MALDITOFTOFMS在蛋白质组研究中的应用课件.ppt

1、 MALDI TOF/TOF MS MALDI TOF/TOF MS 在蛋白质组研究中的应用在蛋白质组研究中的应用 张养军张养军军事医学科学院反射与辐射医学研究所军事医学科学院反射与辐射医学研究所 北京蛋白质组研究中心北京蛋白质组研究中心 20092009年年4 4月月.报告内容：报告内容：一、蛋白质组学简介一、蛋白质组学简介二、生物质谱用于蛋白质组鉴定的基本原理二、生物质谱用于蛋白质组鉴定的基本原理三、三、MALDI TOF/TOF MSMALDI TOF/TOF MS仪器组成和基本原理仪器组成和基本原理四、四、 MALDI TOF/TOF MSMALDI TOF/TOF MS在蛋白质组研究

2、中的应用在蛋白质组研究中的应用 1 1、在表达谱构建中的应用、在表达谱构建中的应用 2 2、在翻译后修饰研究中的应用、在翻译后修饰研究中的应用 3 3、在蛋白质相互作用研究中的应用、在蛋白质相互作用研究中的应用 4 4、在蛋白质相对和绝对定量研究中的应用、在蛋白质相对和绝对定量研究中的应用.一、蛋白质组学简介一、蛋白质组学简介蛋白质组（蛋白质组（proteome）：）：一种细胞、组织或生物体完整基因组所一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的全套蛋白质。对应的全套蛋白质。蛋白质组学（蛋白质组学（proteomics) )：研究细胞、组织或生物体中蛋白质研究细胞、组织或生物体中蛋白质组成、定位、

3、变化及其相互作用规律的科学。组成、定位、变化及其相互作用规律的科学。简要历史回顾：简要历史回顾：19941994年，澳大利亚的科学家首次提出蛋白质组概念；年，澳大利亚的科学家首次提出蛋白质组概念；19951995年，蛋白质组一词首次见诸报端；年，蛋白质组一词首次见诸报端；20012001年年4 4月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织( (Human Proteome Organization, HUPO) )，随后欧洲、亚太地区都成立了，随后欧洲、亚太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，期望共同努力，完成人类蛋白质组计区域性蛋白质组研究组织，期望共同

4、努力，完成人类蛋白质组计划划( (Human Proteome Project) )；另外，创刊了蛋白质组学专门杂；另外，创刊了蛋白质组学专门杂志，如志，如Proteomics、Molecular & cellular proteomics和和Journal of proteome research；20022002年现在，已举行了六届年现在，已举行了六届HUPOHUPO国际会议和五届中国蛋白质组国际会议和五届中国蛋白质组学术大会。学术大会。.蛋白质组研究的意义蛋白质组研究的意义1 1、一些物种如小鼠、大鼠等基因组测序工作的完成，特别是、一些物种如小鼠、大鼠等基因组测序工作的完成，特别是人类基

5、因组计划草图完成（人类基因组计划草图完成（20012001年年）后，人们面临的迫切任务）后，人们面临的迫切任务之一便是对基因组的功能注释，而在基因组和转录组水平上常之一便是对基因组的功能注释，而在基因组和转录组水平上常常无法回答许多生物学问题，如基因转录和翻译的起始位点、常无法回答许多生物学问题，如基因转录和翻译的起始位点、翻译后修饰种类和位点、定位信息以及相互作用等问题，因此，翻译后修饰种类和位点、定位信息以及相互作用等问题，因此，蛋白质组的研究是基因组研究的深入和延续；蛋白质组的研究是基因组研究的深入和延续；2 2、作为生命功能的执行体、作为生命功能的执行体蛋白质组的研究是为了从更高蛋白质

