电泳技术课件.ppt

1、第三节第三节 电泳技术电泳技术electrophoresis technology第一节第一节 概述概述一、电泳技术的概念一、电泳技术的概念 在直流电场中，带电粒子向与其电性在直流电场中，带电粒子向与其电性相反的电极移动的现象称为相反的电极移动的现象称为电泳电泳（electrophoresis）。）。 利用各种带电粒子电泳速度不同，对利用各种带电粒子电泳速度不同，对物质进行分离，然后对物质进行定性物质进行分离，然后对物质进行定性和定量的分析方法称为电泳分析法，和定量的分析方法称为电泳分析法，也叫也叫电泳技术电泳技术。二、电泳技术的分类二、电泳技术的分类 电泳技术的分类方法有多种，可从分电泳技术

2、的分类方法有多种，可从分离目的、电场强度、电泳媒介、电泳离目的、电场强度、电泳媒介、电泳装置、缓冲液装置、缓冲液pH等不同角度进行分类。等不同角度进行分类。 （一）按照电场强度的不同，分为常（一）按照电场强度的不同，分为常压电泳和高压电泳压电泳和高压电泳 常压电泳常压电泳的电场强度一般在的电场强度一般在210V/cm（电压在（电压在500V以下）以下） 高压电泳高压电泳的电场强度一般在的电场强度一般在20220V/cm（电压在（电压在500V以上）以上） （二）按照电泳媒介不同（有无支持（二）按照电泳媒介不同（有无支持物），分为自由电泳和区带电泳物），分为自由电泳和区带电泳 1自由电泳自由电泳

3、 自由电泳的媒介为溶液自由电泳的媒介为溶液（不用支持物），带电粒子在溶液中（不用支持物），带电粒子在溶液中自由移动，适用于生物细胞和生物大自由移动，适用于生物细胞和生物大分子的电泳分离，如显微电泳、等电分子的电泳分离，如显微电泳、等电聚焦电泳、密度梯度电泳等。聚焦电泳、密度梯度电泳等。 2区带电泳区带电泳 媒介为支持介质，被分媒介为支持介质，被分离的物质经电泳后在支持介质上形成离的物质经电泳后在支持介质上形成区带称为区带电泳。区带电泳是目前区带称为区带电泳。区带电泳是目前应用最广泛的一种电泳技术，适用于应用最广泛的一种电泳技术，适用于蛋白质、核酸等标本的分离。区带电蛋白质、核酸等标本的分离。区

4、带电泳根据支持介质的不同又分为滤纸电泳根据支持介质的不同又分为滤纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝泳、醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 （三）按照分离目的的不同，分为（三）按照分离目的的不同，分为分分析电泳和制备电泳析电泳和制备电泳。 （四）按照支持物的装置形式（电泳（四）按照支持物的装置形式（电泳装置）不同，分为装置）不同，分为水平电泳水平电泳（支持物（支持物水平放置，最常用）和水平放置，最常用）和垂直电泳垂直电泳等。等。 （五）按照缓冲液（五）按照缓冲液pH值是否均一分为值是否均一分为连续连续pH电泳和不连续电泳和不连续pH电泳。电

5、泳。 1连续连续pH电泳电泳 支持介质各处的支持介质各处的pH相同，如滤纸电泳、醋酸纤维素薄膜相同，如滤纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳等。电泳等。 2不连续不连续pH电泳电泳 支持介质各处的支持介质各处的pH不同，聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电不同，聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等。聚焦电泳等。三、电泳技术的特点三、电泳技术的特点 1凡是带电物质均可应用某一电泳技术进凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可进行定性或定量分析。行分离，并可进行定性或定量分析。 2分辨率高。分辨率高。 3可在常温下进行。可在常温下进行。 4样品用量少。样品用量少。 5操作省时简便。操作省时简便。 6设备简单。设备简

