蚓激酶研究和应用进展课件.pptx

1、早在早在1596年我国年我国本草纲目本草纲目对蚯蚓的药用就对蚯蚓的药用就有详细记载。有详细记载。1878年法国人发现蚯蚓消化器官的分年法国人发现蚯蚓消化器官的分泌物能降解纤维蛋白。泌物能降解纤维蛋白。20世纪世纪70年代以来年代以来,中国、中国、日本和韩国的科学家对蚯蚓提取物进行了酶学组分、日本和韩国的科学家对蚯蚓提取物进行了酶学组分、理化性质及临床应用的研究。理化性质及临床应用的研究。1979年年Pak发现蚯蚓发现蚯蚓提取物中含有能降解酪蛋白、明胶和清蛋白的水解提取物中含有能降解酪蛋白、明胶和清蛋白的水解酶。酶。1983年年Mihara等从粉正蚓等从粉正蚓(Lumbricus rubullu

2、s)中分离出中分离出具有溶纤活力的粗提物具有溶纤活力的粗提物,并将其命名为蚓激酶并将其命名为蚓激酶(lumbrokinase)。随后。随后,蚯蚓纤维蛋白水解酶蚯蚓纤维蛋白水解酶(earthworm fibrinolytic enzymes,EFE)、丝氨酸内切蛋白酶、蚯蚓磷、丝氨酸内切蛋白酶、蚯蚓磷脂激酶等相继被分离出来。脂激酶等相继被分离出来。其中其中EFE水解纤维蛋白的活性较强水解纤维蛋白的活性较强,适用于防治血栓及栓塞适用于防治血栓及栓塞性疾病。因此性疾病。因此EFE的分离纯化、理化性质、作用机制及临的分离纯化、理化性质、作用机制及临床应用受到国内外广泛的重视。床应用受到国内外广泛的重视

3、。1蚓激酶的分离纯化11来源于粉正蚓(Lumbricus rubullus)的纤溶酶通过层析、电泳、质谱等对氨基酸组成、N-末端序列等方面的研究,Nakajima等确定了来源于粉正蚓的EFE含有6个丝氨酸蛋白酶组分:F-I-0,F-I-1,F-I-2,F-,F-1,F-2,并测定它们的N端序列,见表1。12来源于赤子爱胜蚓(Eiseniafetida)的纤溶酶周元聪等发现赤子爱胜蚓提取物中至少含有7组具有溶解纤维蛋白活性的组分。经FPLC分离,得到3种纯的纤溶酶,其中1种同工酶N末端是亮氨酸底物专一性研究结果显示,该酶的专一性不同于尿激酶而与组织型纤溶酶原激活物相似。嘉树等报道了来源于赤子爱胜

4、蚓的相对分子质量为45103的EFE由2个片断组成(26103和18103),其中大片段有催化活性,其N端序列与日本报道F-1(或F-2)和F-的相似。中国科学院生物物理研究所蚓激酶研究小组从事该领域研究已经有十几年的时间,最近他们将来自赤子爱胜蚓的蚓激酶组分A(EFEa)培养出了单晶,并用X-射线衍射分析其晶系,测定晶胞参数,收集完整的分辨率数据,测定氨基酸序列,构建完整的结构模型,并提出与底物结合、剪切机制。EFEa是第一个被确定三维晶体结构的蚓激酶组分,也是第一个来源于环节动物的丝氨酸蛋白酶的晶体结构。序列比较显示EFEa与F-基本一致。北京百奥药业公司最近也分离出蚓激酶单一组分,体外溶

5、栓试验和毒性试验均显示良好结果,目前尚无进一步的报道。李莉4采用琼脂糖凝胶-间氨基苯硼酸亲和层析法从蚯蚓的匀浆中分离纯化出一糖基化组分,经SDS-PAGE检测为单一成分,质谱测定其相对分子质量为24 193。N-末端的序列为:Ala-Glu-Val-Cys-Cys-Asp-Ile-,与已知的纤溶酶都不同。该糖基化组分对纤维蛋白和蛋白酶底物Chromozym TH具有显著的水解活性。13来源于双胸蚓(Lumbricus bimastus)的蚓激酶牛勃等5经分离纯化获得了一个相对分子质量为221103的单一蛋白酶组分。梁国栋等测定了一种来源于双胸蚓蚯蚓纤溶酶的mRNA序列(Genbank,AF10

