分子生物学分子杂交技术课件.ppt

1、分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交及生物芯片技术分子杂交及生物芯片技术申川军申川军广州中医药大学生物化学教研室广州中医药大学生物化学教研室分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术参考书参考书屈伸屈伸 刘志国刘志国 分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术 目目 录录 第一章第一章 生物大分子制备和分析常用技术生物大分子制备和分析常用技术 第二章第二章 蛋白质、核酸的提取与分离蛋白质、核酸的提取与分离 第三章第三章 PCR技术技术 第四章第四章 分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术 第五章第五章 分子克隆技术分子克隆技术

2、第六章第六章 外源基因转移技术外源基因转移技术 第七章第七章 蛋白质表达技术蛋白质表达技术 第八章第八章 分子标技术分子标技术 第九章第九章 分子改造技术分子改造技术 第十章第十章 测序及人工合成技术测序及人工合成技术 第十一章第十一章 基因组学技术基因组学技术 第十二章第十二章 蛋白质组学技术蛋白质组学技术 第十三章第十三章 生物芯片技术生物芯片技术 第十四章第十四章 生物信息学技术生物信息学技术 分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术参考书参考书马文丽马文丽 郑文岭郑文岭 彭翼飞彭翼飞 分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术 目录目录n第一章核酸

3、的分子结构与分子杂交的基本原理第一章核酸的分子结构与分子杂交的基本原理n第二章核酸分子杂交的类型第二章核酸分子杂交的类型n第一节固相核酸分子杂交类型第一节固相核酸分子杂交类型n一、菌落原位杂交（一、菌落原位杂交（colonyinsituhybridization）n二、斑点杂交（二、斑点杂交（dotblot）n三、三、southern印迹杂交（印迹杂交（southernblot）n四、四、northern印迹杂交（印迹杂交（northernblot）n五、组织原位杂交（五、组织原位杂交（tissueinsituhybridization）n第三章核酸探针的种类、标记及检测第三章核酸探针的种类、

4、标记及检测n第一节核酸探针的种类第一节核酸探针的种类ndna探针探针 cdna探针探针 rna探针探针 寡核苷酸探针寡核苷酸探针n第二节核酸探针的标记和检测第二节核酸探针的标记和检测n放射性同位素非放射性核酸探针放射性同位素非放射性核酸探针n第四章核酸分子杂交实验因素的优化第四章核酸分子杂交实验因素的优化n探针选择探针选择 标记方法标记方法 浓度浓度 杂交率杂交率 杂交最适温度杂交最适温度n杂交的严格性杂交的严格性 反应时间反应时间 杂交促进剂杂交促进剂n第五章斑点杂交第五章斑点杂交分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术n第六章第六章southern印迹杂交印迹杂交n第一

5、节第一节southern印迹杂交的基本原理印迹杂交的基本原理n一、一、dna从凝胶到膜上的转移方法从凝胶到膜上的转移方法n二、二、southern杂交膜杂交膜n三、核酸探针的标记三、核酸探针的标记n第二节第二节southern印迹法的基本过程印迹法的基本过程n一、一、dna样品的酶切和电泳样品的酶切和电泳n二、准备用于转移的凝胶二、准备用于转移的凝胶n三、三、dna从琼脂糖凝胶转移到固相支持物从琼脂糖凝胶转移到固相支持物n四、探针标记四、探针标记n五、杂交五、杂交n六、洗膜六、洗膜n七、杂交结果的检测七、杂交结果的检测n八、杂交膜的重复使用八、杂交膜的重复使用n九、注意事项九、注意事项n十、杂

6、交严谨性十、杂交严谨性n第七章第七章northern印迹杂交印迹杂交n第八章原位杂交第八章原位杂交n第九章菌落原位杂交第九章菌落原位杂交n第十章第十章dna芯片技术芯片技术分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术基本概念基本概念n变性变性/复性：复性：n分子杂交分子杂交：异源互补的核苷酸序列通过：异源互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对碱基配对形成稳定的杂合双链形成稳定的杂合双链分子的过程称为分子杂交。分子的过程称为分子杂交。 n分子杂交技术：分子杂交技术：凝胶电泳凝胶电泳分离待测分离待测DNA、RNA、Pr并并转移固定转移固定到支持物或结合物上，到支持物或

7、结合物上，然后与探针然后与探针/抗体抗体杂交分析。杂交分析。n探针探针(Probe)：已知序列的标记单链核酸片断，已知序列的标记单链核酸片断，用于检测与其互补的待测核酸。用于检测与其互补的待测核酸。分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术Base pairing occurs in duplex DNA and also in intra- and inter-molecular interactions in single-stranded RNA (or DNA). 分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术基本概念基本概念n原位杂交（原位杂交（In