6、组的研究是为了从更高层次上深入解读生命的本质和生命活动的规律。层次上深入解读生命的本质和生命活动的规律。3 3、通过人类疾病蛋白质组的研究，为病理研究、早期诊断、通过人类疾病蛋白质组的研究，为病理研究、早期诊断、治疗以及药物开发提供依据。治疗以及药物开发提供依据。.蛋白质组学研究的内容蛋白质组学研究的内容1 1、蛋白质组表达谱、蛋白质组表达谱( (proteome expression profiling) ) 针对已有基因组或转录组数据库的生物体、组织或细胞，针对已有基因组或转录组数据库的生物体、组织或细胞，建立相应蛋白质组或亚蛋白质组数据库。建立相应蛋白质组或亚蛋白质组数据库。2 2、蛋白

7、质组修饰谱、蛋白质组修饰谱( (proteome modification profiling) ) 构建蛋白质翻译后修饰的种类、修饰位点以及修饰官能团构建蛋白质翻译后修饰的种类、修饰位点以及修饰官能团的结构等数据库。的结构等数据库。3 3、基本生物学问题、基本生物学问题 研究与生命活动过程中密切相关的问题。比如：蛋白质组研究与生命活动过程中密切相关的问题。比如：蛋白质组成和空间结构、定位和相互作用网络等；成和空间结构、定位和相互作用网络等；.4 4、临床应用问题、临床应用问题 以重要的生理过程或人类一些重大疾病为对象，进行重以重要的生理过程或人类一些重大疾病为对象，进行重要的生理和病理体系或

8、过程的研究，即进行比较蛋白质组学要的生理和病理体系或过程的研究，即进行比较蛋白质组学研究，包括疾病发生和发展机制、疾病诊断标志物以及药物研究，包括疾病发生和发展机制、疾病诊断标志物以及药物靶标等；靶标等； 5 5、蛋白质组学中的新技术和新方法、蛋白质组学中的新技术和新方法 建立蛋白质组学研究的支撑技术平台以及生物信息学研建立蛋白质组学研究的支撑技术平台以及生物信息学研究工具，包括各种定性、定量、结构分析和生物信息学软件究工具，包括各种定性、定量、结构分析和生物信息学软件和数据库。和数据库。. 蛋白质组研究中的复杂性蛋白质组研究中的复杂性一种细胞、组织或生物体有多少蛋白质一种细胞、组织或生物体有

9、多少蛋白质? ? 人类基因组含有人类基因组含有3 34 4万个基因，与小鼠的基因数相差不多，仅是果蝇或线虫的两万个基因，与小鼠的基因数相差不多，仅是果蝇或线虫的两倍左右，但他们的表型相差却如此巨大，其根本问题便是蛋倍左右，但他们的表型相差却如此巨大，其根本问题便是蛋白质组的差异所致。白质组的差异所致。30000-4000030000-40000个基因个基因3000030000个基个基因因共享共享99%99%基因基因.Post translated modificationInteractionConformation transformationPost translated splicing

10、Displacementcytoplastnuclei蛋白质多样性蛋白质多样性一个基因表达一个基因表达多少种蛋白质？多少种蛋白质？. 人体：人体： 1 1个受精卵发育成个受精卵发育成10101212细胞，细胞，10103 3细胞类型。其细胞类型。其“蛋白蛋白质组质组”随随“时时” ” 、“空空” ” 处于变化之中，而处于变化之中，而“基因组基因组”则相对处于不变之中。因此，我们可以得出：则相对处于不变之中。因此，我们可以得出：生命体的生命体的统一性源于基因组，生命体的复杂性源于蛋白质组。统一性源于基因组，生命体的复杂性源于蛋白质组。.主要研究策略主要研究策略1 1、研究基础、研究基础（1 1）

11、生物学的发展，特别是越来越多生物基因组测序的）生物学的发展，特别是越来越多生物基因组测序的完成，为我们提供了蛋白质组数据库；完成，为我们提供了蛋白质组数据库；（2 2）生物质谱和分离科学的进步为我们提供了分离和鉴）生物质谱和分离科学的进步为我们提供了分离和鉴定的技术平台和必须的手段；定的技术平台和必须的手段；（3 3）计算机技术的提高，特别是生物信息学的发展为我）计算机技术的提高，特别是生物信息学的发展为我们处理海量数据提供了有力的支持和保障。们处理海量数据提供了有力的支持和保障。.2 2、蛋白质组学研究方法分类、蛋白质组学研究方法分类（1 1）蛋白质组定性分析）蛋白质组定性分析 依据分析对象