6、9648),其编码的成熟肽序列N端与F-一致,但与F-1和F-2的序列同源性仅35%左右。14蚓激酶的序列测定和基因组结构及重组研究日本学者Nakajima等6报道了来源于粉正蚓中的具纤溶活性的丝氨酸蛋白酶组分F-1, F-2的mRNA的序列测定结果(GenBank, AB045719,AB045720), F-1和F-2的同源性达到90%左右,但是为确切不同的2种蛋白质。梁国栋等7,8克隆到2个蚯蚓纤溶酶基因,其中PI239编码283个氨基酸前体,成熟肽含有239个氨基酸,与国外从粉正蚓属蚯蚓中获得的纤溶酶基因有很高的同源性,属酸性蛋白质、丝氨酸蛋白酶,与人凝血酶、t-PA和尿型纤溶酶原激活

7、物(u-PA)有一定结构同源性。另一个基因为PI242,是新发现的基因,2001年向GenBank投送了与F-同源性相近的组分PI239(GenBank,AF433650),并向中国国家知识产权局申报了名为正蚓科双胸蚓属蚓激酶基因核苷酸序列及其克隆方法的发明专利(公开号:CN 1208770A)。赵晓瑜等于2001年11月报道了来源于赤子爱胜蚓(Eiseniafetida)中的一个纤溶组分的共180个氨基酸残基的氨基酸序列(GenBank,AF4322241)。较早的相关序列报道还有韩国Choi在1995年4月向Genbank投送了与日本的F-1和F-2相应的来源于双胸蚓的2种蚓激酶的mRNA

8、序列(Genbank,U25648,U25643),但至今没有发表相关的文献;英国学者Sturzenbaum在1997年1月向Genbank投送了与上述序列同源性很高的一个来源于双胸蚓的蚯蚓胰凝乳蛋白酶的mRNA序列(Genbank,AJ223152),但是没有发表相关文献。根据序列比较和同源性分析结果,同种组分日本和韩国学者研究结果存在差异,可能因为不同地域的蚯蚓基因发生不同的进化所造成的。这些序列的报道给蚓激酶更为具体的鉴定提供了可能。在蚓激酶基因重组和表达方面,Nakajima等报道了来源于粉正蚓的蚯蚓纤溶组分F-2基因的克隆和表达。中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室刘俊峰

9、等9用逆转录PCR的方法从赤子爱胜蚓中克隆了编码蚓激酶组分A的cDNA,导入大肠杆菌的表达载体pQE31和pMAL- c2X构建了相应的表达质粒,并分别在大肠杆菌菌株M15中诱导表达出了重组蛋白,一种以包涵体形式存在,而另一种是具有纤溶活性的可溶性蛋白。梁国栋等则将从我国特有的双胸蚓属(Lumbricusbimastus)中获得的蚓激酶新基因PV242,PI239分别在大肠杆菌和杆状病毒中进行了表达。这些工作为蚓激酶的进一步分子生物学研究和基因工程开发奠定了基础。2蚓激酶的酶学性质蚓激酶的共同特性包括,相对分子质量在(2030)103之间,等电点多在35,偏酸性,属于丝氨酸蛋白酶类。pH稳定范

10、围广,有较好的热稳定性。大部分蚓激酶具有直接降解纤维蛋白(原),和激活纤溶酶原为纤溶酶的双重活性。21最适pH值、温度及稳定性来源于赤子爱胜蚓的纤溶酶在pH410的范围内活力较强,在25下最适宜pH为911,当pH12时,活力丧失。在37,pH110的范围内,依然能保持活力,大于60其酶活力丧失。来源于粉正蚓的蚓激酶较耐受热和pH值的变化,纤溶活性在pH 111,37,30 min和在pH69,60,30 min酶活力保持不变。80加热30 min,活力丧失。来源于正蚓科双胸蚓的蚓激酶有2种成分,其中EFE-为单体酶10,在pH410,室温60 min或55以下60 min酶活力保持不变。EF

