天然产物抗菌、抗病毒活性的原理与评价方法课件.ppt
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1、天然产物天然产物抗菌抗菌活性的原理与评价方法活性的原理与评价方法天然产物天然产物抗病毒抗病毒活性的原理与评价方法活性的原理与评价方法天然产物的抗菌活性与评价天然产物的抗菌活性与评价 抗菌谱抗菌谱(antibacterial spectrum):药物抑制或杀灭病原微生物的范围称抗菌谱。 抗菌活性抗菌活性:指药物抑制或杀灭病原微生物的能力。能够抑制培养基内细菌生长的最低浓度称最低抑菌浓度(MIC);能够杀灭培养基内细菌的最低浓度称最低杀菌浓度(MBC) 。 抑菌剂抑菌剂/杀菌剂杀菌剂: 抗生素后效应抗生素后效应(postantibiotic effect,PAE)是抗菌药物对细菌特有的效应。是抗菌
2、药物对细菌特有的效应。指抗菌药物与细菌短暂接触,指抗菌药物与细菌短暂接触,当药物浓度下降至最低抑菌浓当药物浓度下降至最低抑菌浓度以下甚至消除后,细菌生长度以下甚至消除后,细菌生长仍受到持续抑制的效应。一般仍受到持续抑制的效应。一般讲,讲,PAE较长的药物,其抗菌较长的药物,其抗菌活性较强,可适当延长用药时活性较强,可适当延长用药时间间隔,而疗效不降。间间隔,而疗效不降。理想抗菌药物:对病原体有高度选择性;不易产生耐药理想抗菌药物:对病原体有高度选择性;不易产生耐药性;对人体毒性低;能增强机体的防御机能。性;对人体毒性低;能增强机体的防御机能。 抑制细菌细胞壁的合成抑制细菌细胞壁的合成 如-内酰
3、胺类万古霉素等。 影响细胞膜通透性影响细胞膜通透性 如多粘菌素、两性霉素B等。 抑制蛋白质合成抑制蛋白质合成 如氨基甙类、四环素类、红霉素、氯霉素等。 抑制核酸代谢抑制核酸代谢 如利福平、喹诺酮类。 影响叶酸代谢影响叶酸代谢 如磺胺类、甲氧苄啶等。 耐药性又称抗药性,系细菌与药物多次接触系细菌与药物多次接触后,对药物敏感性下降甚至消失。后,对药物敏感性下降甚至消失。细菌产生耐药性的途径有: 产生灭活酶产生灭活酶 改变药物靶位结构改变药物靶位结构 降低胞浆膜通透性降低胞浆膜通透性 改变代谢途径改变代谢途径。细菌产生抗生素灭细菌产生抗生素灭活酶,从而使抗菌活酶,从而使抗菌药失去抗菌活性。药失去抗菌
4、活性。灭活酶有两种:一灭活酶有两种:一种为水解酶,另一种为水解酶,另一种为钝化酶种为钝化酶细菌体内靶位结构的细菌体内靶位结构的改变,细菌体内药物改变,细菌体内药物受体和靶酶蛋白质构受体和靶酶蛋白质构型发生变化,不利于型发生变化,不利于抗菌药物结合抗菌药物结合细菌细胞膜的通细菌细胞膜的通透性发生改变,透性发生改变,使抗生素不易进使抗生素不易进入,从而不能发入,从而不能发挥疗效挥疗效细菌改变自细菌改变自身代谢途径身代谢途径或对药物具或对药物具有拮抗作用有拮抗作用的底物浓度的底物浓度增加。增加。 具有抗菌活性的天然产物组分具有抗菌活性的天然产物组分萜类萜类(异戊二烯聚合物异戊二烯聚合物): 影响细菌
5、的呼吸作用及细胞膜功能影响细菌的呼吸作用及细胞膜功能, 从而起从而起到抑菌的作用。到抑菌的作用。黄酮化合物特别是异黄酮化合物对黄酮化合物特别是异黄酮化合物对金黄色葡萄球菌、柠檬色葡萄球金黄色葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌及枯草杆菌菌及枯草杆菌具有很强的抗菌作用。广谱抗菌活性。具有很强的抗菌作用。广谱抗菌活性。生物碱对大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌、枯草杆菌和白色葡萄球生物碱对大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌、枯草杆菌和白色葡萄球菌的生长均有明显的抑制作用。菌的生长均有明显的抑制作用。苷类、皂甙、醌类、香豆素、木脂素、芪类、酯类、酚类、醛类、苷类、皂甙、醌类、香豆素、木脂素、芪类、酯类、酚类、醛类、醇类、甾