12、是整体蛋白质混合物或酶切后的多肽混合物，依据分析对象是整体蛋白质混合物或酶切后的多肽混合物，蛋白质组的定性分析方法分为蛋白质组的定性分析方法分为自下向上法自下向上法（bottom upbottom up）和）和自上自上向下法向下法(top down)(top down)； 依据蛋白质的序列特征，蛋白质组定性分析方法可分为：依据蛋白质的序列特征，蛋白质组定性分析方法可分为：肽质量指纹谱法肽质量指纹谱法（PMF)PMF)和和肽序列标签法肽序列标签法（PST, ,也叫也叫de novo法法） .（2 2）蛋白质组定量分析方法）蛋白质组定量分析方法 直接进行比较，包括直接进行比较，包括SDS-PAGE

13、SDS-PAGE、2DE2DE、HPLCHPLC； 标记方法，包括同位素标记亲和标签（标记方法，包括同位素标记亲和标签（ICATICAT，iTRQAiTRQA）、）、 元素标记亲和标签（元素标记亲和标签（ECATECAT）、酶促）、酶促1818O O标记、标记、DYGEDYGE技术和技术和 同位素氨基酸细胞培养标记同位素氨基酸细胞培养标记(SILAC)(SILAC)。 .3 3 蛋白质组研究方法进展蛋白质组研究方法进展(1)(1)复杂蛋白质组体系复杂蛋白质组体系 目前对于组织、细胞和血浆等复杂蛋白质组的分析，均目前对于组织、细胞和血浆等复杂蛋白质组的分析，均采用多维分离技术与质谱联用的方法。其

14、技术路线如图采用多维分离技术与质谱联用的方法。其技术路线如图1 1和和图图2 2所示。所示。 .细胞、组织或体液细胞、组织或体液蛋白质提取液蛋白质提取液整体蛋白质混合物预分离包括：整体蛋白质混合物预分离包括：2DE2DE，2DLC2DLC，或，或 LC-SDS-PAGELC-SDS-PAGE等等不同馏分或蛋白质电泳带不同馏分或蛋白质电泳带多肽混合物多肽混合物溶液酶切或胶上原位酶切溶液酶切或胶上原位酶切PMFPMF，PST OR DE NOVOPST OR DE NOVO 数据数据蛋白质组蛋白质组MALDI MS or MSMS MALDI MS or MSMS or cLC-ESI- MSMS

15、or cLC-ESI- MSMS 生物信息学工具生物信息学工具图图1 1 整体蛋白质组预分离分析技术路线整体蛋白质组预分离分析技术路线超声、离心处理或亚细胞器分级超声、离心处理或亚细胞器分级.细胞、组织或体液细胞、组织或体液蛋白质提取液蛋白质提取液多肽混合物多肽混合物PST OR DE NOVOPST OR DE NOVO 数据数据蛋白质组蛋白质组MALDI MSMS MALDI MSMS or or c2DLC-ESI- MSMSc2DLC-ESI- MSMS 生物信息学工具生物信息学工具 图图2 2 多维蛋白质组分析技术（鸟枪法蛋白质组学方法）多维蛋白质组分析技术（鸟枪法蛋白质组学方法）

16、超声、离心处理或亚细胞器分级超声、离心处理或亚细胞器分级溶液酶切溶液酶切.Benjamin F. Cravatt, Gabriel M. Simon & John R. Yates III, The biological impact of mass-spectrometry-based proteomics. NATURE, Vol 450:991-1000 ( 2007)A. J. Link, J. Eng D. M. Schieltz, E. Carmack, G. Mize, D. R. Morris, B. M. Garvik, J. R. Yates, III, Direct an

