浮游菌及表面菌检测课件.ppt

1、浮游菌（浮游菌（Airborne Microbe）工作流程备料单 123456 此处添加目录标题7菌落计数 洁净室污染源浮游菌表面菌培养基成分接受指令结果观察、记录填写记录写报告采样菌落计数恒温箱培养制作平板灭菌备料制定计划查阅依据工作流程 备料单备料单v平皿平皿 2套套v消毒剂消毒剂(75%酒精酒精)v采样仪采样仪v棉花棉花v镊子镊子v大豆酪蛋白琼脂培养基大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)1520ml/皿皿X2污染物种类v通常所指的空气污染物主要有以下三类通常所指的空气污染物主要有以下三类 悬浮在空气中的固态、液态微粒 霉菌、致病菌等悬浮在空气中的微生物； 各种对人体或生产过程有害的气体。由于空

2、气净化的目的与对象不同，净化的内容、方法和衡量标准也不同。以洁净室为对象的空气净化的目的，就是最大可能地把空气介质中的悬浮微粒除掉，对于生物洁净室，还要控制有生命微粒。 2.2 污染物传播途径 v危害生产工艺的主要污染源主要有： 人员；送风；机器及其他生产设备； 原材料与经过加工的原材料；包装材料； 生产工艺用各种介质及洁净用化学品； 服装与其他设备中的纺织物； 办公设备与办公材料；参观人员； 维修人员，特别是那些来自洁净区外部的人员。v与产品接触的污染物有两种来源 生产工艺之内产生； 从外部环境传入生产环境之中。 污染源 洁净室污染源洁净室污染源 新风带入的尘粒和微生物； 作业人员发尘和散菌

3、； 建筑围护结构、设施的产尘； 设备及产品生产过程的产尘。室内空气的主要污染物质 污染发生源污染发生源 粒状污染物粒状污染物 有害气体有害气体 人体人体粉尘、皮屑、污垢、细菌、纤维、粉尘、皮屑、污垢、细菌、纤维、化妆品化妆品 体臭、体臭、CO2、氨、水蒸气、氨、水蒸气吸烟吸烟粉尘（焦油、尼古丁等）、二甲粉尘（焦油、尼古丁等）、二甲硝酸铵等硝酸铵等 CO、CO2、NO、NO2、甲醛、丙烯醛、甲醛、丙烯醛、碳氢化合物碳氢化合物 办公设备办公设备 纸张、家具的纤维肌尘粒纸张、家具的纤维肌尘粒 臭氧、氨、溶剂类（臭氧、氨、溶剂类（VOC） 机械运转设备机械运转设备 转动设备磨损的粉尘、纤维、碳转动设备

4、磨损的粉尘、纤维、碳化油脂等化油脂等 润滑油挥发物润滑油挥发物 燃烧器具燃烧器具 烟尘烟尘 CO、CO2、NO、NO2、SO2、甲醛、甲醛、碳氢化合物碳氢化合物 建筑材料建筑材料 细菌、霉菌、璧虱、石棉纤维、细菌、霉菌、璧虱、石棉纤维、玻璃纤维、粉尘等玻璃纤维、粉尘等 甲醛、氡气、溶剂、粘接剂中的有机溶剂甲醛、氡气、溶剂、粘接剂中的有机溶剂挥发物挥发物 清洗和灭菌清洗和灭菌喷射剂（氟化碳氢化合物）、杀菌剂、防喷射剂（氟化碳氢化合物）、杀菌剂、防霉剂、溶剂、洗涤剂的挥发物霉剂、溶剂、洗涤剂的挥发物 人体各部位的带菌数人体各部位的带菌数身体部位身体部位细菌细菌身体部位身体部位细菌细菌手手10010

5、00个个/2鼻液鼻液107g/ml额额104105个个/2尿液尿液约约108g/ml头发头发约约106个个/2粪便粪便108个个/g液下液下106107个个/2着无菌服时的人体散发细菌量动作动作温度温度/湿度湿度/%浮游浮游菌数菌数沉降沉降菌数菌数附着附着菌数菌数人体散发菌量人体散发菌量个个(人人min) -1 平均值个平均值个(人人min)-1踏步踏步29.827.425.825.426.070856784651573275317701750137650938940715632918833021223216522703472238921381870239121.420.03029982255

6、616047911830612603341起立起立坐下坐下26.025.223.421.420.0686365312817978674039313751821348431286141941404471651502101496475216271172抬臂抬臂25.225.220.06263285894086096311476705560722577745681GB/T 162931996 洁净室（区）洁净室（区）clean room (area) 对尘粒对尘粒及微生物污染规定需进行环境控制的房间或区及微生物污染规定需进行环境控制的房间或区域。其建筑结构、装备及其使用均具有减少对域。其建筑结构、装