6、单。第二节第二节 电泳技术的基本原理电泳技术的基本原理一、电泳迁移率一、电泳迁移率 在在溶液中，若能吸附带电质点或者带有可溶液中，若能吸附带电质点或者带有可解离基团的物质在一定的解离基团的物质在一定的pH条件下在直流条件下在直流电场中收到所带电荷相反的电极吸引而发电场中收到所带电荷相反的电极吸引而发生移动。生移动。 根据根据Stoke定律，用定律，用Q表示表示颗粒带电量，颗粒带电量，v表示电泳速度（表示电泳速度（cm/s），），E表示电场强度表示电场强度（V/cm），），颗粒半径颗粒半径r，介质粘度系数，介质粘度系数。v=EQ/(6r) 迁移率（迁移率（）：带电颗粒在单位电场强度下）：带电颗粒

7、在单位电场强度下的电泳速度。的电泳速度。 =v/E=Q/(6r) 各种带电物质在一定的条件下测得的迁移各种带电物质在一定的条件下测得的迁移率是一物理常数。率是一物理常数。表表2-1 血清蛋白等电点与电泳迁移率血清蛋白等电点与电泳迁移率血清蛋白血清蛋白 等电点等电点 电泳迁移率电泳迁移率cm2/(Vs) 分子量分子量 白蛋白白蛋白 4.84 5.910-5 69 0001-球蛋白球蛋白 5.06 5.110-5 200 0002-球蛋白球蛋白 5.06 4.110-5 300 000-球蛋白球蛋白 5.12 2.810-5 90 000150 000-球蛋白球蛋白 6.857.30 1.010-

8、5 156 000300 000 二二 、影响电泳迁移率的因素、影响电泳迁移率的因素 （一）样品（一）样品 被分离物质的带电荷量和电泳速度成正比被分离物质的带电荷量和电泳速度成正比。 带电荷量越多，电泳速度越快。带电荷量越多，电泳速度越快。 若带电量相同，分子量大的电泳速度慢。若带电量相同，分子量大的电泳速度慢。分分子大小与电泳速度成反比。子大小与电泳速度成反比。 （二二）电场强度）电场强度 电场强度电场强度也称电势梯度，是指单位长度也称电势梯度，是指单位长度（每（每1cm）的电压降（电位降）。）的电压降（电位降）。 常压电泳常压电泳的电场强度一般为的电场强度一般为210 V/cm，高压电泳高

9、压电泳的电场强度一般为的电场强度一般为20200V/cm。常压电泳多用于分离蛋白质等大分子物质，常压电泳多用于分离蛋白质等大分子物质，高压电泳则用来分离氨基酸、小肽、核苷高压电泳则用来分离氨基酸、小肽、核苷等小分子物质。等小分子物质。 电泳速度与支持介质两端的电压成正比。电泳速度与支持介质两端的电压成正比。 例如：以滤纸作支持物，其两端浸入例如：以滤纸作支持物，其两端浸入电极缓冲液中，电极缓冲液与滤纸交电极缓冲液中，电极缓冲液与滤纸交界面的纸长界面的纸长20cm，测得的电压降为，测得的电压降为200V，那么，电场强度为，那么，电场强度为200V/20cm=10V/cm。 （三三）电泳缓冲液）电

10、泳缓冲液 电泳缓冲液起着决定粒子电荷性质和电泳缓冲液起着决定粒子电荷性质和电荷量的作用，同时起导电作用，电电荷量的作用，同时起导电作用，电泳时对缓冲液的化学组成、泳时对缓冲液的化学组成、pH值和离值和离子强度都有一定的要求。子强度都有一定的要求。 1缓冲液的缓冲液的化学组成化学组成（缓冲溶质）（缓冲溶质） 缓冲缓冲体系的组成常选用弱酸体系的组成常选用弱酸/弱酸盐、酸式盐弱酸盐、酸式盐/次次级盐。级盐。对缓冲液的要求对缓冲液的要求是化学性质稳定、是化学性质稳定、电导率低、缓冲容量大、粒子移动性好。电导率低、缓冲容量大、粒子移动性好。按此要求，缓冲液的按此要求，缓冲液的pH值确定后，第一，值确定后