17、alysis of protein complexes using mass spectrometry, Nature Biotechnology 17, 676-682 (1999)（ John R. Yates III，The Scripps Research Institute ）鸟枪法蛋白质组学方法可形象图示为鸟枪法蛋白质组学方法可形象图示为: :.(2) (2) 简单的蛋白质组体系简单的蛋白质组体系 对于特定的、简单的蛋白质组分析，既可采用多维分对于特定的、简单的蛋白质组分析，既可采用多维分离技术与质谱联用的方法，也可以采用较少步骤的分离和离技术与质谱联用的方法，也可以采用较少步骤的

18、分离和质谱联用技术。其技术路线如图质谱联用技术。其技术路线如图3 3所示。所示。.细胞或组织细胞或组织蛋白质提取液蛋白质提取液整体蛋白质混合物分离整体蛋白质混合物分离SDS-PAGESDS-PAGE，IEFIEF， HPLCHPLC不同馏分或蛋白质电泳带不同馏分或蛋白质电泳带多肽混合物多肽混合物溶液酶切溶液酶切胶上原位酶切胶上原位酶切PMFPMF，PST OR DE NOVOPST OR DE NOVO 数据数据蛋白质组蛋白质组MALDI MSMS, cLC-ESI- MSMSMALDI MSMS, cLC-ESI- MSMS 生物信息学工具生物信息学工具图图3 3 特定或目标蛋白质组分离分析

19、技术特定或目标蛋白质组分离分析技术超声、离心处理或亚细胞器分级超声、离心处理或亚细胞器分级.(3) (3) 数据标准数据标准 为确保蛋白质组数据的可靠性，以为确保蛋白质组数据的可靠性，以Molecular & Molecular & Cellular ProteomicsCellular Proteomics为代表的蛋白质组学专业杂志对蛋为代表的蛋白质组学专业杂志对蛋白质组数据产出、处理、质量控制和发表提出了严格的要白质组数据产出、处理、质量控制和发表提出了严格的要求，具体包括：实验方法、数据处理程序名称和版本、蛋求，具体包括：实验方法、数据处理程序名称和版本、蛋白质数据库和版本、数据判断的阈

20、值和统计方法、蛋白质白质数据库和版本、数据判断的阈值和统计方法、蛋白质的名称、序号和覆盖率、肽段的序列和分值等。另外，数的名称、序号和覆盖率、肽段的序列和分值等。另外，数据可靠性评价标准：如概率法、反转数据库法等评价方法据可靠性评价标准：如概率法、反转数据库法等评价方法已获得广泛应用。已获得广泛应用。.(4)(4)、蛋白质组技术方法发展趋势、蛋白质组技术方法发展趋势 蛋白质组研究中目前面临的技术挑战主要是：标准化方法蛋白质组研究中目前面临的技术挑战主要是：标准化方法的验证以及数据的精确性和重现性、简便有效的验证技术和定的验证以及数据的精确性和重现性、简便有效的验证技术和定量技术。就技术本身而言

21、仍然是分析化学的基本问题即选择性、量技术。就技术本身而言仍然是分析化学的基本问题即选择性、准确性、灵敏性、重现性、可行性和动态范围。具体包括：准确性、灵敏性、重现性、可行性和动态范围。具体包括：1 1、标准化、高灵敏度和高重现性的微量蛋白质组学分析方法、标准化、高灵敏度和高重现性的微量蛋白质组学分析方法的建立及验证和评价体系；的建立及验证和评价体系；2 2、“鸟枪鸟枪”蛋白质组学方法向蛋白质组学方法向“导弹导弹”蛋白质组学发展，即蛋白质组学发展，即基于中心法则和转录组数据，直接鉴定相关蛋白质组，而不是基于中心法则和转录组数据，直接鉴定相关蛋白质组，而不是随机鉴定蛋白质组；随机鉴定蛋白质组；.