8、situ hybridization, ISH）：）：n菌落原位杂交菌落原位杂交 (Colony ISH)n组织原位杂交组织原位杂交(Tissue ISH)：n胚胎原位杂交胚胎原位杂交(Embryo ISH) ：n斑点斑点/狭缝杂交狭缝杂交(Dot/slot blot) ：分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术基本概念基本概念nBio-chip（生物芯片）（生物芯片）nDNA chip / microarraynGene chip / microarraynOligonucleotide microarrayncDNA chipnProtein chipnmicroRNA

9、 chipnLab-on-chip（芯片实验室）（芯片实验室）分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术生物大分子的印迹杂交技术生物大分子的印迹杂交技术分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术n定义：定义：凝胶电泳凝胶电泳分离待测分离待测DNA、RNA、Pr并并转移固定转移固定到结合物上，然后与探针到结合物上，然后与探针/抗体抗体杂交杂交分析分析n原理：核酸变复性（序列互补）原理：核酸变复性

10、（序列互补）/抗原抗原-抗体抗体n基本工艺：基本工艺：n凝胶电泳（原位处理）凝胶电泳（原位处理）n样品转移及固定样品转移及固定n杂交分析（免疫结合分析）杂交分析（免疫结合分析）分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术n1969 ，In situ hybridization（ISH）n1975，Southern，Southern blot: DNAn1977，Alwine，Northern blot：RNAn1979，Towbin，Western blot：Prn1982，Reinher，Eastern blot：Pr(IEF)分子生物学分子生物学 第

11、五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术-探针探针n探针基本条件（特点）探针基本条件（特点）n标记物（标记物（32p, 35S, 125I, Digoxigenin, FITC）n单链核酸（单链核酸（ssDNA，sscDNA(更常用更常用)）n高特异性（高特异性（500bp）n标记物稳定灵敏，检测方便安全标记物稳定灵敏，检测方便安全分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术-探针探针n探针的种类探针的种类nDNA probe（基因（基因copy数、病原基因诊断）数、病原基因诊断）ncDNA probe（基因表达等最常用）（基因表达等

12、最常用）nRNA probe（ISH）nOligonuleotide-probe （2550bp；基因诊；基因诊断，断，SNP分析、测序、点突变检测）分析、测序、点突变检测）分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术-探针探针n探针标记物探针标记物n放射性标记物（放射性标记物（ -*N-dNTP ）n32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)、125I(60d)n非放射性标记物非放射性标记物n半抗原：生物素、半抗原：生物素、地高辛地高辛n荧光素：异硫氰酸荧光素（荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分

13、子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术-探针探针n -32P- dNTP结构结构A、 G 、 C或或 TNHHPP32POOOOOOHOH OHHOOOHHHHOCH2分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术-探针探针分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术-探针探针n探针标记探针标记n随机引物法随机引物法n缺口平移法缺口平移法 (DNaseI and DNA聚合酶聚合酶I)n末端标记法末端标记法n碱性磷酸酶碱性磷酸酶-T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶 -32p-ATP标记标记DNA/RNA-5n末端转移酶（末端转

14、移酶（poly(N*)n）nT4DNA聚合酶聚合酶/Klenow片断片断 （粘末端补平）（粘末端补平）分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术-探针探针n探针纯化探针纯化n乙醇沉淀法乙醇沉淀法 n凝胶过滤法凝胶过滤法 （G-50 Spin column）分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术印迹印迹n印迹（转膜）支持物：印迹（转膜）支持物：n硝酸纤维素膜（硝酸纤维素膜（NC膜）膜）n尼龙膜尼龙膜 nN+-nylon （DNA/RNA）n中性膜中性膜nPVDF膜（膜（western blot）分子生物学分子

15、生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术印迹印迹n印迹（转膜）方法：印迹（转膜）方法：n毛细管虹吸转移法毛细管虹吸转移法n真空转移法真空转移法n电转移法电转移法分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术印迹印迹湿滤纸湿滤纸缓冲液缓冲液滤纸桥滤纸桥凝胶凝胶硝酸纤硝酸纤维素膜维素膜吸水纸吸水纸玻璃板玻璃板支持台支持台容器容器重物重物n毛细管虹吸转移法毛细管虹吸转移法分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术印迹印迹尼龙膜尼龙膜凝胶凝胶滤纸滤纸海绵海绵凝胶支持夹凝胶支持夹缓冲液缓冲液电极