11、E-F1,2具有强烈的纤溶活性11,在55,60 min活力丧失46%。22纤溶活力、底物专一性和抑制剂来源于粉正蚓的EFE 6个蛋白酶组分虽然在体外都表现出纤溶活性,但其纤溶活力、底物专一性和抑制剂却存在差异。根据这些底物专一性的特征确定这6个组分都是丝氨酸蛋白酶,其中2个组分(F-1,F-2)为胰蛋白酶类型,F-1,F-2在对不同底物的作用中表现出很强的活性和类似的底物特异性,对H-D-Phe-Pip-Arg-pNA作用最强。3种组分(F-I-0,F-I-1,F-I-2)为胰凝乳蛋白酶类型,F-I-1,F-I-2表现出类似的底物特异性,对H-D-Ile-Pro-Arg-pNA作用最强,F-

12、I-0对H-D-ValLeu-Arg-pNA作用最强。另外1种组分(F-)为弹性蛋白酶和胰蛋白酶类。F-对Meo-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA有作用,以人纤溶酶为标准,采用平板法测定其水解纤维蛋白的活力由高到低排列为:F-1,F-2,F-,F-I-0,F-I-1,F-I-2,其对小鼠尾静脉注射给药的LD50值分别为33,38,27,114,135和88 mgkg-1。二异丙基氟磷酸酯(DFP)、大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)、抑蛋白酶肽(aprotini)均能强烈抑制F-1和F-2,部分抑制其他组分;N-对甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮(TLCK),甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK),

13、弹性蛋白酶抑制剂(elastatinal),EDTA和6-氨基己酸对EFE无抑制作用。李莉等在研究来源于赤子爱胜蚓的EFEa底物专一性时采用羰基二咪唑活化的SepharoseCL-6B琼脂糖凝胶将EFEa固定化。固定化EFEa残留活性为天然酶的55%60%,但在热和酸碱的环境中稳定性有所提高。固定化EFEa分别水解纤维蛋白原和纤溶酶原,测定水解片断N-末端的氨基酸序列并推断酶切位点。EFEa在纤溶酶原上有4个切点:Lys77-Arg78,Arg342-Met343,Ala444-Ala445及Arg557-Ile558。Arg557-Ile558是t-PA和u-PA的切点,产生的纤溶酶可以降解

14、纤维蛋白,Ala444-Ala445之间肽键的水解产生的小纤溶酶,具有较弱的活性。EFEa水解纤维蛋白原的方式与人类嗜中性粒细胞弹性蛋白酶相同:在降解C末端区域后,在N-端Val21-Glu22切开(与凝血酶不同),破坏了纤维蛋白单体的互相识别,由此产生可溶性片段。EFEa底物专一性较宽,能水解弹性蛋白酶、胰蛋白酶和凝血酶的生色底物,反应速率比为1 2 4。另外,弹性蛋白酶和胰蛋白酶的专一性抑制剂也能显著抑制EFEa活性。结合纤维蛋白原和纤溶酶原的水解位点,进一步表明EFEa具有胰蛋白酶类和弹性蛋白酶类的双重水解特性。EFE-抗血栓的药理过程是在直接和间接(激活纤溶酶原)水解纤维蛋白的同时,降

15、低血液中纤维蛋白原浓度的多重机制而实现的。来源于正蚓科双胸蚓的蚓激酶有2种组分,EFE-为单体酶,有直接和间接的纤溶活性。EFE-F1,2具有强烈的纤溶活性,用其抑制剂4 molL-1脲处理1h活性仅损失56%,EFE-F3对合成底物S-2288和chromozym P的Km分别是001 mmolL-1和002 mmolL-1,对2种底物均表现为竞争性抑制,Ki均为1 mmolL-1。来源于巨蚓科锯齿远蚓的EFE-2和EFE-4是单体酶,属糖蛋白酶。EFE-2有直接间接纤溶活性。利马豆胰蛋白酶抑制剂(LBT)能100%抑制EFE-2的活性,TLCK能抑制其60%活性,DFP能抑制其20%活性。