11、，第一，选择缓冲液时要尽量选择选择缓冲液时要尽量选择pKa接近缓冲液接近缓冲液pH的弱酸成分，此时缓冲容量最大。第二，的弱酸成分，此时缓冲容量最大。第二，优先选用离子价数为优先选用离子价数为1价的电解质，目的是价的电解质，目的是保持离子的活度。第三，优先选择正、负保持离子的活度。第三，优先选择正、负离子移动速度相近的电解质，使电泳时离离子移动速度相近的电解质，使电泳时离子分布均匀，保证电泳区带的整齐。子分布均匀，保证电泳区带的整齐。 常用的缓冲液有巴比妥常用的缓冲液有巴比妥/巴比妥钠、柠巴比妥钠、柠檬酸檬酸/柠檬酸钠、柠檬酸钠、NaH2PO4/Na2HPO4、Tris/HCL等。巴比妥等。巴比

12、妥/巴比妥钠是血清巴比妥钠是血清蛋白电泳常用的电泳缓冲液。蛋白电泳常用的电泳缓冲液。 2pH值值 溶液的溶液的pH值决定了带电颗粒解值决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少。少。 如缓冲溶液的如缓冲溶液的pH值大于待分离的蛋白质的值大于待分离的蛋白质的等电点等电点pI，则蛋白质带负电荷，在电场中，则蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动。向正极移动。 当分离某一蛋白质混合物时，应选择一种当分离某一蛋白质混合物时，应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差异的能扩大各种蛋白质所带电荷量差异的pH值，值，以利于各种蛋白质的分离，当然不能过酸以利于各种蛋白

13、质的分离，当然不能过酸过碱，以免引起蛋白质变性。缓冲液的过碱，以免引起蛋白质变性。缓冲液的pH值一般设在值一般设在4.59.0为宜为宜。 3离子强度离子强度 除了要求缓冲液具有合除了要求缓冲液具有合适的化学组成和适的化学组成和pH值以外，还要求具值以外，还要求具有一定的导电能力。缓冲液的导电能有一定的导电能力。缓冲液的导电能力可用离子强度表示。在稀溶液中离力可用离子强度表示。在稀溶液中离子强度可用下式计算：子强度可用下式计算： I=CiZi2/2 I：离子强度，：离子强度，Ci：离子的浓度，：离子的浓度，Zi：离子的价数，离子的价数，代表累加。代表累加。 例：求例：求0.015M Na2SO4

14、溶液的离子强度：溶液的离子强度： I=（0.015212+0.01522）/2=0.045（mol/L） 缓冲液的离子强度影响缓冲容量、产热效缓冲液的离子强度影响缓冲容量、产热效应和电泳速度。离子强度大，缓冲容量大，应和电泳速度。离子强度大，缓冲容量大，pH值稳定；但离子强度大，电泳速度慢；值稳定；但离子强度大，电泳速度慢；同时离子强度大，电流强度大，产热多，同时离子强度大，电流强度大，产热多，蒸发快。速度慢，会导致时间过长，标本蒸发快。速度慢，会导致时间过长，标本扩散。速度快，导致区带不整齐，分辨率扩散。速度快，导致区带不整齐，分辨率低。综合考虑，离子强度低。综合考虑，离子强度最好选在最好选

15、在0.020.2mol/L之间。之间。 （四四）支持介质）支持介质 支持介质对电泳的影响主要表现为电渗作支持介质对电泳的影响主要表现为电渗作用和吸附作用。用和吸附作用。 1电渗作用电渗作用 液体在电场中对于一个固体液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗作用。在电支持物的相对移动，称为电渗作用。在电泳时应尽量避免使用具有高电渗作用的支泳时应尽量避免使用具有高电渗作用的支持物。持物。 2吸附作用吸附作用 支持介质的表面对被分离的支持介质的表面对被分离的物质具有一定的吸附作用，使被分离样品物质具有一定的吸附作用，使被分离样品滞留而降低电泳速度，造成样品拖尾，使滞留而降低电泳速度，造成样品

