高效液相色谱结果分析课件.pptx

1、高效液相色谱高效液相色谱结果处理与分析结果处理与分析第二部分第二部分(High performance Liquid Chromatography，HPLC)一、色谱数据处理一、色谱数据处理二、色谱图二、色谱图三、色谱图名词术语三、色谱图名词术语四、色谱峰检测四、色谱峰检测五、五、HPLCHPLC测定步骤与内容测定步骤与内容一一. .色谱数据处理色谱数据处理检测器检测器记录仪记录仪积分仪积分仪色谱工作站色谱工作站色谱仪信号输出图色谱仪信号输出图l色谱数据处理是通过色谱数据处理是通过ADCADC转换器转换器, ,把模拟信号转换成数把模拟信号转换成数字信号字信号, ,然后采用色谱软件处理给出然后采

2、用色谱软件处理给出色谱图色谱图等信息。等信息。l数据处理原理数据处理原理自动处理自动处理人工修正人工修正 峰的检测峰的检测 数据采集数据采集 基线校正和重叠峰的分离基线校正和重叠峰的分离 l数据处理方法数据处理方法l色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图的曲线图, 其纵坐标为信号强度其纵坐标为信号强度, 横坐标为时间横坐标为时间二二. .色谱图色谱图 (Chromatogram)样品组分分离示意图样品组分分离示意图三三. .色谱图名词术语色谱图名词术语(1)(1)l色谱峰色谱峰(Peak):(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产

3、生的响色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号应信号. . l峰底峰底(Peak Base):(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线峰的起点与终点之间连接的直线. . l峰高峰高(Peak Height):(Peak Height):峰最大值到峰底的距离峰最大值到峰底的距离. . 色谱峰色谱峰时间时间( (分分) )峰高峰高峰底峰底响应值响应值 (mV)基线基线l切线峰宽切线峰宽( (Peak Width, 峰宽峰宽):):在峰两侧拐点处所作切在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离线与峰底相交两点之间的距离. . l半峰宽半峰宽( (Peak Width at Half

4、Height):):通过峰高的中点通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离的距离 . .l峰面积峰面积(Peak Area):(Peak Area):峰与峰底之间的面积峰与峰底之间的面积, ,又称响应值又称响应值. .三三. .色谱图名词术语色谱图名词术语(2)(2)色谱峰的判断色谱峰的判断 ( (最小面积最小面积) )响应值响应值时间时间峰面积峰面积切线切线半峰宽半峰宽切线峰宽切线峰宽三三. .液相色谱图名词术语液相色谱图名词术语(3)(3)l保留时间保留时间(T(TR R)(Retention time): )(Ret

5、ention time): 组分从进样到出峰最大组分从进样到出峰最大值所需的时间值所需的时间. . l死时间死时间(t(t0 0)(Dead time): )(Dead time): 不被固定相滞留组分的出峰时不被固定相滞留组分的出峰时间间. .（其测定（其测定测定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸测定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸收的惰性物质，例如：正相色谱常用收的惰性物质，例如：正相色谱常用四氯化碳四氯化碳，反相色，反相色谱常用谱常用甲醇、尿嘧啶、甲醇、尿嘧啶、NaNO3NaNO3等）等）. .l调整保留时间：调整保留时间：t tR R t tR Rt t0 0l保留体积保留体积(V(

6、VR R)(Retention volume): )(Retention volume): 组分从进样到出组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积现峰最大值所需的流动相体积. .l死体积死体积( (V V0 0)(Dead volume): )(Dead volume): 不被固定相滞留的组分不被固定相滞留的组分, , 从进样到出现峰最大值所需的流动相体积从进样到出现峰最大值所需的流动相体积. .l调整保留体积：调整保留体积：V VR RV VR RV V0 0t tR R F FC C lF Fc c: : 流动相的流速流动相的流速 mL/min.mL/min.三三. .液相色谱图名词术语液

7、相色谱图名词术语(4)(4)l谱带扩展谱带扩展(Band Broadening): (Band Broadening): 由于纵向扩散由于纵向扩散, ,传质阻传质阻力等因素的影响力等因素的影响, ,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象度增加的现象. . 三三. .液相色谱图名词术语液相色谱图名词术语(5)(5)三三. .液相色谱图名词术语液相色谱图名词术语(6)(6)l拖尾峰拖尾峰(Tailing Peak):(Tailing Peak): 后沿较前沿平缓的不对称峰后沿较前沿平缓的不对称峰. . l前伸峰前伸峰( (Leading Peak):Leadi

8、ng Peak): 前沿较后沿平缓的不对称峰前沿较后沿平缓的不对称峰. . l鬼峰鬼峰( (Ghost Peak): Ghost Peak): 并非由试样所产生的峰并非由试样所产生的峰, ,亦称假峰亦称假峰. .Excellentt = 1.0 - 1.05Acceptablet = 1.2Unacceptablet = 2Awfult = 4正常前伸三三. .液相色谱图名词术语液相色谱图名词术语(7)(7)l基线基线( (Baseline):Baseline): 在正常操作条件下在正常操作条件下, ,仅由流动相所产生仅由流动相所产生的响应信号的响应信号. . l基线噪声基线噪声(Baseli