16、EFE-2将人血纤维蛋白原中的3条主链及纤维蛋白溶酶原降解为小分子的多肽和蛋白质,能溶解人凝血块。水解对甲苯磺酰精氨酸甲酯(TAME)速率大于苯甲酰赖氨酸甲酯(TLME)。3肠道吸收研究为了研究EFE能否通过肠上皮吸收,且在血液循环中保持其生物学功能,赫荣桥研究小组制备了抗EFE-1抗体。肠段保温培养的免疫学研究结果表明,10%15%EFE-1被肠上皮所吸收,在肠上皮细胞中可通过免疫组织化学的方法检测到该酶的存在。另外,对小鼠腹腔注射EFE-1后,发现血清中存在EFE-1(约10%),表明该酶能通过肠上皮转运入血。对血浆样品的免疫印迹分析检测到了硝酸纤维素膜上的单一蛋白带。从小鼠采集血清样品取

17、代血浆,得到类似的结果。而用注射生理氯化钠溶液对照时,未检测到任何信号。印迹结果显示随着时间的推移,血浆中EFE-1的浓度不断增加,直到注射后60 min达到最大灰度值。吸收入血的酶估计约占总注射量的10%。免疫印迹试验表明整分子EFE-1能从腹膜转运入血。通过Chromozym TH分析测定,腹腔注射60min后血液中蚓激酶活性达到最大(30%),提示蚓激酶口服整分子吸收有效。Walker和Isselbacher在研究蛋白质HRP的整分子吸收时提出胞饮-胞吐作用的可能机制,并指出穿过表皮的转运路线可以是通过细胞,也可以是通过细胞间隙。在细胞内的转运,是一些蛋白质与肠上皮的表面受体结合,接着卷

18、入蛋白质内陷形成吞噬体(例如溶酶体),其中的蛋白质可能发生降解。重要的着色物质位于肠上皮细胞中,EFE-1转运的主要通道是一种细胞内的方式。其本身即是一个很强的蛋白酶,对细胞内的一些酶的降解作用有抗性。因此,EFE-1能以完整的形式通过胞吐作用自细胞膜释放。大分子的吸收有一定选择性,一些蛋白质的N-末端序列可能影响其转运。据Schwarze等13报道,在不能穿越细胞膜的-半乳糖苷酶的N-末端添加来自人免疫缺陷病毒的TAT蛋白的11个氨基酸的导肽序列后,-半乳糖苷酶则可以穿过细胞膜。EFE-1和EFE-2的N-末端15个氨基酸序列的相似性为100%,因此估计EFE-2也能通过肠壁转运至血液。4蚓

19、激酶的应用蚓激酶的口服制剂在我国于1992年正式投入临床应用,主要用于防治缺血性脑血管疾病。近年来,随着蚓激酶药学和作用机制研究的深入,并由于纤维蛋白原和纤维蛋白原异常存在的广泛性以及由此引发的多种疾病,蚓激酶的临床应用也在不断拓展,如用于肺心病、美尼尔病、突发性耳聋、糖尿病、视网膜静脉阻塞、肾病综合征等。由复旦大学附属华山医院神经科、复旦大学附属中山医院神经科、上海第二医科大学瑞金医院神经科、第二军医大学长征医院神经科采用多中心、随机双盲、安慰剂对照(2 1)临床试验设计15,观察了百奥蚓激酶肠溶胶囊治疗脑梗死的疗效和安全性。对73例发病3周后的脑梗死患者,分治疗组(n=50)和对照组(n=

20、23),分别口服百奥蚓激酶肠溶胶囊60万单位和安慰剂2粒,tid,给药28 d。统一实验室检测病例的凝血、纤溶、血液流变学指标,并评价患者的神经功能缺损和生活能力缺损程度。治疗28 d后,治疗组凝血酶原时间(PT)和部分凝血活酶时间(APTT)延长;纤维蛋白原(Fg)降低,D-二聚体含量增加;组织型纤溶酶原激活物(t-PA)含量提高,纤溶酶原激活物抑制物(PAI)含量降低;血浆黏度和全血黏度改善,且均具有显著性。安慰剂对照组则改变不明显。临床神经功能缺损评价,两组均有改善,但是治疗组恢复明显,治疗组有效率为88%,对照组478%。73例患者中,治疗组出现1例轻度上消化道出血(2%),无肝肾功能