16、拖尾，使电泳的分辨率降低。电泳时，要选择吸附电泳的分辨率降低。电泳时，要选择吸附作用小的支持介质。作用小的支持介质。（五）温度（五）温度电泳过程中由于通电产生焦耳热，热对电电泳过程中由于通电产生焦耳热，热对电泳有很大影响。泳有很大影响。温度每升高温度每升高1，迁移率约增加，迁移率约增加2.4%。为降低热效应对电泳的影响，可控制电压为降低热效应对电泳的影响，可控制电压或电流，或安装冷却散热装置。或电流，或安装冷却散热装置。（六）分子的性质和形状（六）分子的性质和形状（七）蒸发（七）蒸发第三节第三节 电泳仪电泳仪 电泳仪是进行电泳分析的仪器电泳仪是进行电泳分析的仪器 主要由主要由电源电源和和电泳槽

17、电泳槽两部分组成两部分组成一、电源一、电源 电源是产生电泳电场的装置，电源是产生电泳电场的装置，常为可常为可调式直流电源。调式直流电源。一般都用交流电源经一般都用交流电源经过整流、滤波后获得，主要部分是一过整流、滤波后获得，主要部分是一个整流器，可用晶体管、电子管或可个整流器，可用晶体管、电子管或可控硅整流。多数装有稳压装置，用电控硅整流。多数装有稳压装置，用电压表和电流表指示输出电压及电流的压表和电流表指示输出电压及电流的大小。大小。 二、电泳槽二、电泳槽 电泳槽是用来盛装缓冲液和进行电泳的场电泳槽是用来盛装缓冲液和进行电泳的场所，多用透明塑料膜压或用有机玻璃胶合所，多用透明塑料膜压或用有机

18、玻璃胶合而成。电泳槽外形有水平式、垂直式和圆而成。电泳槽外形有水平式、垂直式和圆盘式等多种，其中水平式电泳槽一般由电盘式等多种，其中水平式电泳槽一般由电极、缓冲液槽、电泳介质支架和一个透明极、缓冲液槽、电泳介质支架和一个透明的绝缘盖等几部分组成。电极分别装在两的绝缘盖等几部分组成。电极分别装在两个缓冲液槽内。电极应具有良好的导电性、个缓冲液槽内。电极应具有良好的导电性、抗腐蚀性和抗电解作用，常用铂丝或镍铬抗腐蚀性和抗电解作用，常用铂丝或镍铬合金丝等材料。合金丝等材料。 支持介质放在两个支架上，其两端与支持介质放在两个支架上，其两端与电泳液接通而形成盐桥。通电后，电电泳液接通而形成盐桥。通电后，

19、电流只能在支持介质体上通过，电泳物流只能在支持介质体上通过，电泳物质在其上泳动。绝缘盖起防止缓冲液质在其上泳动。绝缘盖起防止缓冲液蒸发以及防触电的保护作用。有些电蒸发以及防触电的保护作用。有些电泳槽有冷却装置以保证电泳介质的温泳槽有冷却装置以保证电泳介质的温度不至过高。度不至过高。 电泳操作电泳操作一般有支持介质的制备或饱一般有支持介质的制备或饱和，加样，电泳分离样品、染色及洗和，加样，电泳分离样品、染色及洗脱比色或光密度扫描定量等步骤。脱比色或光密度扫描定量等步骤。第四节第四节 几种常用电泳技术几种常用电泳技术一、醋酸纤维素薄膜电泳一、醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素薄膜电泳（醋酸纤维素薄膜电

20、泳（cellulose acetate electrophoresis,CAE）是）是以醋酸纤维素薄膜以醋酸纤维素薄膜作为支持物作为支持物的一种区带电泳技术。醋酸纤维的一种区带电泳技术。醋酸纤维素薄膜是将纤维素的羟基乙酰化形成纤维素素薄膜是将纤维素的羟基乙酰化形成纤维素醋酸酯，然后将其溶于有机溶剂后涂抹成均醋酸酯，然后将其溶于有机溶剂后涂抹成均匀的薄膜，干燥后就成为醋酸纤维素薄膜。匀的薄膜，干燥后就成为醋酸纤维素薄膜。 该膜具有均一的泡沫状结构，厚度约为该膜具有均一的泡沫状结构，厚度约为120m，通透性好，对分子移动阻力少，是，通透性好，对分子移动阻力少，是一种良好的电泳支持物。一种良好的电泳

