微生物发酵产酶及生产工艺课件.ppt

1、第四章第四章 微生物发酵产酶及生产工艺微生物发酵产酶及生产工艺 常用的产酶微生物；常用的产酶微生物； 发酵工艺条件及其控制；发酵工艺条件及其控制； 酶发酵动力学；酶发酵动力学； 固定化微生物细胞发酵产酶；固定化微生物细胞发酵产酶； 固定化微生物原生质体发酵产酶；固定化微生物原生质体发酵产酶； 内容：第一节第一节 常用的产酶微生物常用的产酶微生物一、应用微生物来开发酶的优点：一、应用微生物来开发酶的优点： (1)(1)微生物生长繁殖快，生活周期短。因此，用微生物微生物生长繁殖快，生活周期短。因此，用微生物来生产酶产品，生产能力（发酵）几乎可以不受限制地扩来生产酶产品，生产能力（发酵）几乎可以不受

2、限制地扩大，能够满足迅速扩张的市场需求。大，能够满足迅速扩张的市场需求。 (2)(2)微生物种类繁多，它们散布于整个地球的各个角落，微生物种类繁多，它们散布于整个地球的各个角落，而且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢而且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方式，能分解利用不同的底物。方式，能分解利用不同的底物。 (3)(3)这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质基这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质基础。础。 (4)(4)特别是当基因工程介入时，动植物细胞中存在地酶，特别是当基因工程介入时，动植物细胞中存在地酶，几乎都能够利用微生物细胞获得。几乎都能够利用微生物

3、细胞获得。 因此，有计划和仔细地筛选微生物菌种，通常可以获因此，有计划和仔细地筛选微生物菌种，通常可以获得能够生产几乎任何一种酶的适当细胞。得能够生产几乎任何一种酶的适当细胞。二、用于酶生产微生物的要求：1、酶的产量高；2、容易培养和管理；3、产酶稳定性好；4、利于分离纯化；5、安全可靠、无毒性。 形态：短杆或长杆状，0.51.01.03.0 um，革兰氏阴性，运动(周毛)或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。 Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。 大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营

4、养要求低。 应用：大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌基因工程的宿主菌工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和 制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等三、常见产酶微生物三、常见产酶微生物 菌体从椭圆至杆状，单个、菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。含糖、不生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。生长良好。 应用：有机酸应用：有机酸( (食醋等）食醋等）葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶( (高果糖浆高果糖浆 ) )山梨糖山梨糖 ( (维维C C中

5、间体）中间体） 直状、近直状的杆菌，直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，周生或侧生鞭毛，革革兰氏阳性，无荚膜，兰氏阳性，无荚膜，芽孢芽孢0.50.51.51.5 1.81.8 m m，中生或近中生。中生或近中生。 枯草芽孢杆菌是工业枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、生产淀粉酶、蛋白酶、5-5-核苷酸酶、某些核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。氨基酸及核苷。 分类学上属于藻状菌纲，毛霉目，根霉属。 根霉因有假根（根霉因有假根（Rhizoid）而得名）而得名（假根的功能是在培养基上固着，（假根的功能是在培养基上固着，并吸收营养）。并吸收营养）。 分布于土壤、空气

6、中，常见于淀分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。果、蔬菜的腐烂。 代表种：米根霉（代表种：米根霉（R.oryzae)黑根黑根霉霉(R.nigrican)等。等。 应用：根霉能产生一些酶类，如应用：根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产这些酶类的菌种。在酿酒工生产这些酶类的菌种。在酿酒工业上常用做糖化菌。有些根霉还业上常用做糖化菌。有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。 分类：多数属于子囊菌亚门，分类：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。少数属于半知菌亚门

7、。 分布：广泛分布于土壤、空气分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。生致癌性的黄曲霉毒素。 代表种：黑曲霉代表种：黑曲霉Asp. Niger、黄曲霉黄曲霉Asp.flavus 应用：是制酱、酿酒、制醋的应用：是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。产糖化饲料的菌种。回本节第二节、