7、备及其使用均具有减少对该区域内污染源的介质、产生和滞留的功能。该区域内污染源的介质、产生和滞留的功能。洁净室的定义洁净室的定义洁净室是指空气洁净度达到规定级别的可供工作的空洁净室是指空气洁净度达到规定级别的可供工作的空间。其功能是控制各种微粒（主要是尘埃粒子）的污间。其功能是控制各种微粒（主要是尘埃粒子）的污染，染，来达到满足精密产品的生产与科学实验活动。来达到满足精密产品的生产与科学实验活动。洁洁净室绝不是仅限于净室绝不是仅限于“洁净洁净”，不同的行业与部门对温，不同的行业与部门对温度、湿度、照明、噪声、静电、微振都有相当要求，度、湿度、照明、噪声、静电、微振都有相当要求，是集建筑装饰（与大

8、气相对隔断的密闭装修）、净化是集建筑装饰（与大气相对隔断的密闭装修）、净化空调、动力电、照明电、工艺管道等多种专业技术于空调、动力电、照明电、工艺管道等多种专业技术于一体的多功能的综合整体产物一体的多功能的综合整体产物.浮游菌（浮游菌（Airborne Microbe）悬浮在空气中的活微生物粒子，悬浮在空气中的活微生物粒子，通过专门的培养基，在适宜的通过专门的培养基，在适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落生长条件下繁殖到可见的菌落数。数。本标准规定了医药工业洁净室和洁净区中本标准规定了医药工业洁净室和洁净区中浮游菌测试条件、测试方法。浮游菌测试条件、测试方法。本标准适用于医药工业洁净室和洁净区，本

9、标准适用于医药工业洁净室和洁净区，无菌室或无菌区域（包括洁净工作台）的浮游无菌室或无菌区域（包括洁净工作台）的浮游菌的测定和环境的验证。菌的测定和环境的验证。参考标准：参考标准：2.4 洁净室分类 v2.4.1 按用途分类 工业洁净室； 生物洁净室一般生物洁净室；生物安全洁净室。一般生物洁净室；生物安全洁净室。v2.4.2 按气流流型分类 单向气流洁净室； 非单向流洁净室； 混合流洁净室； 辐（矢）流洁净室。 采样器原理采样器原理撞击法撞击法 impacting method撞击式空气微生物采样器采样，撞击式空气微生物采样器采样，通过抽气动力作用，使空气通过狭缝通过抽气动力作用，使空气通过狭缝

10、或小孔而产生高速气流，从而使悬浮或小孔而产生高速气流，从而使悬浮在空气中的带菌粒子撞击到琼脂平板在空气中的带菌粒子撞击到琼脂平板上，经上，经 35 ，48 h培养后，计算每培养后，计算每立方米空气中所含的细菌菌落数的采立方米空气中所含的细菌菌落数的采样测定方法。样测定方法。最小采样量最小采样量洁净度级别洁净度级别采样量（采样量（L/次）次）100级级100010000级级500100000级级100300000级级100采样点的位置采样点的位置v 采样点位置可以同悬浮粒子测试点。采样点位置可以同悬浮粒子测试点。v 工作区测点位置离地工作区测点位置离地0.81.5m左右（略高于工作面）。左右（略

11、高于工作面）。v 送风口测点位置离开送风面送风口测点位置离开送风面30cm左右。左右。v 可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点。可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点。v 采样注意事项采样注意事项v 对于单向流或送风口，采样器采样管口朝向应正对气流方对于单向流或送风口，采样器采样管口朝向应正对气流方向；对于非单向流，采样管口向上。向；对于非单向流，采样管口向上。v 布置采样点时，至少应离开尘粒较集中的回风口布置采样点时，至少应离开尘粒较集中的回风口1m以上以上v 采样时，测试人员应站在采样口的下风侧采样时，测试人员应站在采样口的下风侧,并尽量少走动并尽量少走动v 采取一切措施防止采样过程

12、的污染和其他可能对样本的污采取一切措施防止采样过程的污染和其他可能对样本的污染。染。 采样点布置采样点布置台台台阴性对照台采样超净台每个测点的浮游菌平均浓度的计算每个测点的浮游菌平均浓度的计算v浮游菌平均浓度（个浮游菌平均浓度（个/m）=菌菌落数落数/采样量采样量v示例示例1：某测点采样量为：某测点采样量为400L,菌落数为菌落数为1，则：，则：v浮游菌平局浓度浮游菌平局浓度=1/0.4=2.5个个/mv示例示例2：某测点采样量为：某测点采样量为2m，菌落数为菌落数为3，则：，则：v浮游菌平局浓度浮游菌平局浓度=3/2=1.5个个/m测试规则测试规则测试条件在测试之前，要对洁净室（区）相关参数

