365G1) 在浅蓝菌素存在下,用苦味霉素产生菌(在浅蓝菌素存在下,用苦味霉素产生菌(S.sp.AM4900) 与与protylonolide 杂交生物合成杂交生物合成M4365G杂交生物合成产物工业化的可能性杂交生物合成产物工业化的可能性 尽管通
17、过杂交生物合成能够得到尽管通过杂交生物合成能够得到一些新的抗生素,但由于所添加的一些新的抗生素,但由于所添加的浅浅蓝菌素蓝菌素本身就是一种昂贵的抗生素,本身就是一种昂贵的抗生素,再则所添加的再则所添加的苷元的结构苷元的结构受到限制,受到限制,所以这种方法似乎没有很大的实际意所以这种方法似乎没有很大的实际意义。义。 三、非定向诱变的突变生物合成三、非定向诱变的突变生物合成与微生物新药的发现与微生物新药的发现n突变生物合成(突变生物合成(mutational biosynthesismutational biosynthesis):):n突变生物合成是指野生型产生菌经化学或物理等突变生物合成是指野
18、生型产生菌经化学或物理等因素诱变处理后,丧失合成原来次级代谢产物的因素诱变处理后,丧失合成原来次级代谢产物的能力而成为阻断突变株,然后在发酵培养阻断突能力而成为阻断突变株,然后在发酵培养阻断突变株时添加某种外源物质,参与生物合成以获得变株时添加某种外源物质,参与生物合成以获得新的次级代谢产物的过程。新的次级代谢产物的过程。n另外,突变生物合成也包括由于突变而引起产生另外,突变生物合成也包括由于突变而引起产生新的次级代谢产物。新的次级代谢产物。突变生物合成原理突变生物合成原理阻断突变株的类型阻断突变株的类型营养缺陷型突变株:营养缺陷型突变株: 由于编码菌体生长之必须的酶的基因发生了突由于编码菌体
19、生长之必须的酶的基因发生了突变,而使菌体不能生长,导致不能合成次级代变,而使菌体不能生长,导致不能合成次级代谢产物。因此,这类突变株也可以称为初级代谢产物。因此,这类突变株也可以称为初级代谢阻断突变株。谢阻断突变株。独需型突变株:独需型突变株: 这种突变株的生长和初级代谢正常,但由于编这种突变株的生长和初级代谢正常,但由于编码次级代谢产物合成的某一基因发生突变,而码次级代谢产物合成的某一基因发生突变,而使丧失了合成次级代谢产物的能力。这是突变使丧失了合成次级代谢产物的能力。这是突变生物合成所需要的突变株。生物合成所需要的突变株。双重阻断突变株:双重阻断突变株: 即突变既发生在编码初级代谢酶的基
20、因上,也即突变既发生在编码初级代谢酶的基因上,也发生在编码次级代谢酶的基因上。发生在编码次级代谢酶的基因上。突变生物合成与微生物新药发现突变生物合成与微生物新药发现.野生型产生菌野生型产生菌独需型突变株独需型突变株AB正常途径正常途径某抗生素某抗生素阻断变株阻断变株A阻断变株阻断变株BAB+BA+ABABA,B为某一抗生素分子结构的两个部分为某一抗生素分子结构的两个部分AB为发酵液培养时阻断变株的代谢产物为发酵液培养时阻断变株的代谢产物BA为发酵培养时添加的为发酵培养时添加的AB的结构类似物的结构类似物ABAB即为新的杂合抗生素即为新的杂合抗生素利用独需型突变株合成产生新抗生素的基本原理利用独