21、支持物。（一）优点（一）优点 1吸附作用和电渗作用都很小吸附作用和电渗作用都很小 2分离速度快分离速度快 3分离区带清晰，分辨率高分离区带清晰，分辨率高 4样品用量少样品用量少 5操作简便操作简便 6易定量、可长期保存易定量、可长期保存 （二）缺点（二）缺点 1薄膜吸水性差薄膜吸水性差 2分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低 3不适于制备不适于制备【实验名称】醋酸纤维素薄膜电泳分离血浆蛋白质【实验原理】血浆中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在

22、醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白，纤维蛋白原条区带。（三）操作步骤（三）操作步骤（三）操作步骤（三）操作步骤 处理膜处理膜点样点样电泳电泳染色染色漂漂洗洗透明透明测定吸光度测定吸光度操作步骤 1、薄膜准备、薄膜准备将醋酸纤维素薄膜切成28cm的小条。在薄膜粗面一端1.5cm处用铅笔轻轻画一横线。在薄膜角上用铅笔作一标记。将醋酸纤维素薄膜浸泡于缓冲液中20min。操作步骤醋酸纤维素薄膜规格及点样位置8cm2cm点样线点样区1.5cm(粗面）操作步骤 2、电泳仪准备、电泳仪准备 在电泳槽内加入缓冲液，使两个电

23、极在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高。先剪裁尺寸合适的滤纸槽内的液面等高。先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥。它是联系醋酸纤维薄架上，即为滤纸桥。它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的膜和两极缓冲液之间的“桥梁桥梁”。 操作步骤 4、上槽、上槽待血浆吸入膜后，以薄膜粗面向下粗面向下、点样端置阴极端

24、点样端置阴极端，两端紧贴在滤纸盐桥上，加盖，平衡约5min，使薄膜渗透的缓冲液达到平衡。 切勿使点样处与电泳槽接触切勿使点样处与电泳槽接触操作步骤 5、电泳、电泳检查电泳装置是否正确，开启电源，调节电压、电流，然后通电4060min。电压：110130V（10V/cm膜长）薄膜的有效长度是两电极缓冲液面之间滤纸盐桥和薄膜的长度之和。电流：0.40.6mA/cm膜宽有数条膜便求数条膜宽的总和。操作步骤 6、染色和漂洗、染色和漂洗电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换23次），至背景颜色脱净为止。取出膜，用滤纸吸干即可。操作

25、步骤 血浆蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱电泳方向A12纤维蛋白原操作步骤 7、透明、透明薄膜完全干燥后，浸入透明液中20min后，取出平贴在玻璃板上（不要留有气泡），完全干燥后即成透明的薄膜图谱，要作扫描或照相用。可长期保存。（五）应用（五）应用 醋酸纤维素薄膜电泳已广泛用于各种醋酸纤维素薄膜电泳已广泛用于各种生物分子的分离分析中，如血红蛋白、生物分子的分离分析中，如血红蛋白、血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、同工酶及类固醇等的分离和测定。白、同工酶及类固醇等的分离和测定。 正常人血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳示意图正常人血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳示意图二、琼脂糖凝胶

26、电泳二、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳（琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis,AGE）是以）是以琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶作为支持物作为支持物的一种区带电泳技术。琼脂糖的一种区带电泳技术。琼脂糖凝胶电泳的吸附作用和电渗作用均较小，凝胶电泳的吸附作用和电渗作用均较小，分辨率和重现性较好，电泳图谱清晰，电分辨率和重现性较好，电泳图谱清晰，电泳速度快，区带易染色、洗脱和定量，常泳速度快，区带易染色、洗脱和定量，常用于生物大分子如：血浆脂蛋白、免疫球用于生物大分子如：血浆脂蛋白、免疫球蛋白、同工酶和蛋白、同工酶和DNA酶切片段的分离。酶切片段的分离。三、聚丙烯酰胺凝胶电泳三