13、进行预先测试，这类测试将会提供悬浮粒子的环境条件，例如：这种预先测试可包括：温度和相对湿度的测试，洁净室（区）的温度和相对湿度应与其生产及工艺要求相适应（无特殊要求时），温度在1826，相对湿度在45%65%为宜室内送风量或风速的测试，或压差的测试高效过滤器的泄漏测试GB/T 162931996 单向流单向流unidirectional air flow（曾称（曾称为层流为层流laminar flow）沿着平行流线，以）沿着平行流线，以单一通路以一定流速向单一方向流动的单一通路以一定流速向单一方向流动的气流。气流。GB/T 1629319963.9 非单向流非单向流nonunidirectio

14、nal air flow（曾称为乱流（曾称为乱流turbulent flow） 具有多具有多个通路循环特性或气流方向不平行的，个通路循环特性或气流方向不平行的，不满足单向流定义的气流。不满足单向流定义的气流。大豆酪蛋白琼脂培养基（大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）v酪蛋白胰酶消化物酪蛋白胰酶消化物 15g 提供氮源、维生素和生提供氮源、维生素和生长因子长因子v大豆粉木瓜蛋白酶消化物大豆粉木瓜蛋白酶消化物 5g 提供氮源、维生素和生提供氮源、维生素和生长因子长因子v氯化钠氯化钠 5g 调节渗透压调节渗透压v琼脂琼脂 15g 凝固剂凝固剂v纯化水纯化水 1000mL3035 48h 测试步骤u 测试前

15、仪器、培养皿表面必须严格消毒。u采样器进入被测房间前先用消毒房间的消毒剂灭菌，用于100级洁净室的采样器宜一直放在被测房间内。u用消毒剂擦净培养皿的外表面。u 采样前，先用消毒剂消毒采样器的顶盖、转盘以及罩子的内外面，采样结束，再用消毒剂轻轻喷射罩子的内壁和转盘。u 采样口及采样管，使用前必须高温灭菌。如用消毒剂对采样管的外壁及内壁进行消毒时，应将管中的残留液倒掉并晾干。u采样者应穿戴与被测洁净区域相应的工作服，在转盘上放入或调换培养皿前，双手用消毒剂消毒。u 狭缝式采样器的采样程序u仪器经消毒后先不放入培养皿，开动真空泵抽气，使仪器中的残余消毒剂蒸发，时间不少于5min，并调好流量、转盘转速

16、。u 关闭真空泵，放入培养皿，盖上盖子后调节采样器缝隙高度。u置采样口于采样点后，依次开启采样器、真空泵，转动定时器，根据采样量设定采样时间。沉降菌和浮游菌的区别是什么？只是捕捉时的形态差异。只是捕捉时的形态差异。沉降菌指落在地面或物体表面的灰尘中携带的细菌；沉降菌指落在地面或物体表面的灰尘中携带的细菌；浮游菌指在空气中漂浮的尘埃所携带的细菌浮游菌指在空气中漂浮的尘埃所携带的细菌 。见相关国家标准见相关国家标准沉降菌沉降菌 GB/T 16294-2010浮游菌浮游菌 GB/T 16293-2010表面菌附在人体表皮或设备表面的微生物附在人体表皮或设备表面的微生物接受指令结果观察、记录填写记录写

17、报告采样与制作平板菌落计数恒温箱培养实验准备灭菌备料制定计划查阅依据工作流程查阅依据：表面微生物表面微生物v微微 生生 物物 在表面附着的程度受表面特性、微生物在表面附着的程度受表面特性、微生物自身和存在的其他材料自身和存在的其他材料(如润滑剂如润滑剂)的影响。污染的影响。污染源也会影响到附着程度。源也会影响到附着程度。v为获取微生物，所进行的处理包括漂洗为获取微生物，所进行的处理包括漂洗(同时施以同时施以物理力物理力)或直接表面取样。表面活性剂可以用于提或直接表面取样。表面活性剂可以用于提高回收，但应认识到，较高浓度的表面活性剂可高回收，但应认识到，较高浓度的表面活性剂可能会抑制微生物能会抑

18、制微生物v在在 相相 当当 一部分材料中，有些微生物可能以一部分材料中，有些微生物可能以生物生物膜膜的形式出现，在生物膜的结构中，微生物在牢的形式出现，在生物膜的结构中，微生物在牢固附着于材料表面上的被囊状包围。生物膜状微固附着于材料表面上的被囊状包围。生物膜状微生物可能会表现更强的抗灭菌性生物可能会表现更强的抗灭菌性采样方法：采样方法：袋蠕动超声洗脱搅动(带或不带玻琅珠)涡旋式混合 冲洗搅切(碎解)擦拭一步到位型一步到位型接触板 、 琼脂覆盖擦拭擦拭含有可吸收取样材料的棉拭子通常被固定于杆或把手上。含有可吸收取样材料的棉拭子通常被固定于杆或把手上。样品材料是不是可溶性的都行。样品材料是不是可