6、类、有机酸及精油类等化合物。醇类、甾类、有机酸及精油类等化合物。体外体外抗菌活性评价抗菌活性评价药物活性评价的第一步药物活性评价的第一步说明药物对细菌的直接抑制或杀菌作用说明药物对细菌的直接抑制或杀菌作用仅用于测定药物对细菌固有的敏感性,以仅用于测定药物对细菌固有的敏感性,以最小最小抑菌抑菌或或最小杀菌浓度最小杀菌浓度为指标。受制剂纯度的影为指标。受制剂纯度的影响较大。响较大。 实验菌株的选择实验菌株的选择金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、化脓性链球菌、粪链球菌、肺炎球菌、化脓性链球菌、粪链球菌(好氧、好氧、革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌)大肠杆菌大肠杆菌、肺炎杆菌、普通变形杆菌、肺炎杆菌、普
7、通变形杆菌、绿脓杆菌绿脓杆菌、伤寒杆伤寒杆菌菌、痢疾杆菌痢疾杆菌、淋球菌(、淋球菌(好氧、好氧、革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌)脆弱类杆菌、坏死梭形杆菌、溶组织梭状芽孢杆菌(脆弱类杆菌、坏死梭形杆菌、溶组织梭状芽孢杆菌(厌氧厌氧菌菌) 待测样品的制备要求待测样品的制备要求注意无机离子浓度、注意无机离子浓度、pHpH、干扰物质、鞣质和蛋白质对结干扰物质、鞣质和蛋白质对结果的影响。果的影响。 体外抗菌实验方法体外抗菌实验方法纸片扩散法、琼脂稀释法、肉汤稀释法等。纸片扩散法、琼脂稀释法、肉汤稀释法等。 观察指标观察指标细菌生长(菌落生长)、细菌含量(浊度)、活菌(活细菌生长(菌落生长)、细菌含量(浊度)、
8、活菌(活组织光密度)。组织光密度)。 纸片扩散法纸片扩散法抑菌圈直径的大小可以用来表征抑菌药液效果的显著与否。一般是抑菌圈直径的大小可以用来表征抑菌药液效果的显著与否。一般是将供试菌先接种在培养基表面,再挖小孔或放置钢圈,并在孔内加将供试菌先接种在培养基表面,再挖小孔或放置钢圈,并在孔内加抑菌液,药液便向周围培养基扩散。培养后,有抗菌作用的药液就抑菌液,药液便向周围培养基扩散。培养后,有抗菌作用的药液就会在小孔周围形成清楚的抑菌圈。会在小孔周围形成清楚的抑菌圈。菌种转接菌种转接:琼脂平板:琼脂平板肉汤液体培养基肉汤液体培养基肉汤琼脂培养基画线接种。肉汤琼脂培养基画线接种。待测样品给药待测样品给
9、药:用滤纸片沾定量的药液,放置在肉汤琼脂培养基表:用滤纸片沾定量的药液,放置在肉汤琼脂培养基表面,轻压纸片与培养基适当接触。面,轻压纸片与培养基适当接触。 孵育与检测孵育与检测:3737 C ,18-24hr。测量抑菌圈的直径。测量抑菌圈的直径。 肉汤稀释法肉汤稀释法待测样品的配制待测样品的配制:待测药品用肉汤培养基作对倍系列稀释。:待测药品用肉汤培养基作对倍系列稀释。接种与孵育接种与孵育: 菌液与含药肉汤培养基混匀,菌液与含药肉汤培养基混匀,3737 C ,18-24hr。检测检测:1)以浊度为检查试管中有无细菌生长,以不显示浊以浊度为检查试管中有无细菌生长,以不显示浊度、细菌未生长的那一管