27、、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）是以聚丙烯）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的一种区带电泳技术。酰胺凝胶作为支持物的一种区带电泳技术。这种凝胶电泳的这种凝胶电泳的主要特点主要特点是凝胶具有电泳是凝胶具有电泳和分子筛的双重作用，大大提高了分辨能和分子筛的双重作用，大大提高了分辨能力。聚丙烯酰胺凝胶电泳能精细分离各种力。聚丙烯酰胺凝胶电泳能精细分离各种蛋白质，还可测定蛋白质和核酸的分子量，蛋白质，还可测定蛋白质和核酸的分子量，进行核酸的序列分析等，特别在基因变异进行核酸的序列分析等，特别在基因

28、变异或同工酶的研究中应用广泛。或同工酶的研究中应用广泛。（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点 1具有分子筛作用，分离效果好。具有分子筛作用，分离效果好。 2设备简单，样品用量少（设备简单，样品用量少（1100微克），不微克），不易扩散，分辨率高。易扩散，分辨率高。 3不带电荷，几乎没有电渗作用。不带电荷，几乎没有电渗作用。 4可通过控制凝胶浓度来调节凝胶的孔径，以可通过控制凝胶浓度来调节凝胶的孔径，以适合不同分子量样品的分离。适合不同分子量样品的分离。 5化学稳定性好，由于分子结构中富含酰胺基，化学稳定性好，由于分子结构中富含酰胺基，聚丙烯酰胺凝胶是一种稳定的亲水胶体。

29、聚丙烯酰胺凝胶是一种稳定的亲水胶体。 6机械强度好，有弹性，无色透明，易观察，机械强度好，有弹性，无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。可用检测仪直接测定。 不足之处不足之处是聚丙烯酰胺凝胶单体对神是聚丙烯酰胺凝胶单体对神经系统及皮肤有毒性作用，但聚合后经系统及皮肤有毒性作用，但聚合后就没有毒性了。就没有毒性了。（二）聚丙烯酰胺凝胶的聚合（二）聚丙烯酰胺凝胶的聚合 聚丙烯酰胺是由聚丙烯酰胺是由单体单体丙烯酰胺和丙烯酰胺和交联交联剂剂甲叉双丙烯酰胺通过化学聚合或光甲叉双丙烯酰胺通过化学聚合或光聚合反应而形成的大分子。聚合时，聚合反应而形成的大分子。聚合时，丙烯酰胺（丙烯酰胺（CH2CHCONH2

30、）的）的双键打开，通过加成反应形成含有酰双键打开，通过加成反应形成含有酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两条胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两条链通过甲叉双丙烯酰胺以亚甲基桥方链通过甲叉双丙烯酰胺以亚甲基桥方式交联起来，形成具有三维结构的多式交联起来，形成具有三维结构的多聚物。聚物。 过硫酸铵四甲基乙二胺（过硫酸铵四甲基乙二胺（TEMED）为）为化学催化系统化学催化系统。当在丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的溶液中加入这种催化当在丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的溶液中加入这种催化系统后，过硫酸铵作为系统后，过硫酸铵作为引发剂引发剂提供自由基，通过自由基提供自由基，通过自由基传递，形成丙烯酰胺自由基从而引发聚合反应。

31、四甲基传递，形成丙烯酰胺自由基从而引发聚合反应。四甲基乙二胺作为乙二胺作为加速剂加速剂，可加快引发剂释放自由基的速度，可加快引发剂释放自由基的速度，具体反应为过硫酸铵在溶液中形成过硫酸自由基具体反应为过硫酸铵在溶液中形成过硫酸自由基（SO4），该自由基可激活加速剂，加速剂作为电子载），该自由基可激活加速剂，加速剂作为电子载体提供一个未配对电子将丙烯酰胺单体转化为丙烯酰胺体提供一个未配对电子将丙烯酰胺单体转化为丙烯酰胺自由基，经反应多聚物聚合成网状结构的凝胶。聚合的自由基，经反应多聚物聚合成网状结构的凝胶。聚合的速度与温度成正比，如温度过低，或体系中有氧分子及速度与温度成正比，如温度过低，或体系