22、“鸟枪鸟枪”蛋白质组学方法基于肽段水平上蛋白质组学方法基于肽段水平上“随机随机”捕捕获肽段，籍此对其相应的蛋白质进行鉴定，其结果具有不获肽段，籍此对其相应的蛋白质进行鉴定，其结果具有不确定性、不具有目标性以及低的重现性；而确定性、不具有目标性以及低的重现性；而“导弹导弹”蛋白蛋白质组学发展，即基于中心法则和转录组数据以及文献数据，质组学发展，即基于中心法则和转录组数据以及文献数据，直接鉴定相关蛋白质组，其结果是具有明确的目标性、高直接鉴定相关蛋白质组，其结果是具有明确的目标性、高的重现性和鉴定效率。的重现性和鉴定效率。 “鸟枪鸟枪”蛋白质组学方法就像在大海中捞鱼，如图蛋白质组学方法就像在大海中

23、捞鱼，如图A A，而而“导弹导弹”蛋白质组学方法就像导弹打卫星，如图蛋白质组学方法就像导弹打卫星，如图B B所示。所示。.图图B “B “导弹导弹”蛋白质组学方法示意图蛋白质组学方法示意图图图A “A “鸟枪鸟枪”蛋白质组学方法示意图蛋白质组学方法示意图.肝组织肝组织蛋白质蛋白质混合物混合物酶切酶切 多肽多肽混合物混合物SCXRPLC二维色谱分离二维色谱分离MS/MSCollision CellMS1P1P2P3PnMS1P2P9P5PmSHOTGUNMISSILESHOTGUN:不确定性、不具有目标性以及低重现性不确定性、不具有目标性以及低重现性MISSILE:明确的目标性、高重现性和高鉴定

24、效率明确的目标性、高重现性和高鉴定效率.3 3、规模化高灵敏度、高重现性和宽动态范围的蛋白质组定量、规模化高灵敏度、高重现性和宽动态范围的蛋白质组定量方法的建立与科学合理的新算法；方法的建立与科学合理的新算法；4 4、蛋白质组功能模块定量、动态、实时检测、成像和标识技、蛋白质组功能模块定量、动态、实时检测、成像和标识技术的建立和应用；术的建立和应用；5 5、集成物理、化学和信息技术中的标记技术、示踪技术、传、集成物理、化学和信息技术中的标记技术、示踪技术、传感技术和成像技术，建立动态目标蛋白质组的表达、修饰、定感技术和成像技术，建立动态目标蛋白质组的表达、修饰、定位和相互作用可视技术；位和相互

25、作用可视技术；6 6、建立生物标志物发现、建立生物标志物发现、MRMMRM验证定量和临床标志物检测的标验证定量和临床标志物检测的标准化方法。准化方法。.二、生物质谱用于蛋白质组鉴定的基本原理二、生物质谱用于蛋白质组鉴定的基本原理 自从自从19121912年，年，ThomsonThomson首次使用首次使用抛物线质谱仪抛物线质谱仪测定了测定了NeNe的两种同位素的两种同位素2222NeNe和和2424NeNe以来，经过近以来，经过近100100年的发展，质谱年的发展，质谱在其各个方面都得到巨大的发展（如下图所示），各种组在其各个方面都得到巨大的发展（如下图所示），各种组合的质谱仪不断出现，应用更

26、加深入广泛！合的质谱仪不断出现，应用更加深入广泛！真空系统真空系统进样系统进样系统质量质量分析器分析器检测器检测器 供电系统供电系统 数据处理数据处理与控制系统与控制系统.离子源离子源 离子源的作用：离子源的作用：将样品中的原子、分子电离成为离子，并使将样品中的原子、分子电离成为离子，并使这些离子在离子源系统中形成具有一定几何形状和一定能量这些离子在离子源系统中形成具有一定几何形状和一定能量的离子束，然后进入质量分析器被分离。的离子束，然后进入质量分析器被分离。有机质谱常用的离子源有：电子轰击离子源（有机质谱常用的离子源有：电子轰击离子源（EIEI）；对热不）；对热不稳定或高分子量化合物有化学