10、的药液稀释度作为度、细菌未生长的那一管的药液稀释度作为最小抑菌浓度最小抑菌浓度MIC (minimal inhibitory concentration)。2)将无肉眼可见生将无肉眼可见生长的试管中肉汤画线接种于琼脂平板,长的试管中肉汤画线接种于琼脂平板, 3737 C 18hr孵育后以孵育后以平板上菌落生长数平板上菌落生长数10个的药物浓度作为个的药物浓度作为最低杀菌浓度最低杀菌浓度MBC (minimal bactericidal concentration)。对厌氧菌抗菌作用的体外评价对厌氧菌抗菌作用的体外评价类似肉汤稀释法,用特殊营养培养,接种菌量类似肉汤稀释法,用特殊营养培养,接种菌
11、量宜大,厌氧培养。宜大,厌氧培养。体外抗菌活性的其它方法体外抗菌活性的其它方法平皿打洞法、挖沟灌药法、杯管法、滤纸条法平皿打洞法、挖沟灌药法、杯管法、滤纸条法等。等。 陆志科陆志科, 谢碧霞谢碧霞. .不同种竹叶的化学成分及其提取物抗菌活性不同种竹叶的化学成分及其提取物抗菌活性的研究的研究. .西北林学院学报西北林学院学报2005, 20 (1) : 4952菌液制备菌液制备:菌种活化后挑取菌苔:菌种活化后挑取菌苔, ,用无菌水分别制成含菌数约用无菌水分别制成含菌数约10106 6 F F/mLmL 的菌悬液。的菌悬液。给药给药:滤纸片法。滤纸片法。用打孔器将滤纸打成若干直径为用打孔器将滤纸打
12、成若干直径为6 6 mmmm的圆形滤纸片的圆形滤纸片, ,经经干热灭菌后干热灭菌后, ,浸在竹叶提取物水溶液中。分别将浸在竹叶提取物水溶液中。分别将0. 1 0. 1 mLmL供试菌悬液或孢供试菌悬液或孢子悬液子悬液加入到琼脂平板,加入到琼脂平板,然后用无菌涂布器涂布均匀。再用无菌摄子夹然后用无菌涂布器涂布均匀。再用无菌摄子夹取浸有竹叶提取物的滤纸片贴在上述各种含菌平皿上取浸有竹叶提取物的滤纸片贴在上述各种含菌平皿上, ,滤纸片在每个平皿滤纸片在每个平皿内间隔一定的距离贴内间隔一定的距离贴3 3片片, ,并用浸有无菌水的滤纸片做对照。然后将各皿并用浸有无菌水的滤纸片做对照。然后将各皿放入各种菌
13、适宜的温度培养。取出后放入各种菌适宜的温度培养。取出后, ,测量其抑菌圈直径的大小。测量其抑菌圈直径的大小。 何峰何峰, 余龙江,杨英余龙江,杨英, 周蓬蓬周蓬蓬.链霉菌链霉菌H03 发酵液提取物的抗菌活性研发酵液提取物的抗菌活性研究究,微生物学杂志微生物学杂志2005 年年11 月第月第25 卷第卷第6 期期 最小抑菌浓度最小抑菌浓度MIC 的测定:采用二倍稀释法测定提取物的的测定:采用二倍稀释法测定提取物的MIC。 将配制好的将配制好的PDA 培养基和培养基和LB 培养基分装至试管中培养基分装至试管中,每支试管每支试管2 mL ,每每9 支为一组支为一组,灭菌后备用。取上述样品溶液灭菌后备
14、用。取上述样品溶液(2. 0 mg/ mL) 2 mL 于每组第于每组第1 支试管中支试管中,摇匀后从第摇匀后从第1 支试管中取支试管中取2 mL 至第至第2 支试管中支试管中,如此稀释直至如此稀释直至第第8 支试管支试管,这样每操作这样每操作1次次,提取物就被稀释提取物就被稀释1 倍倍,一共被稀释了一共被稀释了8 次次,形成形成了了8 个浓度梯度个浓度梯度,试管中提取物对应的浓度分别为试管中提取物对应的浓度分别为1. 0 、0. 5 、0. 25 、0. 125 、0. 062 5 、0. 031 25 、0. 015 625 、0. 007 825 (单位均为单位均为mg/ mL) 。第。