16、电极+滤纸滤纸电极电极n电转移法电转移法分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术印迹印迹n真空转移法真空转移法-1h分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术印迹印迹真空转移装置真空转移装置分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术印迹印迹nWestern blot (SDS-PAGE及转膜系统及转膜系统)分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术影响因素影响因素n离子强度离子强度(高高-消除静电斥力消除静电斥力-利于杂交利于

17、杂交)n温度温度（低于（低于Tm 20-25）n有机试剂（去离子甲酰胺）有机试剂（去离子甲酰胺）-降低降低Tmn样品样品/探针分子的大小和复杂程度探针分子的大小和复杂程度n洗涤条件洗涤条件（高严谨性，洗去非特异性结合探针）高严谨性，洗去非特异性结合探针）n支持物支持物n添加物添加物（吸附吸附DNADNA探针，使探针，使DNADNA接触面增大接触面增大）分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术# # 预杂交预杂交 为减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异为减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，杂交前用封闭物将这些非特异位点封闭。性结合，杂交前用封闭物将这些非特异位点封

18、闭。n 变性的非特异性变性的非特异性DNADNA：常用鲑鱼精子：常用鲑鱼精子DNADNA或小牛或小牛胸腺胸腺DNADNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品样品DNADNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合，使在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。背影清晰。n 高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用上非

19、特异位点的能力。一般常用DenhardtDenhardt溶液，溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术基本流程基本流程n样品及探针制备样品及探针制备n样品电泳分离样品电泳分离n转膜转膜n预杂交预杂交n杂交杂交n洗膜洗膜n分析（压片、显色、荧光观察等）分析（压片、显色、荧光观察等）分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术nSouthern blotnDNA提取提取n酶切酶切n电泳电泳/拍照拍照n转膜转膜/固定固定n探针制

20、备探针制备n预杂交预杂交n杂交杂交n洗膜洗膜n扫磷屏扫磷屏分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术-UV交联仪交联仪 多用途多用途254nm紫外辐射系统，紫外辐射系统，主要用于将核酸交联于膜上。还用主要用于将核酸交联于膜上。还用于琼脂凝胶中于琼脂凝胶中DNA的切割，的切割，RecA突突变筛选，胸腺二聚体产生的部分限变筛选，胸腺二聚体产生的部分限制性内切酶消化，制性内切酶消化，UV灭菌消除灭菌消除PCR污染。另紫外灭菌污染。另紫外灭菌-聚合物紫外处理。聚合物紫外处理。 分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术

21、nSouthern blot 应用应用nDNA多态性分析（多态性分析（RFLP分析分析/SNP/SSCP/RAPD）n基因突变检测基因突变检测n基因基因copy数检测数检测n重组子筛选重组子筛选nDNA指纹分析指纹分析n测序测序分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术nSouthern blot 应用应用nDNA指纹分析指纹分析血迹中的血迹中的DNA分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术nNorthern blotn基因表达分析基因表达分析nmRNA长度及半定量分析长度及半定量分析RNA 分子（分子（TR

22、Izol）甲醛变性电泳甲醛变性电泳至膜上至膜上转膜转膜杂交杂交、显影显影凝胶凝胶滤膜滤膜用用10 xSSC10 xSSC转移转移RNARNA吸附有吸附有RNA片段的片段的膜（亚甲蓝染色）膜（亚甲蓝染色）带有带有RNA片段的凝胶片段的凝胶分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术nWestern blotn蛋白提取蛋白提取/样品准备样品准备nSDS-PAGEn电转电转/丽春红丽春红S染色染色n封闭封闭n一抗孵育一抗孵育n洗涤一抗洗涤一抗n二抗孵育二抗孵育n洗膜洗膜n结果观察结果观察/显色（显色（Dig-AP/FITC）组织蛋白组织蛋白分子生物学分子生物学

23、 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术nISHn胚胎胚胎/组织制备固定组织制备固定n消化消化/再固定再固定/洗涤洗涤nRNA探针制备探针制备n封闭封闭n杂交杂交/洗涤洗涤n一抗一抗/洗涤洗涤n二抗二抗/洗涤洗涤n显色显色(Dig-、FITC、Cy5)抗衰老基因抗衰老基因Klotho原位杂交图原位杂交图 斑马鱼斑马鱼krox20基因原位杂交图基因原位杂交图3,5菱脑节菱脑节分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术nFISH分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术生物芯片生物芯片BiochipBiochip分