9、ne Noise):(Baseline Noise): 由各种因素所引起的基线由各种因素所引起的基线波动波动. .l基线飘移基线飘移( (Baseline Drift):Baseline Drift): 基线随时间定向的缓慢变基线随时间定向的缓慢变化化. . 基线基线基线噪音基线噪音基基线线飘飘移移峰宽半峰宽标准偏差l标准偏差标准偏差()(Standard deviation): 0.607()(Standard deviation): 0.607倍峰倍峰高处峰宽的一半，高处峰宽的一半，为便于测量，改用为便于测量，改用半峰宽。半峰宽。目的目的是为了计算柱效率是为了计算柱效率(柱效柱效)。l柱效

10、柱效（理论塔板数）（理论塔板数） ： 或或三三. .液相色谱图名词术语液相色谱图名词术语(8)(8)2RtN 22/154.5WtNR进样进样图示中塔板数为图示中塔板数为3.3.l 塔板理论塔板理论 类似蒸馏中的气液平衡类似蒸馏中的气液平衡l峰的检测和判别是依据在基线的讯号水平上，预设一个峰的检测和判别是依据在基线的讯号水平上，预设一个“阈值阈值”，超过该值时，判别为峰可开始检测。一般采，超过该值时，判别为峰可开始检测。一般采用下面两种方式判别峰讯号的变化：用下面两种方式判别峰讯号的变化：依照信号斜率的变依照信号斜率的变化检测信号化检测信号依照积分面积检测依照积分面积检测峰信号峰信号四四. .

11、色谱峰检测色谱峰检测切线 色谱峰的判断 最小面积五五. .HPLC 测定步骤与内容测定步骤与内容1.1.确定色谱条件确定色谱条件: : 色谱柱的选择，流动相、流速、色谱柱的选择，流动相、流速、检测波长、柱温及进样量等。检测波长、柱温及进样量等。2.2.绘制标准工作曲线绘制标准工作曲线3.3.精密度试验与回收率试验精密度试验与回收率试验4.4.实际样品含量测定实际样品含量测定1.1.确定色谱条件确定色谱条件l 色谱柱的选择色谱柱的选择l 流动相流动相l 流速流速l 检测波长检测波长l 柱温柱温l 进样量进样量2.2.绘制标准工作曲线绘制标准工作曲线l标准曲线是定量分析的根本依据标准曲线是定量分析

12、的根本依据. .l药物浓度（或质量）与药物在检测器上的产生的信号药物浓度（或质量）与药物在检测器上的产生的信号（通常采用峰面积（通常采用峰面积A A）成比例）成比例( (正比正比).).l标准曲线的范围确定取决于样品最低浓度与最高浓度标准曲线的范围确定取决于样品最低浓度与最高浓度. .l标准曲线线性一般采用标准曲线线性一般采用5-95-9点，并非点越多越好点，并非点越多越好! !l准确度准确度 指用该方法测定的结果与真实值或参考值接指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。近的程度，用百分回收率表示。l相对回收率相对回收率 直接反映测定结果与真实值的接近程度直接反映测定

13、结果与真实值的接近程度, ,应控制在应控制在100%100%左右左右(95%(95%105%)105%)。l绝对回收率绝对回收率 模拟生物样品经整个样品处理过程模拟生物样品经整个样品处理过程, ,而相而相应标准溶液直接分析应标准溶液直接分析, ,两者的响应值之比称为绝对回收两者的响应值之比称为绝对回收率。绝对回收率一般应大于率。绝对回收率一般应大于70%,70%,过低说明方法中待测过低说明方法中待测物质损失严重。物质损失严重。l测定回收率测定回收率R R（recoveryrecovery）的具体方法可采用）的具体方法可采用“回收试回收试验法验法”和和“加样回收试验法加样回收试验法”。3.3.准

14、确度准确度(accuracy)(accuracy)(1)(1)回收试验回收试验 空白空白+ +已知量已知量A A的对照品（或标准品）测定，的对照品（或标准品）测定，测定值为测定值为 M M回收率回收率100%- -= =AMR空白空白X(2)(2)加样回收试验加样回收试验 已准确测定药物含量已准确测定药物含量P P的真实样品的真实样品+ +已已知量知量A A的对照品（或标准品）测定，测定值为的对照品（或标准品）测定，测定值为M M100%X=APMR- -数据要求数据要求 在规定的范围内，至少用在规定的范围内，至少用9 9次测定结果评价，次测定结果评价，如高、中、低三个不同浓度样品各测三次如高

15、、中、低三个不同浓度样品各测三次. .回收率回收率4.4.精密度精密度(precision) (precision) l精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度样测定所得结果之间的接近程度, ,表示测定的重现性表示测定的重现性。用。用偏差（偏差（d d）、标准偏差）、标准偏差( (SD SD ) )、相对标准偏差、相对标准偏差( (RSD RSD )()(变异变异系数，系数，CV CV ) )表示表示. .(1)(1)偏差偏差( (d d）：）：测量值与平均值之差测量值与平均值之差xxdi-=(2)(2)标准标