15、第9支试管为对照支试管为对照,不加样品只加指示菌液。然后在含不加样品只加指示菌液。然后在含LB 培养基的培养基的各组试管中分别加入常见病原细菌各组试管中分别加入常见病原细菌0. 2 mL ,其中各种菌液的接种浓度约其中各种菌液的接种浓度约为为107 108 CFU/ mL 。最后将试管置于。最后将试管置于28 培养箱中培养。细菌培养培养箱中培养。细菌培养24 h 、真菌培养、真菌培养72 h 后观察。后观察。 动物动物体内体内抗菌活性评价抗菌活性评价用以观察宿主、细菌、药物三者相互作用的动态过程,用以观察宿主、细菌、药物三者相互作用的动态过程,药物通过机体代谢,其中间产物或终产物可能具有抑药物
16、通过机体代谢,其中间产物或终产物可能具有抑菌或杀菌作用。菌或杀菌作用。药物对感染动物的预防和治疗作用,不仅能反映药物药物对感染动物的预防和治疗作用,不仅能反映药物对细菌的固有直接作用,还能反映药物对机体反应性对细菌的固有直接作用,还能反映药物对机体反应性的影响。是判定有无临床价值的主要指标。的影响。是判定有无临床价值的主要指标。试验结果与动物的种属、菌株的毒力、接种菌量和感试验结果与动物的种属、菌株的毒力、接种菌量和感染途径密切相关。染途径密切相关。 实验动物的选取实验动物的选取一般用小鼠,观察细菌全身致死性感染的死亡或存活情况。一般用小鼠,观察细菌全身致死性感染的死亡或存活情况。特殊的动物模
17、型需要其它的动物,如家兔的脑膜炎、感染性特殊的动物模型需要其它的动物,如家兔的脑膜炎、感染性角膜炎、大鼠的肾炎等。角膜炎、大鼠的肾炎等。在小鼠的致死性感染实验中,可结合多种致敏措施,如用在小鼠的致死性感染实验中,可结合多种致敏措施,如用3的猪胃粘蛋白将细菌配制成悬浮液后腹腔注射的猪胃粘蛋白将细菌配制成悬浮液后腹腔注射0.5ml/鼠;鼠;感染前给实验动物注射的可松以降低机体抵抗力。感染前给实验动物注射的可松以降低机体抵抗力。 实验菌种实验菌种小鼠全身性感染模型应选用对人致病力强的菌株,可通过小鼠全身性感染模型应选用对人致病力强的菌株,可通过动物体内传代而增强或保持其毒力。动物体内传代而增强或保持
18、其毒力。若用粘蛋白增敏,则可取若用粘蛋白增敏,则可取1 1份肉汤稀释菌液与份肉汤稀释菌液与9 9份份5 5粘蛋白粘蛋白混合,但须同时作单独粘蛋白对照,对照小鼠不得有死亡。混合,但须同时作单独粘蛋白对照,对照小鼠不得有死亡。记录各剂量组小鼠于两周内的死亡数,引起动物全部死亡记录各剂量组小鼠于两周内的死亡数,引起动物全部死亡的最低细菌量为最小致死量(的最低细菌量为最小致死量(MLD) 给药给药不宜注射给药,一般应灌服给药。不宜注射给药,一般应灌服给药。剂量不足,难以达到体内抗菌效果,剂量过大,引起毒性并剂量不足,难以达到体内抗菌效果,剂量过大,引起毒性并降低机体抵抗力,需同时给予数个剂量以观察药效
19、。降低机体抵抗力,需同时给予数个剂量以观察药效。以预防性给药为主,即连续给药数日后再行感染,并连续给以预防性给药为主,即连续给药数日后再行感染,并连续给药至感染后数日。药至感染后数日。 刘明亮刘明亮, ,郭慧元郭慧元. .妥舒沙星前药的合成及其体内抗菌活性妥舒沙星前药的合成及其体内抗菌活性. .中中国抗生素杂志国抗生素杂志, ,2004 , , 29 ( (10 ):590-597):590-597试验用药均用试验用药均用0.9% 生理食盐水配制生理食盐水配制, 每个化合物均设每个化合物均设5 个剂个剂量组。将实验动物按性别、体重随机分组量组。将实验动物按性别、体重随机分组, 每组每组10 只
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