32、中有氧分子及不纯物质都会延缓凝胶的聚合。为了防止溶液气泡中含不纯物质都会延缓凝胶的聚合。为了防止溶液气泡中含有氧分子而妨碍聚合，在聚合前最好先将溶液分别抽气有氧分子而妨碍聚合，在聚合前最好先将溶液分别抽气除氧，再混合配制。除氧，再混合配制。 核黄素核黄素TEMED为为光催化系统光催化系统，在光，在光照下部分核黄素被还原成无色核黄素，照下部分核黄素被还原成无色核黄素，在有痕量氧存在的条件下，无色核黄在有痕量氧存在的条件下，无色核黄素再被氧化为带有自由基的核黄素，素再被氧化为带有自由基的核黄素，从而引发聚合反应，在此系统中，核从而引发聚合反应，在此系统中，核黄素是黄素是引发剂引发剂，四甲基乙二胺是

33、，四甲基乙二胺是加速加速剂剂。（三）聚丙烯酰胺凝胶孔径和机械强度的调节（三）聚丙烯酰胺凝胶孔径和机械强度的调节 聚丙烯酰胺凝胶的孔径、机械强度、聚丙烯酰胺凝胶的孔径、机械强度、弹性和透明度都与弹性和透明度都与凝胶总浓度（凝胶总浓度（T）和和交联度（交联度（C）有关。有关。T表示每表示每100ml凝凝胶溶液中含有单体和交联剂的总克数胶溶液中含有单体和交联剂的总克数（g/dl）。）。C则表示凝胶溶液中交联剂则表示凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总克数的百分比。占单体和交联剂总克数的百分比。 凝胶的凝胶的孔径孔径主要由主要由T决定，也与决定，也与C有关。有关。T值越大，凝胶孔径越小。当值越大，凝胶孔径

34、越小。当T值固定不变，值固定不变，C值在值在5%时，凝胶孔径最小，大于或小于时，凝胶孔径最小，大于或小于5%时凝胶的孔径都会增大。在电泳中凝胶时凝胶的孔径都会增大。在电泳中凝胶的孔径是一个重要因素，往往会对分离效的孔径是一个重要因素，往往会对分离效果起决定作用。常用于分离血浆蛋白的聚果起决定作用。常用于分离血浆蛋白的聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺凝胶是标准凝胶标准凝胶，T为为7.5 g/dl ，孔径大约为孔径大约为5nm，适用于分子量，适用于分子量104106的蛋白质的分离。在科研工作中，一般是的蛋白质的分离。在科研工作中，一般是先进行预实验，以选出最适的凝胶浓度。先进行预实验，以选出最适的凝胶浓度

35、。 凝胶的凝胶的机械强度、弹性和透明度机械强度、弹性和透明度主要取决于主要取决于T及及单体与交联剂的比值。通常单体与交联剂的比值。通常T值越大，机械强度值越大，机械强度越强，其中单体与交联剂的比值尤为重要。实验越强，其中单体与交联剂的比值尤为重要。实验表明，表明，T2.5g/dl，不能成胶；，不能成胶；T15g/dl，凝胶的硬度、脆性增加，易，凝胶的硬度、脆性增加，易于折断。单体与交联剂的比值小于于折断。单体与交联剂的比值小于10，交联度过，交联度过大，凝胶坚硬易碎，颜色乳白不透明；单体与交大，凝胶坚硬易碎，颜色乳白不透明；单体与交联剂的比值大于联剂的比值大于100，凝胶又过软，难以成形。，凝

36、胶又过软，难以成形。一般一般T为为510g/dl，单体与交联剂的比值为，单体与交联剂的比值为2040，可制得弹性较好，软硬适中，无色透明的凝，可制得弹性较好，软硬适中，无色透明的凝胶。胶。（四四）不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳）不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 不连续聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳一般在内不连续聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳一般在内径为径为0.7厘米，长厘米，长10厘米的小玻璃管内，把厘米的小玻璃管内，把三种性质不完全一样的聚丙烯酰胺凝胶重三种性质不完全一样的聚丙烯酰胺凝胶重叠起来：样品胶在最上层，浓缩胶在中层，叠起来：样品胶在最上层，浓缩胶在中层，分离胶在最下层。其中样品胶和浓缩胶的分离胶在最下层。其中样