24、子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术生物芯片生物芯片n定义：在斑点杂交基础上，模拟制备大规模定义：在斑点杂交基础上，模拟制备大规模集成电路的基本原理，集成了探针原位合成、集成电路的基本原理，集成了探针原位合成、照明平板印刷、精密控制、激光共聚焦显微照明平板印刷、精密控制、激光共聚焦显微技术发展来的一门分子生物学技术技术发展来的一门分子生物学技术 n原理：将大量样本固定于较小的支持物上，原理：将大量样本固定于较小的支持物上，然后与标记好的待测样品杂交，再检测杂交然后与标记好的待测样品杂交，再检测杂交信号的强弱，从而判断样本中待测信号的强弱，从而判断样本中待测DNA、RNA、

25、Pr等分子数量或活性状态等分子数量或活性状态n特点：高通量、微型化、集约化、标准化等特点：高通量、微型化、集约化、标准化等分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术生物芯片生物芯片分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术生物芯片生物芯片n种类种类n微阵列芯片（基因芯片微阵列芯片（基因芯片/蛋白芯片蛋白芯片/细胞芯片等）细胞芯片等） n微流控芯片（属于主动式芯片，如样品制备芯片、微流控芯片（属于主动式芯片，如样品制备芯片、PCR芯片、毛细管电泳芯片和色谱芯片等）芯片、毛细管电泳芯片和色谱芯片等）n芯片实验室（以生物芯片为基础的集成化分析系芯片实验室（以生物芯

26、片为基础的集成化分析系统统 ;可完成如样品制备、试剂输送、生化反应、可完成如样品制备、试剂输送、生化反应、结果检测、信息处理和传递等一系列复杂工作结果检测、信息处理和传递等一系列复杂工作 ）分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术生物芯片生物芯片n基本流程：基本流程：n芯片制备芯片制备n原位合成法原位合成法-原位光照蚀刻原位光照蚀刻n微量点样法微量点样法n样品制备（样品制备（Sample-Cy3；Control-Cy5）n分子杂交分子杂交n检测分析（检测分析（Confocus、CCD）分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术生物芯片生物芯片n原位光照蚀刻

27、原理原位光照蚀刻原理n石英片氢化后封闭石英片氢化后封闭n设计设计11um见方窗口遮罩对封闭部分光解见方窗口遮罩对封闭部分光解n将将nt加入通过化学偶合连接到晶片上加入通过化学偶合连接到晶片上n更换不同的遮罩进行更换不同的遮罩进行UV光解光解n加入加入nt进行化学偶合反应进行化学偶合反应n重复上两步可合成所需长度及序列的寡核甘酸重复上两步可合成所需长度及序列的寡核甘酸分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术生物芯片生物芯片n微量点样制备微量点样制备分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术生物芯片生物芯片n激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜分子生物学分子生物学

28、 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术生物芯片生物芯片-应用应用n抗体芯片（抗体芯片（Ab Microarray 380 ）n第一张商品化的抗体芯片是由美国第一张商品化的抗体芯片是由美国BD Clontech公司推出的。这是一张用于研究公司推出的。这是一张用于研究抗体的芯片，芯片上排列了抗体的芯片，芯片上排列了378种已知蛋白种已知蛋白的单抗，这些单抗对应的蛋白都是细胞结的单抗，这些单抗对应的蛋白都是细胞结构和功能上十分重要的蛋白，涉及信号传构和功能上十分重要的蛋白，涉及信号传导、肿瘤、细胞周期调控、细胞结构、细导、肿瘤、细胞周期调控、细胞结构、细胞凋亡和神经生物学等广泛的领域。通过胞凋亡和

29、神经生物学等广泛的领域。通过这张芯片，在一次实验中就能够比较几百这张芯片，在一次实验中就能够比较几百种蛋白的表达变化种蛋白的表达变化 分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术生物芯片生物芯片-应用应用n测序测序基因芯片的测序原理图基因芯片的测序原理图分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术生物芯片生物芯片n基因表达基因表达分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术生物芯片生物芯片-应用应用n基因诊断基因诊断nDNA结构检测结构检测nRNA表达检测表达检测能诊断癌症的基因芯片能诊断癌症的基因芯片 分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术生物芯片生物芯片-应用应用n药物研究与开发药物研究与开发与药物代谢相关基因芯片与药物代谢相关基因芯片 分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术生物芯片生物芯片-应用应用n中医药研究中医药研究n中药特性中药特性n中药药理中药药理n中药药效中药药效分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术生物芯片生物芯片-应用应用n用药个体化检测用药个体化检测个体化药物治疗基因检测芯片个体化药物治疗基因检测芯片