8、微生物酶开发的一般程序第二节、微生物酶开发的一般程序( (一一) ) 样品的采集样品的采集 采样的目的、采样地点、采样方法及采样的采样的目的、采样地点、采样方法及采样的数量。数量。微生物酶开发的一般程序微生物酶开发的一般程序( (二二) ) 菌种的分离菌种的分离 培养基的确定、培养条件的确定。培养基的确定、培养条件的确定。微生物酶开发的一般程序微生物酶开发的一般程序( (三三) ) 菌种的初筛菌种的初筛 (1)(1)用简单的定性反应进行初筛；用简单的定性反应进行初筛； (2)(2)在最初分离阶段就给予特殊的培养基或培养在最初分离阶段就给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的菌株得以繁殖，尽可能地

9、条件，进而让目的菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株或只将其最适菌株的把只成为目的菌的菌株或只将其最适菌株的一株纯化分离。一株纯化分离。微生物酶开发的一般程序微生物酶开发的一般程序( (四四) ) 菌种的复筛菌种的复筛 初筛之后，还要进行复筛。复筛的目的是在初筛之后，还要进行复筛。复筛的目的是在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。复筛。生产要求的菌种。复筛。 酶活的测定方法的建立尤其重要。酶活的测定方法的建立尤其重要。微生物酶开发的一般程序微生物酶开发的一般程序( (五五) ) 对复筛获得菌株的要求对复筛获得菌株的要求 (1)(1)

10、不是致病菌；不是致病菌； (2)(2)菌株不易变易和退化；菌株不易变易和退化； (3)(3)不易感染噬菌体；不易感染噬菌体； (4)(4)微生物产酶量高；微生物产酶量高； (5)(5)酶的性质符合应用的需要，而且最好是胞酶的性质符合应用的需要，而且最好是胞外酶；外酶； (6)(6)产生的酶便于分离和提取，得率高；产生的酶便于分离和提取，得率高； (7)(7)微生物培养营养要求低。微生物培养营养要求低。微生物酶开发的一般程序微生物酶开发的一般程序( (六六) ) 最佳产酶条件的初步确定最佳产酶条件的初步确定 (1)(1)培养方式的确定；培养方式的确定； (2)(2)最佳培养条件组合；最佳培养条件

11、组合； (3)(3)微生物产酶的特性微生物产酶的特性( (胞内酶、胞外酶胞内酶、胞外酶) )； (4)(4)微生物酶收集的时间顺序；微生物酶收集的时间顺序； 微生物酶开发的一般程序微生物酶开发的一般程序( (七七) ) 微生物产酶性能的进一步提高微生物产酶性能的进一步提高 (1)(1)获得高产菌种的突变体；获得高产菌种的突变体； 微生物酶开发的一般程序微生物酶开发的一般程序( (七七) ) 微生物产酶性能的进一步提高微生物产酶性能的进一步提高 (2)(2)利用代谢工程和代谢调节机理来提高微生利用代谢工程和代谢调节机理来提高微生物的酶产量；物的酶产量； 微生物酶开发的一般程序微生物酶开发的一般程

12、序(七七) 微生物产酶性能的进一步提高微生物产酶性能的进一步提高 (3)运用遗传工程、基因工程的手段将原有菌运用遗传工程、基因工程的手段将原有菌株中的目的基因转移到另外一些对生产环境株中的目的基因转移到另外一些对生产环境更适应性的微生物细胞之内，使其高效表达；更适应性的微生物细胞之内，使其高效表达； 微生物酶开发的一般程序微生物酶开发的一般程序( (八八) ) 微生物酶的提取方法微生物酶的提取方法 (1)(1)酶的粗提；酶的粗提； (2)(2)酶的精制。酶的精制。 微生物酶开发的一般程序微生物酶开发的一般程序(九九) 微生物产酶菌种的保藏微生物产酶菌种的保藏 (1)斜面；斜面； (2)沙土管；

13、沙土管； (3)冷冻。冷冻。 - -淀粉酶的筛选淀粉酶的筛选蛋白酶产生菌的获得方法蛋白酶产生菌的获得方法应用含酪蛋白的培养基应用含酪蛋白的培养基第三节、发酵工艺条件及其控制第三节、发酵工艺条件及其控制1、培养基2、发酵条件及控制3、提高产酶的措施GoGoGo下一节下一节本章目录1 1、培养基、培养基 培养基：是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。 分类 水分和形态 形状 用途微生物微生物动物动物（异养）（异养）异养自养绿色植物绿色植物（自养）（自养）碳源碳源糖类、脂肪糖、醇、有机酸等二氧化碳、碳酸盐等二氧化碳氮源氮源蛋白质及其降解物蛋白质及其降解物、有机氮化物、无机氮化物、氮