27、电离源（稳定或高分子量化合物有化学电离源（CICI）；解吸化学电离）；解吸化学电离源（源（DCIDCI）；场电离源（）；场电离源（FIFI）；场解吸电离源；快原子轰击）；场解吸电离源；快原子轰击电离源（电离源（FABFAB）；离子轰击电离源（）；离子轰击电离源（IBIB）；）；激光解吸电离源激光解吸电离源（LILI）；热喷雾和电喷雾电离源（）；热喷雾和电喷雾电离源（ESIESI）等。等。生物质谱常用后两种离子源。生物质谱常用后两种离子源。.质量分析器质量分析器 质量分析器的作用：使离子按照质荷比的大小分离开来，质量分析器的作用：使离子按照质荷比的大小分离开来，以便得到按质荷比大小顺序排列成的质

28、谱图。以便得到按质荷比大小顺序排列成的质谱图。有机质谱和生物质谱常用的质量分析器有：有机质谱和生物质谱常用的质量分析器有：a a 磁场磁场( (或电或电场场) )质量分析器；质量分析器；b b 四极杆质量分析器；四极杆质量分析器；c c 飞行时间质量飞行时间质量分析器；分析器；d d 离子阱质量分析器；离子阱质量分析器；e e 离子回旋共振质量分析离子回旋共振质量分析器；器；f ORBITRAP f ORBITRAP （轨道离子阱）。（轨道离子阱）。.质量分析器、缩写符号和原理质量分析器、缩写符号和原理.生物质谱用于蛋白质鉴定的基本假设：生物质谱用于蛋白质鉴定的基本假设：（1 1）蛋白质的组成

29、是唯一的，即）蛋白质的组成是唯一的，即蛋白质具有一个、数个蛋白质具有一个、数个 肽段或一组肽段作为其标签；肽段或一组肽段作为其标签；（2 2）存在选择性地对蛋白质进行酶切的一种或多种蛋白）存在选择性地对蛋白质进行酶切的一种或多种蛋白 酶；酶；（3 3）通过生物质谱获得的肽段的质荷比信息可以推测出）通过生物质谱获得的肽段的质荷比信息可以推测出 肽段、蛋白质的序列或直接通过与蛋白质序列数据肽段、蛋白质的序列或直接通过与蛋白质序列数据 库中蛋白质参数及相关肽段信息的比对和相关分析库中蛋白质参数及相关肽段信息的比对和相关分析 鉴定蛋白质。鉴定蛋白质。.1 1、肽质量指纹谱（、肽质量指纹谱（Peptid

30、e Mass Fingerprinting，PMF） 指蛋白质被指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽段水解后得到的肽段混合物经过质谱分析所得到的质谱图。混合物经过质谱分析所得到的质谱图。 由于组成每种蛋白质的氨基酸序列由于组成每种蛋白质的氨基酸序列( (一级结构一级结构) )不同，不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列也各不相同，其肽蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物质量数亦具特征性，所以称为肽质量指纹谱，籍此混合物质量数亦具特征性，所以称为肽质量指纹谱，籍此可以实现对蛋白质的鉴定。可以实现对蛋白质的鉴定。蛋白质被蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶

31、酶切位点专一的蛋白酶水解后的肽质谱图水解后的肽质谱图.蛋白酶蛋白酶切切 点点pHpH条件条件TrypsinLys (K)、Arg(R)羧基端羧基端pH 7.5-9.0Glu-CAsp(D )、Glu (E)羧基端羧基端pH 4.0Glu (E)羧基端羧基端pH 7.8Asp-NAsp(D )氨基端氨基端pH 7.0-8.0Arg-CArg(R)羧基端羧基端pH7.2-8.0Lys-CLys (K)羧基端羧基端pH 8.5-8.8.2 2、肽序列标签、肽序列标签(peptide sequence tag, PST)(peptide sequence tag, PST) 选择蛋白质的一种或数种肽序

32、列标签肽段，在质谱裂解选择蛋白质的一种或数种肽序列标签肽段，在质谱裂解池中碎裂而获得相应碎片肽段的质谱图，籍此推断或比对出池中碎裂而获得相应碎片肽段的质谱图，籍此推断或比对出该肽段的序列，进而鉴定出产生该肽段的蛋白质（该方法也该肽段的序列，进而鉴定出产生该肽段的蛋白质（该方法也叫叫de novo sequencing ）。）。多肽串联质谱碎裂方式示意图多肽串联质谱碎裂方式示意图 .多肽串联质谱碎片离子结构示意图多肽串联质谱碎片离子结构示意图.鸡卵白蛋白鸡卵白蛋白磷酸肽（磷酸肽（EVVGSAEAGVDAASVSEEFREVVGSAEAGVDAASVSEEFR）m/z m/z 2088.92088