19、溶性的都行。通常的使用方法是用缓冲液或液体培养基湿润棉拭，用通常的使用方法是用缓冲液或液体培养基湿润棉拭，用棉拭擦拭界定好的取样表面。在有些情况下，可以先湿棉拭擦拭界定好的取样表面。在有些情况下，可以先湿润样品表面，然后用干棉拭擦拭，这样可以提高回收效润样品表面，然后用干棉拭擦拭，这样可以提高回收效率。随后将棉拭放至缓冲溶液或液体培养基中，并搅动率。随后将棉拭放至缓冲溶液或液体培养基中，并搅动以从棉拭上取下微生物。另外，有时也可用可溶性棉拭，以从棉拭上取下微生物。另外，有时也可用可溶性棉拭，使棉拭溶解于缓冲液或液体培养基中。则用过滤、平板使棉拭溶解于缓冲液或液体培养基中。则用过滤、平板计数或其

20、他方法分析所得到的悬液计数或其他方法分析所得到的悬液擦拭擦拭 是是 从不规则形状产品或相对难以接近的区从不规则形状产品或相对难以接近的区域取样的有效方法，该方法对取样面积必须大时域取样的有效方法，该方法对取样面积必须大时也有效也有效但但 该该 方方 法因擦拭方式的不同而更易出错。而且，法因擦拭方式的不同而更易出错。而且，通过擦拭不太可能将样品上所有的微生物都收集通过擦拭不太可能将样品上所有的微生物都收集到。有些微生物可能会被棉拭本身吸附，从而不到。有些微生物可能会被棉拭本身吸附，从而不会被测到。会被测到。棉棉 拭拭 中中 不应有微生物杀灭剂或微生物抑制剂不应有微生物杀灭剂或微生物抑制剂在在 生

21、生 物物 负载估计过程中，洗脱液可用于从产负载估计过程中，洗脱液可用于从产品上取下微生物品上取下微生物;传送培养基可用于将取下的传送培养基可用于将取下的微生物移去计数微生物移去计数;稀释液可用于获得含有可计稀释液可用于获得含有可计数微生物的悬液。数微生物的悬液。洗洗 脱脱 液液 和稀释液的特性对所用方法的效率有和稀释液的特性对所用方法的效率有显著影响。显著影响。在选择稀释液或洗提液时，应注意它们的成分在选择稀释液或洗提液时，应注意它们的成分(如组成、浓度、渗透性和如组成、浓度、渗透性和pH) 这些成分不应这些成分不应使微生物增殖或失活使微生物增殖或失活当当 用用 液液 体从固体表面取下微生物时

22、，可考虑体从固体表面取下微生物时，可考虑使用表面活化剂。使用表面活化剂。洗脱液、稀释液和转送培养墓洗脱液、稀释液和转送培养墓洗脱液的稀释液示例洗脱液的稀释液示例溶液溶液水中的浓度水中的浓度应用应用林格氏溶液1/4强度通用蛋白胨水溶液0.1%1.0%通用缓冲的蛋白胨水溶液0.067mol/L磷酸0.43%氢氧化钠0.1%蛋白胨通用磷酸盐缓冲盐水溶液0.02mol/L磷酸0.9%氢氧化钠通用氯化钠溶液0.25%0.9%通用Calgon林格氏溶液1/4强度溶解藻酸钙棉拭硫代硫酸盐林格氏溶液1/4强度中和残留氯水稀释含水样品，计数前制备可溶材料的等渗压溶液注：此表并不包括所有。表面活化剂，如聚山梨醇酯

23、（吐温注：此表并不包括所有。表面活化剂，如聚山梨醇酯（吐温80）可以加入洗提液）可以加入洗提液和稀释液中。根据具体的应用，通常使用的浓度在和稀释液中。根据具体的应用，通常使用的浓度在0.01%0.1%之间。应使用适之间。应使用适当浓度的表面活性剂，并加以特殊处理以防止泡沫形成。当浓度的表面活性剂，并加以特殊处理以防止泡沫形成。阴性对照生理盐水生理盐水擦拭采样25cm21011021033035722小时用灭过菌的镊子沾湿棉球把棉球放入试管内，摇匀（洗脱）1ml1ml备料单备料单v镊子镊子 1个个 v平皿平皿 7套套v棉球棉球 2个个 v 试管试管 4支支v刻度吸管刻度吸管 1ml 2支支v大豆酪蛋白琼脂培养基大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)1520ml/皿皿X7v0.9生理盐水生理盐水 10ml/支支 x4