37、品胶和浓缩胶的缓冲液、缓冲液、pH值和孔径大小完全一样，区别值和孔径大小完全一样，区别是样品胶中有样品，而浓缩胶中没有样品。是样品胶中有样品，而浓缩胶中没有样品。分离胶的孔径一般比前两种小，分离胶的孔径一般比前两种小，pH值也不值也不相同。相同。 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的电泳器示意图不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的电泳器示意图表表2-2 血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳的条件血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳的条件凝胶总浓度凝胶总浓度 交联剂百分比交联剂百分比 Tris-HCl缓冲液缓冲液 凝胶孔径凝胶孔径 主要效应主要效应 T（%） C（%） pH 样品胶样品胶 3 20 6.7 大大 （含有（含有样品）

38、样品）浓缩胶浓缩胶 3 20 6.7 大大 浓缩效浓缩效应应分离胶分离胶 7 2.5 8.9 小小 电荷效电荷效应、应、 分子分子筛效应筛效应（五五）操作步骤）操作步骤 安装设备安装设备配制凝胶（包括配制溶液、配制凝胶（包括配制溶液、制备凝胶、缓冲液）制备凝胶、缓冲液）电泳电泳染色染色电解脱色电解脱色 四、等电聚焦电泳四、等电聚焦电泳（了解）（了解） 等电聚焦电泳等电聚焦电泳（isoelectric focusing electrophoresis,IEF）是）是20世纪世纪60年代中年代中期问世的一种利用具有期问世的一种利用具有pH梯度的两性电解梯度的两性电解质为载体，分离等电点不同的蛋白质

39、等两质为载体，分离等电点不同的蛋白质等两性分子的电泳技术。等电聚焦电泳与其他性分子的电泳技术。等电聚焦电泳与其他电泳技术相比具有更高的分辨率，等电点电泳技术相比具有更高的分辨率，等电点仅相差仅相差0.01pH的蛋白质即可分开，因此特的蛋白质即可分开，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分，同时也可用于确定被分离物蛋白质组分，同时也可用于确定被分离物质的等电点。质的等电点。五五、双向电泳、双向电泳 双向电泳是在单向电泳后，将方向调转双向电泳是在单向电泳后，将方向调转90o，再进行第二，再进行第二次电泳的技术。第一相电泳时，样品按电荷效应分离，次电

40、泳的技术。第一相电泳时，样品按电荷效应分离，常用等电聚焦电泳。第二相电泳时，同一区带各组分电常用等电聚焦电泳。第二相电泳时，同一区带各组分电荷密度相同，已不能再按电荷效应分离，而是按照分子荷密度相同，已不能再按电荷效应分离，而是按照分子量不同进行分离，常用量不同进行分离，常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。 等电聚焦电泳可将血清蛋白分离为等电聚焦电泳可将血清蛋白分离为50多条区带，第二相多条区带，第二相电泳后，最终可将血清蛋白分离为电泳后，最终可将血清蛋白分离为200多个斑点，分辨率多个斑点，分辨率极高。极高。 双向电泳的应用包括蛋白质组分析、疾病指标的检测、双向电泳的应用包括

41、蛋白质组分析、疾病指标的检测、细胞的分化、恶性肿瘤和药物的研究等。双向电泳主要细胞的分化、恶性肿瘤和药物的研究等。双向电泳主要用于蛋白质组的分析。用于蛋白质组的分析。双向凝胶电泳仪双向凝胶电泳仪胶性胶性 PH9中电中电加解加解入质入质了溶了溶双液双液 PH3加上电加上电场后建场后建立稳定立稳定PH梯度梯度蛋白质蛋白质溶液加溶液加入，建入，建立电场立电场染色后，蛋染色后，蛋白质因白质因PI值值不同，沿不同，沿PH梯度分离开梯度分离开第一向第一向等电聚焦等电聚焦PI逐逐渐渐降降低低等电聚焦胶放在SDS聚丙烯酰胺凝胶上第二向第二向SDS聚丙聚丙烯酰胺凝胶烯酰胺凝胶电泳电泳分子分子量逐量逐渐降渐降低低PI 逐渐降低逐渐降低 双向凝胶电泳示意图双向凝胶电泳示意图此课件下载可自行编辑修改，供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！