33、.9的的ESI-Q-TOFESI-Q-TOF串联质谱图串联质谱图.鸡卵白蛋白磷酸肽m/z 2088.9 串联质谱理论值及检索匹配值 “* ” m/z matched with Mascot search result, “_”m/z matched with calculated values.3、肽阶梯测序法（肽阶梯测序法（Peptide Ladder Sequencing）（1 1）多肽经化学或酶法处理，从肽链末端氨基酸起逐一降解）多肽经化学或酶法处理，从肽链末端氨基酸起逐一降解产生一系列长度递减的肽；产生一系列长度递减的肽；（2 2）每一步反应只水解最末端的氨基酸，产生的一系列肽相）每一

34、步反应只水解最末端的氨基酸，产生的一系列肽相邻质量之间相差一个氨基酸残基的质量；邻质量之间相差一个氨基酸残基的质量；（3 3）用质谱检测反应不同时间点的降解产物，得到肽的阶梯）用质谱检测反应不同时间点的降解产物，得到肽的阶梯图，根据相邻肽之间质量数之差值推出肽段的部分序列；图，根据相邻肽之间质量数之差值推出肽段的部分序列；（4 4）羧肽酶和氨肽酶，分别从肽链的）羧肽酶和氨肽酶，分别从肽链的C C末端和末端和N N末端水解氨基末端水解氨基酸或对肽段的一段进行标记使质谱仅产生一种酸或对肽段的一段进行标记使质谱仅产生一种y y或或b b离子序列；离子序列；（5 5）既可以采用手工也可以借用计算机软件

35、推断肽序列；）既可以采用手工也可以借用计算机软件推断肽序列；.（6 6）对蛋白质全序列，一般需要多种酶产生多种不同的肽）对蛋白质全序列，一般需要多种酶产生多种不同的肽段混合物，分别测定每种混合物中肽的序列；段混合物，分别测定每种混合物中肽的序列；（7 7）人工拼接或借助于计算机软件进行拼接，完成蛋白质）人工拼接或借助于计算机软件进行拼接，完成蛋白质全序列全序列测定。全序列全序列测定。如右图所示：通过相邻质谱峰如右图所示：通过相邻质谱峰的差值可推断出氨基酸残基，的差值可推断出氨基酸残基，但对同分异构的氨基酸需进一但对同分异构的氨基酸需进一步的结构分析，如亮氨酸和异步的结构分析，如亮氨酸和异亮氨酸

36、亮氨酸.三、三、MALDI TOF/TOF MSMALDI TOF/TOF MS仪器组成和基本原理仪器组成和基本原理.4700 / 4800 Proteomics 4700 / 4800 Proteomics Analyzer Analyzer ( (美国美国ABIABI公司）公司）1 1、 MALDI TOF/TOF MSMALDI TOF/TOF MS仪器组成仪器组成.LaserSample Loading ChamberCameraLamp4800 MALDI TOF/TOF Analyzer SchematicSample Plate and StageMirrorsLinear De

37、tectorReflector Detector2-Stage MirrorMirror DeflectorsDecel DeflectorsX2,Y2 DeflectorsX1,Y1 DeflectorsTISCollision CellMetastable SuppressorSource 2Decel StackSource 1Source 1 LensLens 1CID Lens (Lens 2)Lens 3Attenuator.V2V1 Laser Source 1Source 2x1,y1 DeflectorsReflector Detector2 Stage ReflectorC

38、ID CellMetastable Ion SuppressorLens 1 AttenuatorTISTOF 2 x2,y2 DeflectorsSample PlateTOF 1 Linear Detector (optional)Deceleration Stackx3,y3 DeflectorsLens 2 Ion Sink4700 MALDI TOF/TOF Analyzer Schematic.2 2、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱原理、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱原理Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Fl