14、无机氮化物、氮无机氮化物能源能源与碳源同与碳源同氧化无机物或利用日光能利用日光能生长因子生长因子维生素有些需要维生素等生长因子不需要不需要无机元素无机元素无机盐无机盐无机盐无机盐水分水分水水水水各种生物对营养的需求各种生物对营养的需求 1 1、选择适宜的营养物质、选择适宜的营养物质 2 2、营养物的浓度及配比合适、营养物的浓度及配比合适 3 3、物理、化学条件适宜、物理、化学条件适宜 4 4、经济节约、经济节约 5 5、精心设计、试验比较、精心设计、试验比较培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养目的不同，原料的选择和配比不同；培养目的不同，原料的选

15、择和配比不同；不同阶段，培养条件也有所差异。不同阶段，培养条件也有所差异。培养基的设计原则培养基的设计原则五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础构成细胞物质或代谢产物中碳架构成细胞物质或代谢产物中碳架 碳源可作能源，为生命活动提供能量碳源可作能源，为生命活动提供能量常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物质及其降解物异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用）异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄

16、糖最为通用） 水是微生物最基本的组成分（水是微生物最基本的组成分（）水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）水水碳源碳源选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制构成细胞物质和代谢产物中氮元素构成细胞物质和代谢产物中氮元素氮源有机氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏无机氮源铵盐、硝酸盐 参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性参与酶的组

17、成、构成酶活性基、激活酶活性维持细胞结构的稳定性维持细胞结构的稳定性调节细胞渗透压调节细胞渗透压控制细胞的氧化还原电位控制细胞的氧化还原电位 常用：硫酸盐、常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物磷酸盐、氯化物以及含有钾、钠、以及含有钾、钠、钙、镁、铁等元钙、镁、铁等元素的化合物。素的化合物。 氮源氮源无机盐无机盐需要注意合适的碳氮比需要注意合适的碳氮比生长因子生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。 分类：分类：化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧

18、啶）及其衍化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分生物和类脂成分 等四类等四类功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应 实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各子的的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子种生长因子 实验室的常用培养基：实验室的常用培养基：细菌：细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；放线菌：高氏放线菌：高氏1 1号合成培养基培养

19、；号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：霉菌： 查氏合成培养基；查氏合成培养基；例如枯草芽孢杆菌：例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基或一般培养：肉汤培养基或LB培养基；培养基；自然转化：基础培养基；自然转化：基础培养基；观察芽孢：生孢子培养基；观察芽孢：生孢子培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基； 枯草杆菌枯草杆菌BF7658-淀粉酶发酵培养基淀粉酶发酵培养基：玉米粉：玉米粉8%，豆饼粉，豆饼粉4%，磷酸氢二钠，磷酸氢二钠 0.8%，硫酸铵，硫酸铵0.4%，氯化钙，氯化钙0.2%，氯化按，氯化按0.

20、15%（自然（自然pH）。）。 枯草杆菌枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基中性蛋白酶发酵培养基：玉米粉：玉米粉4%，豆饼粉，豆饼粉3%，麸皮，麸皮3.2%, 糠糠1%, 磷酸氢二钠磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾磷酸二氢钾0.03%（自然（自然pH）。）。 黑曲霉糖化酶发酵培养基黑曲霉糖化酶发酵培养基：玉米粉：玉米粉10%，豆饼粉，豆饼粉4%，麸皮，麸皮1%（pH4.45.0）。）。 地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶发酵培养基碱性蛋白酶发酵培养基：玉米粉：玉米粉5.5%, 豆饼豆饼4%, 磷酸氢二钠磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾磷酸二氢钾0.03%(pH 8.5)。 黑曲霉

