实时荧光定量PCR技术(1)课件.ppt

1、ReportExport Department Export Management Export Department Export ManExport Department Export Management Export Department Export Management EExport Department Export Management Export Department Export Management Exp实时荧光定量PCR技术Report2011内容概要1荧光定量PCR的基本概念1荧光定量PCR的标记方法1荧光定量PCR解析方法1 SYBR法实验流程及注意事项常规P

2、CR与实时荧光定量PCR常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析荧光定量PCR常用的三个概念 扩增曲线 荧光阈值 CT值Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLgliner phase平台期荧光基团荧光检测元件扩增曲线Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）BaselineLgliner phase1 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）1 荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准

3、偏差的10倍1 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段1 真正的信号:荧光信号超过阈值Threshold荧光阈值平台期平台期Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）Ct value Ct值Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性Ct值的数学原理理想的PCR反应：Xn=X02n非理想的PCR反应：Xn=X0 (1+Ex)n方程式两边同时取对数得: log Xn=log X0 (1+Ex)n整理方程式得: log X0= (- l

4、og (1+Ex) )n+ log Xn将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得： log X0= (- log(1+Ex) ) C(t)+ log Xc(t)初始浓度的对数与循环数呈线性关系n：扩增反应的循环次数Xn：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率Cycle numberCk 104Ck 102SampleLg of DNA concentration0 模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。0 Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。Ct值与模板起始量的关系qPCR 常用实验方法p 简单p 成本较低p 适用于多重PCRp 特异性较好p

5、 可进行SNP检测p 特异性非常好ABCSYBR Green I 染料法原理 SYBR Green I 是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料SYBR Green I 染料法作用机理问题点：问题点： SYBR Green I与双链与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如进行结合后散发荧光，因此如 果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将 同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。SYBR Green I染料法问题点与关键点关键点：关键点： 设计合适引物，防止非特异性扩增！设

6、计合适引物，防止非特异性扩增！原始图谱原始图谱对数图谱对数图谱SYBR Green I 染料法融解曲线融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确SYBR Green I染料法融解曲线% 使用方便，不必设计复杂 探针% 具有价格优势优 点% 无模板特异性% 对引物特异性要求较高% 不能进行多重定量% 灵敏度相对较低缺 点SYBR Green I 染料法优缺点Taqman探针法原理+ 5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 + 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)+ 探针完整，R发射的荧光能量被

7、Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光+ Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针Taqman探针法工作机理1、引物、探针的设计：、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段80CT18-30 cyclesR20.95Slope(-3.58)-(-3.10)Efficiency90%-110%NTCCT(NTC) =0CT(NTC)CT(样品)5NRCCT(NTC) =0CT(NTC)CT(样品)5MIQE qPCR国际标准1. 提出发表文章时所要求的最低限度的必要信息标准。2. 对QPCR的术语；概念；研究与临

8、床应用；样本的采集、处理和制备；核酸的质量控制；反转录；QPCR过程；数据分析等方面的操作标准和规范都做了详尽的阐述。ReportExport Department Export Management Export Department Export ManExport Department Export Management Export Department Export Management EExport Department Export Management Export Department Export Management Export Department Export Management Export Department Export Management Export Department Export Management Export Department Export Management ExpReport