21、影响。百奥蚓激酶胶囊治疗脑梗死安全有效,可作为治疗和预防缺血性脑血管病的有效药物。翁雪莉等16观察蚓激酶对脑梗死患者血浆内皮素(ET)与降钙素基因相关肽(CGRP)的影响。结果表明蚓激酶胶囊可抑制血浆ET过量释放,同时提高CGRP浓度,有良好的抗缺血作用,对脑梗死有良好的疗效。欧柏青等17观察蚓激酶对冠脉介入术(PCI)后血纤维蛋白原浓度(Fg)变化的影响。选择经冠脉造影证实冠状动脉存在病变,需行择期PCI术者共65例,随机分为对照组(n=27)和蚓激酶治疗组(n=38)。术前1周开始用药,观察两组在术前1周、术前1日、术后次日及术后1周血纤维蛋白原浓度的变化。对照组Fg术后1周与术前1周相比

22、明显增高(483106)比(386073) gL-1,P001,与蚓激酶组术后1周相比差异有显著性意义(483106)比(416087) gL-1,P005。可见PCI可导致Fg浓度升高,术前口服蚓激酶对这种不利的反应有一定预防作用。舒锦等18观察蚓激酶治疗心绞痛的疗效。冠病心绞痛患者62例随机分成加服蚓激酶胶囊组32例和不加服蚓激酶胶囊对照组30例,疗程均为4周,两组进行疗效对比。蚓激酶组临床有效率及心电图ST段、T波改善率分别为93%与63%,对照组临床有效率及心电图改善率依次为66%与37%,两组比较有显著性差异(P001)。两组均未发现不良反应。结果表明蚓激酶治疗冠心病心绞痛安全有效,

23、能有效降低血黏度。巩红等19采用医院处方分析方法,对北京地区2002年第4季度-2003年第3季度门诊、病房对抗凝血药物的处方数据进行比较。通过统计,北京地区使用抗凝血药的患者人数基本稳定,在临床应用中,口服制剂以华法林、蚓激酶为主导地位。欧洲、美国和中国的脑血管治疗指南中,均将溶栓药物作为主要治疗手段之一。从开始作为药物使用到现在,溶栓剂的开发基本上分为三代20。第一代包括链激酶和尿激酶,它们虽然具有较好的溶栓效果,但缺乏纤维蛋白选择性,产生全身性出血等不良反应,且链激酶重复使用时有过敏反应,因此已经被淘汰。组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、尿激酶原(pro-UK)和对-甲氧苯甲酰纤溶酶原链

24、激酶激活剂复合物(APSAC)属于第二代溶栓剂。t-PA和APSAC体外和动物实验中都有明显的纤维蛋白亲和性,出血的不良反应小,为链激酶的换代产品,虽有改进,但还不理想。因此目前国际上正致力于研究第三代溶栓剂,包括rt-PA和重组型葡萄球菌激酶(STAR)以及包括蚓激酶在内的新型溶栓剂。虽然蚓激酶已初步显现其溶栓能力强,出血的不良反应小,治疗费用低等优势,但其口服作用相对较慢,如果能研制蚓激酶针剂,将对急性心肌梗死、急性脑血栓形成和脑血管栓塞、外周动静脉血栓以及其他新鲜血栓闭塞性疾病的治疗具有重大意义。进一步纯化、研究构效关系,在增强或保持其催化活性的前提下通过对其某些特定氨基酸残基的突变或是通过相关结构域的删除、增加或融合等手段,以期提高对纤维蛋白的选择性、提高对纤溶酶原激活剂抑制剂的抗性、延长其在血液循环中的半衰期、导向溶栓、抗血栓形成等是今后蚓激酶的研究方向。