21、黑曲霉AS 3.350酸性蛋白酶发酵培养基酸性蛋白酶发酵培养基: 玉米粉玉米粉6%, 豆饼粉豆饼粉4%, 玉米浆玉米浆0.6%, 氯化钙氯化钙0.5%, 氯化铵氯化铵1%, 磷酸氢二钠磷酸氢二钠0.2% (pH 5.5)。 游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基：糖蜜：糖蜜2%，豆饼粉，豆饼粉2%，磷酸氢二钠，磷酸氢二钠0。1%，硫酸镁，硫酸镁0。05% (pH 7.2)。 桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基：淀粉水解糖：淀粉水解糖5%，蛋白胨，蛋白胨0.5%, 硫酸镁硫酸镁0.05%, 氯化钙氯化钙0.04%, 磷酸氢二钠磷酸氢二钠0.05%, 磷

22、酸二氢钾磷酸二氢钾0.05% (自然自然pH)。 黑曲霉黑曲霉AS3.396果胶酶发酵培养基果胶酶发酵培养基: 麸皮麸皮5%, 果胶果胶0.3%, 硫酸铵硫酸铵2%, 磷酸二氢钾磷酸二氢钾0.25%, 硫酸镁硫酸镁0.05%, 硝酸钠硝酸钠0.02%, 硫酸亚铁硫酸亚铁0.001% (自然自然pH)。 枯草杆菌枯草杆菌AS1.398碱性磷酸酶发酵培养基碱性磷酸酶发酵培养基: 葡萄糖葡萄糖0.4%, 乳蛋白水解物乳蛋白水解物0.1%, 硫硫酸铵酸铵1%, 氯化钾氯化钾0.1%, 氯化钙氯化钙0.1mmol/L, 氯化镁氯化镁1.0mmol/L, 磷酸氢二钠磷酸氢二钠20mol/L ( 用用pH7

23、.4的的Tris-HCl缓冲液配制缓冲液配制)回本节2、发酵条件及控制、发酵条件及控制培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。通常培养条件：细菌与放线菌：pH6.58.0酵母菌和霉菌：pH46范围内生长pH值的控制值的控制细胞发酵产酶的最适细胞发酵产酶的最适pHpH值与生长最适值与生长最适pHpH值往往有所不同。细胞生产值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适某种酶的最适pHpH值通常接近于该酶催化反应的最适值通常接近于该酶催化反应的最适pHpH值。值。 有些细胞可以

24、同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的基的pHpH值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。 一般工艺流程一般工艺流程P46pH对微生物生长繁殖和代谢产物形成影响的主要原因：1、影响原生质膜的性质、影响原生质膜的性质2、影响酶的活性、影响酶的活性3、影响营养物质和中间代谢产物的解离、影响营养物质和中间代谢产物的解离 二、影响二、影响pH值变化的因素值变化的因素 1、基质代谢、基质代谢 （1）糖代谢）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使醇，使pH下

25、降。糖缺乏，下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一上升，是补料的标志之一 （2）氮代谢）氮代谢 当氨基酸中的当氨基酸中的-NH2被利用后被利用后pH会下降；尿会下降；尿素被分解成素被分解成NH3，pH上升，上升，NH3利用后利用后pH下降，当碳源下降，当碳源不足时氮源当碳源利用不足时氮源当碳源利用pH上升。上升。 （3）生理酸碱性物质利用后）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降会上升或下降 2、产物形成、产物形成 某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。变化。如有机酸类产生使如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗

26、生素呈碱性，使霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。上升。 3、菌体自溶，、菌体自溶，pH上升，发酵后期，上升，发酵后期，pH上升。上升。 三、发酵过程三、发酵过程pH值的调节及控制值的调节及控制 1、调整培养基的组分、调整培养基的组分 2、在发酵过程中进行控制、在发酵过程中进行控制 添加添加CaCO3： 氨水流加法氨水流加法 尿素流加法尿素流加法 3、通过补料调、通过补料调pH 4、当补料与调、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调发生矛盾时，加酸碱调pH例：例： 配制不同初始配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况的培养基，摇瓶考察发酵情况pH对产海藻酸裂解酶的影响对产海藻酸裂解酶的影响例子：不同