16、准( (偏偏) )差差(SD(SD或或S S）12-=nxxSi(3)(3)相对标准相对标准( (偏偏) )差（差（RSDRSD），），也称变异系数也称变异系数(CV,(CV,有日内有日内变异与日间变异两种变异与日间变异两种) )%100=xSRSD5.5.检测限检测限(limit of detection,LOD) (limit of detection,LOD) l指在确定的实验条件下，指在确定的实验条件下，HPLCHPLC能检测出能检测出待测物待测物的最低浓的最低浓度或含量。度或含量。( (是限度检验效能指标，无需定量测定，只是限度检验效能指标，无需定量测定，只要指出高于或低于该规定浓度

17、即可要指出高于或低于该规定浓度即可).).(1)(1)信噪比法信噪比法 把已知低浓度试样测出的信号与空白样把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比（浓度或量。一般以信噪比（S/NS/N）3131或或2121时的相应时的相应浓度或量确定检测限。浓度或量确定检测限。(2)(2)非仪器分析目视法非仪器分析目视法 用已知浓度的被测物，试验出用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量能被可靠地检测出的最低浓度或量. .l指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一指样品中被测

18、物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度要求。定准确度和精密度要求。6.6.定量限定量限(1imit of quantitation(1imit of quantitation，LOQ)LOQ)(1)(1)信噪比法确定定量限信噪比法确定定量限，一般以信噪比（，一般以信噪比（S/NS/N）为）为101101时相应的浓度或注入仪器的量进行确定时相应的浓度或注入仪器的量进行确定. .(2)(2)按按19841984年国际纯粹和应用化学联合会年国际纯粹和应用化学联合会(IVPAC)(IVPAC)规定：规定：用仪器所测空白背景响应标准差（用仪器所测空白背景响应标准差（SDSD）的）的1010

19、倍为估计值，倍为估计值，再经试验确定方法的实际测定下限再经试验确定方法的实际测定下限. .7 7.专属性专属性(specificity,(specificity,或称选择性）或称选择性）l指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在的情指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在的情况下，采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映况下，采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，是用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量是用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量.8. 8. 线性（线性（Lin

20、earityLinearity）l在设计范围内，测试结果与试样中被测物浓度呈正比关在设计范围内，测试结果与试样中被测物浓度呈正比关系的程度。系的程度。l线形通常用最小二乘法处理数据求得回归曲线的斜率线形通常用最小二乘法处理数据求得回归曲线的斜率（SlopeSlope）来表示。）来表示。l数据要求：至少需要五个浓度考察线形，需提供相关系数据要求：至少需要五个浓度考察线形，需提供相关系数、数、y y截距（检定的可能偏差）、回归斜率及方差等参截距（检定的可能偏差）、回归斜率及方差等参数，应列出回归方程数和线性图。数，应列出回归方程数和线性图。l指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法指达到一

21、定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高、低限浓度或量的区间。适用的高、低限浓度或量的区间。 l范围的确定可因测定项目不同而有不同要求：范围的确定可因测定项目不同而有不同要求： 9.9.范围（范围（RangeRange） 含量测定范围为含量测定范围为80%-120%80%-120%； 含量均匀度范围为含量均匀度范围为70%-130%70%-130%； 杂质测定应为被测杂质限度的杂质测定应为被测杂质限度的50%-120%50%-120%； 溶出度应为测定范围的溶出度应为测定范围的20%20%。l指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度，指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度，为

22、常规检验提供依据。是衡量实验室和工作人员之间为常规检验提供依据。是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现性的尺度。在正常情况下实验结果重现性的尺度。l分析方法重现性的测定是通过在不同的实验室内不同分析方法重现性的测定是通过在不同的实验室内不同的实验者对同一样品的分别测试而获得的。的实验者对同一样品的分别测试而获得的。( (获得的这获得的这种再与正常检定下的精密度进行比较种再与正常检定下的精密度进行比较, ,从而确定该法的从而确定该法的耐用性耐用性, ,或称粗放度或称粗放度).).10.10.耐用性耐用性(1)(1)鉴别试验除专属性、耐用性外，其它都不要求鉴别试验除专属性、耐用性外，其它都不要求. . (2)(2)杂质的限量检查除专属性、检测限、耐用性外杂质的限量检查除专属性、检测限、耐用性外, ,其它都其它都不要求。不要求。 (3)(3)杂质的含量测定除检测限外，其它都要求。杂质的含量测定除检测限外，其它都要求。(4)(4)含量测定及溶出量测定除检测限、定量限外，其它都含量测定及溶出量测定除检测限、定量限外，其它都要求。要求。11.11.应用应用0.20.61.01.41.82.22.63.0Time, min0%50%100%Rel. Int. (%)0.20.61.01.41.82.22.63.0Time, min0%50%100%Rel. Int. (%)