21、需型突变株合成产生新抗生素的基本原理突变生物合成的突变生物合成的基本流程基本流程.出发菌株的选择出发菌株的选择诱变处理诱变处理阻断突变株筛选阻断突变株筛选琼脂块法选择琼脂块法选择有生理活力的突变株有生理活力的突变株无生理活力的突变株无生理活力的突变株摇瓶复筛摇瓶复筛有生理活力的突变株有生理活力的突变株无生理活力的突变株无生理活力的突变株区段合成产物,连接区段合成产物,连接酶等生化特性的研究酶等生化特性的研究有区段合成产物、无有区段合成产物、无连接酶等活性的突变连接酶等活性的突变株株有区段产物有区段产物A有连接有连接酶等活性的突变株酶等活性的突变株有区段产物有区段产物B有连接有连接酶等活性的突变
22、株酶等活性的突变株发酵培养发酵培养添加结构类似物添加结构类似物A或或B样品收集样品收集TLC、HPLC检测及制备检测及制备结构检测结构检测突变生物合成产生的新抗生素突变生物合成产生的新抗生素.菌种菌种抗生素抗生素特殊营养特殊营养增补物增补物新抗生素新抗生素伊尼奥小单孢菌伊尼奥小单孢菌西梭霉素西梭霉素DOS链霉胺等链霉胺等突变霉素突变霉素1等等绛红小单孢菌绛红小单孢菌庆大霉素庆大霉素DOS链霉胺等链霉胺等2羟基羟基GM等等红霉素链霉菌红霉素链霉菌红霉素红霉素Erythronolide8,8 deoxyoleanolie未鉴别未鉴别弗氏链霉菌弗氏链霉菌新霉素新霉素DOS链霉胍等链霉胍等杂交霉素杂交
23、霉素A,B加利利链霉菌加利利链霉菌阿克拉霉素阿克拉霉素阿克拉酮阿克拉酮紫红霉酮等紫红霉酮等11羟基阿克拉霉羟基阿克拉霉素素A灰色链霉菌灰色链霉菌链霉素链霉素紫红霉酮等紫红霉酮等2脱氧链霉胍脱氧链霉胍streptomutin A卡那霉素链霉菌卡那霉素链霉菌卡那霉素卡那霉素DOS1N甲基甲基DOS等等1N甲基甲基GM等等雪白链霉菌雪白链霉菌新生霉素新生霉素氨基香豆氨基香豆氨基香豆素同系物氨基香豆素同系物未鉴明未鉴明核糖苷链霉菌核糖苷链霉菌核糖霉素核糖霉素DOS1N甲基甲基DOS等等1N甲基甲基RSMC等等普拉特链霉菌普拉特链霉菌普拉特霉素普拉特霉素PlatenolideNarbonolide5Om
24、ycaminosyl narbonolide龟裂链霉菌龟裂链霉菌巴龙霉素巴龙霉素DOS链霉胍链霉胍杂交霉素杂交霉素C巴龙链霉菌巴龙链霉菌尼可霉素尼可霉素尿嘧啶尿嘧啶嘧啶嘧啶尼可霉素尼可霉素Z等等唐德链霉菌唐德链霉菌红霉素生物红霉素生物合成途径合成途径.丙酮丙酮CoA丙酰丙酰SACP甲基丙二酰甲基丙二酰甲基丙二酰甲基丙二酰SACP丙酰丙酰丙酰丙酰SACP聚酮体途径聚酮体途径6脱氧红霉内脂脱氧红霉内脂B红霉内脂红霉内脂BTDPL碳霉糖碳霉糖 葡萄糖葡萄糖TDPD葡萄糖葡萄糖3O碳霉糖基红霉内脂碳霉糖基红霉内脂TDP脱氧氨基己糖脱氧氨基己糖 红霉素红霉素D红霉素红霉素C红霉素红霉素A红霉素红霉素E红
25、霉素红霉素B缩合酶缩合酶突变株产生的突变株产生的新蒽环类抗生素新蒽环类抗生素.OOORR1OHOHR2NH2OHH3C1234567891011121234564OCHOCH2CHOHCH3CHCH3CH2OHRR1R2道若霉素(原株产生)道若霉素(原株产生)OCHOCH3 3COCHCOCH3 3OHOH亚德里亚霉素(变株产生)亚德里亚霉素(变株产生)OCHOCH3 3COCHCOCH2 2OHOHOHOH1313双氢道若霉素(变株产生)双氢道若霉素(变株产生)OCHOCH3 3CHOHCHCHOHCH3 3OHOH1313双氢洋红霉素双氢洋红霉素OHOHCOCHCOCH3 3OHOH111
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