27、调例子：不同调pH方法的影响方法的影响 分别在分别在4种缓冲介质中，于种缓冲介质中，于pH 650一一950测定天冬测定天冬酰胺酶酶活力酰胺酶酶活力 1 甘氨酸介质甘氨酸介质pH 8.00时酶时酶活力最高；活力最高； 2 硼酸在硼酸在pH 8.50，酶反应，酶反应最快最快 3 磷酸在磷酸在pH 8.50，酶反应，酶反应最快最快 4 Tris在在pH 8.50，酶反应最，酶反应最快快 酶活酶活1243 不同pH控制方式对目的突变株ISw330异亮氨酸摇瓶发酵的影响，结果如图所示。 “1”表示只加CaC03控制pH值，“2”表示只加尿素控制，“3”表示CaC03和尿素联合控制pH值。异亮氨酸发酵异

28、亮氨酸发酵 不同pH值对菌体的形态影响很大，当pH值高于75时，菌体易于老化，呈现球状；当pH值低于65时菌体同样受抑制，易于老化。而在72左右时，菌体是处于产酸期，呈现长的椭圆形；在69左右时，菌体处于生长期，呈“八”字形状并占有绝对的优势。 pH69时，菌体生长旺盛，pH7.15时，对菌体的产酸有利。因此，在发酵的产酸期产酸较高。采用阶段pH控制模式进行发酵，在发酵中前期控制pH6.9，到48h后pH值为7.15，到80h后pH值为7.25。产率22.27g/L，产酸率提高12.23。通常在生物学范围内每升高10，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生

29、长和合成酶。温度的控制温度的控制有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度同，而且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的条件下，可以提高酶所对应的mRNAmRNA的稳定性，增加酶生的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。物合成的延续时间，从而提高酶的产量。 枯草杆菌的最适生长温度为3437黑曲霉的最适生长温度为2832 溶解氧的控制溶解氧的控制 溶解氧是指溶解在培养基中的氧气。溶解氧是指溶解在培养基中的氧气。 在酶的发酵生产过程中，在酶的发酵生

30、产过程中， 处于不同生长阶段的细胞，其处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。的溶解氧。 培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液

31、接触时间越长、来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。响。调节通气量调节通气量调节氧的分压调节氧的分压 调节气液接触时间调节气液接触时间 调节气液接触面积调节气液接触面积 改变培养液的性质改变培养液的性质 控制溶解氧方法控制溶解氧方法回本节3、提高酶产量的措施、提高酶产量的措施 1 1、添加诱导物、添加诱导物对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中

32、的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导诱导-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。 诱导物一般可以分为诱导物一般可以分为3 3类（诱导物定义）类（诱导物定义） 酶的作用底物酶的作用底物 酶的催化反应产物酶的催化反应产物 作用底物的类似物作用底物的类似物2、控制阻遏物的浓度、控制阻遏物的浓度 阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。解代谢物阻遏

33、两种。 1. 1.产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。途径的末端产物引起的阻遏作用。 2.2.分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用产生的物质）引起的阻遏作用。 控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。效措施。 为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控控制培养基中葡萄糖等容易利用

34、的碳源的浓度制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。采用其他较难利用的碳源，如淀粉等采用其他较难利用的碳源，如淀粉等采用补料、分次流加碳源采用补料、分次流加碳源添加一定量的环腺苷酸（添加一定量的环腺苷酸（cAMP）对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除产物的浓度的方法使阻遏解除。 3、添加表面活性剂、添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。 将适量的非离子型表面活

35、性剂非离子型表面活性剂，如吐温（吐温（TweenTween）、特特里顿里顿(Triton)(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。 由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如新洁而灭等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。 回本节4、添加产酶促进剂、添加产酶促进剂 产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质未阐明清楚的物质。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高120倍；添加聚乙烯醇（Polyvinyl a

36、lcohol）可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度定所添加的产酶促进剂的种类和浓度。怎样优化培养基？怎样优化培养基？培养基优化是工业发酵永恒培养基优化是工业发酵永恒不变的主题。！不变的主题。！补充知识：试验设计试验设计 在工业化发酵生产中，发酵培养基的设计是十分重要的，因为培养基的成分对产物浓度、菌体生长都有重要的影响。实验设计方法发展至今可供人们根据实验需要来选择的余地也很大。 单因素法（One at a time） 正交实验设计（Orthogonal design） 均匀设计 (U

37、niform design) 全因子实验设计(Full factorial design) 部分因子设计(fractional factorial design) Plackett-Burman设计（Plackett-Burman design） 中心组合设计（Central composite design） BoxBehnken设计(BoxBehnken design) 最优化技术（实验统计）最优化技术（实验统计） 响应曲面分析法 改进单纯形优化法(Modified simplex method) 遗传算法(Genetic algorithm，GA) 第三节、第三节、 酶发酵动力学酶发酵动

38、力学1、酶生物合成的模式2、酶生产过程中细胞生长动力学3、酶生产过程中产酶动力学GoGoGo本章目录一、研究内容及意义内容：发酵过程中细胞生长速度、产物生成速度、基质消耗速度以及环境因素对这些速度的影响等。意义：在酶的发酵生产过程中，研究细胞生长动力学和发酵产酶动力学，对于了解酶的生物合成模式，发酵工艺条件的优化控制，提高酶的产率等方面均具有重要意义。前题：如何测定细胞量？1、计数法 浊度计比浊法 测定稀的细胞悬液的透光量，间接测出细胞数量的生长 。 计数器计数法 在显微镜下用血球计数器直接数出酵母菌或霉菌孢子数目，以及用细菌计数片直接测出细菌数的生长 。2、测定细胞重量测定细胞重量 细胞干重

39、称量法细胞干重称量法 直接测定单位体积培养物的细胞干重，由此代表菌体细胞物质总量。 细胞堆积容积测量法细胞堆积容积测量法 （离心压缩细胞体积法）（离心压缩细胞体积法） 用刻度锥形管测量经离心的细胞沉淀物的容积 ，由此间接表示细胞重量。 细胞组成分析法细胞组成分析法 测定一种大分子的细胞组成(如蛋白质、RNA、DNA等)，间接算出细胞的重量。 营养物消耗分析法营养物消耗分析法 测定培养基中不用于合成代谢产物的营 养物（磷酸盐、硫酸盐等）的消耗，由此间接表示生长的细胞重量。 产物重量分析法产物重量分析法 测定培养中间形成的二氧化碳，氢，ATP 等产物，由此间接换算出生长的细胞重量。二、酶生物合成的

40、模式二、酶生物合成的模式细胞在一定条件下培养生长，细胞在一定条件下培养生长， 其生长过程一般经历调整期、生长期、其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等平衡期和衰退期等4 4个阶段个阶段 通过分析比较细胞生长与酶产生的关系通过分析比较细胞生长与酶产生的关系, , 可以把酶生物合成的可以把酶生物合成的模式分为模式分为4 4种类型。即种类型。即同步合成型同步合成型，延续合成型延续合成型，中期合成型中期合成型和和滞后合成型。滞后合成型。 同步合成型同步合成型 酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度

41、与细胞生长速度紧密联系，酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系， 又称为又称为生长偶联型生长偶联型。 属于该合成型的酶，其生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进属于该合成型的酶，其生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随入旺盛生长期时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。着停止。 大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。模式进行生物合成。 例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食例如米曲霉在含有单

42、宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合成单宁酶（子酸的诱导作用下，合成单宁酶（tanase EC3.1.1.20）。）。 细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml总细胞浓度 活细胞浓度胞外酶浓度 胞内酶浓度延续合成型延续合成型 酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。 属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。例如，属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。例如， 在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养，在黑曲霉在以半乳糖醛酸

43、或果胶为单一碳源的培养基中培养，可以诱导聚半乳糖醛酸酶（可以诱导聚半乳糖醛酸酶（PolygalacturonasePolygalacturonase，EC3.2.1.15EC3.2.1.15）的生物合成。的生物合成。 细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml以半乳糖醛酸为诱导物 以含有葡萄糖的果胶为诱导物 中期合成型中期合成型 该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。 细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml 例如，枯草杆菌碱性磷酸酶（Alkaline phophatase，EC 3.1.3.1)的生物合成模式属于中期合成型。

44、这是由于该酶的合成受到其反应产物无机磷酸的反馈阻遏，而磷又是细胞生长所必不可缺的营养物质，培养基中必须有磷的存在。这样， 在细胞生长的开始阶段, 培养基中的磷阻遏碱性磷酸酶的合成，只有当细胞生长一段时间， 培养基中的磷几乎被细胞用完（低于0.01mmol/L）以后，该酶才开始大量生成。又由于碱性磷酸酶所对应的mRNA不稳定，其寿命只有30 min左右，所以当细胞进入平衡期后， 酶的生物合成随着停止。滞后合成型滞后合成型 此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为物合成并大量积累。又称为非生长偶联型非生

45、长偶联型。许多水解酶的生物合成都许多水解酶的生物合成都属于这一类型。属于这一类型。 属于滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成，主要原因是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。酶才开始大量合成。 若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。该类型酶所对应的mRNA稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。黑曲霉羧基蛋白酶生物合成 放线菌素D 对

46、产酶的影响细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml酶浓度U/ml酶浓度U/ml3022不加加入不加加入理想的酶合成模式理想的酶合成模式 酶所对应的酶所对应的mRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。存在是影响酶生物合成模式的主要因素。其中，mRNA稳定性好的，可以在细胞生长进入平衡期以后，继续合成其所对应的酶；mRNA稳定性差的，就随着细胞生长进入平衡期而停止酶的生物合成；不受培养基中存在的某些物质阻遏的，可以伴随着细胞生长而开始酶的合成；受到培养基中某些物质阻遏的，则要在细胞生长一段时间甚至在平衡期后， 酶才开始合成并大量积累。回本节 在酶的

47、发酵生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合成模式应是最理想的合成模式应是延续合成型延续合成型。因为属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。 对于其他合成模式的酶，可以通过基因其他合成模式的酶，可以通过基因工程工程 细胞工程等先进技术细胞工程等先进技术, ,选育得到优选育得到优良的菌株良的菌株, , 并通过工艺条件的优化控制并通过工艺条件的优化控制, , 使他们的生物合成模式更加接近于延续使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型合成型。 其中对于同步合成型的酶，要尽量提高其对应的

48、mRNA的稳定性，为此适当降低发酵温度是可取的措施； 对于滞后合成型的酶，要设法降低培养基中阻遏物的浓度 ，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶的生物合成提早开始； 而对于中期合成型的酶，则要在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下功夫，使其生物合成的开始时间提前， 并尽量延迟其生物合成停止的时间。三、酶生产过程中细胞生长动力学三、酶生产过程中细胞生长动力学 细胞在控制一定条件的培养基中生长的过程中,其生长速度受到细胞内外各种因素的影响,变化比较复杂，情况各不相同。 细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规律。1950年，法国的莫诺德法国的莫诺德

49、(Monod)首先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程首先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程。 在培养过程中，在培养过程中， 细胞生长速率与细细胞生长速率与细胞浓度成正比胞浓度成正比 假设培养基中只有一种限制性基质，而不存假设培养基中只有一种限制性基质，而不存在其他生长限制因素时，在其他生长限制因素时，为这种限制性基为这种限制性基质浓度的函数。质浓度的函数。KS 为莫诺德常数，为莫诺德常数， 是指比生长速率达到最是指比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。大比生长速率一半时的限制性基质浓度。无抑制的细胞生长动力学无抑制的细胞生长动力学 MonodMonod方程方程 现代细胞生长动

50、力学的奠基人Monod在1942年便指出，在培养基中无抑制剂存在的情况下，细胞的比生长速率与限制性基质浓度的关系可用下式表示：SKSsmax 该方程中 为比生长速率(s-1)； 为最大比生长速率(s-1 ， min-1 ，h-1)， S为限制性基质浓度(g/L)；Ks为饱和常数(g/L)，其值等于比生长速率为最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。Monod方程是典型的均衡生长模型，其基本假设如下： 细胞的生长为均衡式生长，因此描述细胞生长的唯一变量是细胞的浓度；培养基中只有一种基质是生长限制性基质，而其它组分为过量不影响细胞的生长； 细胞的生长视为简单的单一反应，细胞得率为一常数。 细胞的比生