39、ight Mass Spectrometry, High vacuumMALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS仪器结构示意图仪器结构示意图.飞行时间飞行时间 ( (Time Of Flight, TOF) )质量分析器质量分析器基本原理：基本原理：离子源产生的离子在加速电场获得动能，进入高离子源产生的离子在加速电场获得动能，进入高真空无电场飞行管道并在此无场飞行管道内飞行；质量较轻真空无电场飞行管道并在此无场飞行管道内飞行；质量较轻的离子飞行速度快，较早到达检测器；质量较重的离子飞行的离子飞行速度快，较早到达检测器；质量较重的离子飞行速度慢，较晚到达检测器。依据离子的飞行时间与其质荷比

40、速度慢，较晚到达检测器。依据离子的飞行时间与其质荷比平方根平方根 (m/z) (m/z) 成正比的关系，通过测定飞行时间，计算出成正比的关系，通过测定飞行时间，计算出相应离子的原子量或分子量。相应离子的原子量或分子量。 .MALDI TOF MS 的特点：的特点：1 1、高灵敏度（高的离子传输效率）、高灵敏度（高的离子传输效率）2 2、宽质量范围、宽质量范围(400 Da-400 kDa, (400 Da-400 kDa, 理论上没有上限理论上没有上限) )3 3、分析速度快、分析速度快4 4、容易校正、容易校正5 5、PSD PSD 或或MS/MS (HIGH/LOW ENERGY COLL

41、ISION)MS/MS (HIGH/LOW ENERGY COLLISION).影响影响TOFTOF分辨率的因素：分辨率的因素：分辨率公式：分辨率公式：其中：其中： m m和和t t分别为离子的质量和飞行时间；分别为离子的质量和飞行时间；m m和和t t分别是质量和时间坐分别是质量和时间坐标时半峰宽质量和时间；标时半峰宽质量和时间； x x为到达检测器的离子簇的厚度。为到达检测器的离子簇的厚度。. 从以上公式可以看出：提高从以上公式可以看出：提高TOFTOF质量分析器的措施包括质量分析器的措施包括延长飞行管和增加飞行时间。延长飞行时间会造成因与其他延长飞行管和增加飞行时间。延长飞行时间会造成因

42、与其他气体离子碰撞引起散射或离子束角扩散，降低气体离子碰撞引起散射或离子束角扩散，降低TOFTOF质量分析质量分析器性能；增加飞行时间意味着降低加速电压，如此会降低灵器性能；增加飞行时间意味着降低加速电压，如此会降低灵敏度。所以，一般选择飞行管敏度。所以，一般选择飞行管1 12 m2 m，加速电压，加速电压20 kV20 kV。 另外，影响另外，影响TOFTOF分辨率的还有形成离子时的时间分散；分辨率的还有形成离子时的时间分散；离子占有空间体积的空间分散和动能不均的动能分散。离子占有空间体积的空间分散和动能不均的动能分散。 为了有效解决这些问题，出现了两种关键技术：延迟脉为了有效解决这些问题，

43、出现了两种关键技术：延迟脉冲提取技术和反射技术。冲提取技术和反射技术。.延迟提取技术：延迟提取技术： 为了减少离开离子源、具离有相同为了减少离开离子源、具离有相同m/zm/z离子的动能分散，离子的动能分散，我们在离子形成和提取之间引入一段时间延迟。如下图所我们在离子形成和提取之间引入一段时间延迟。如下图所示，初始形成的离子首先进入源中的无场区，数百纳秒到示，初始形成的离子首先进入源中的无场区，数百纳秒到微秒后施加脉冲电压，这种操作方式叫做延迟脉冲提取技微秒后施加脉冲电压，这种操作方式叫做延迟脉冲提取技术。术。 这种能量聚焦的关键就是在离子形成和提取之间能够这种能量聚焦的关键就是在离子形成和提取

44、之间能够适当调节脉冲电压的大小和延迟时间的多少。适当调节脉冲电压的大小和延迟时间的多少。 一般对于较低的一般对于较低的m/zm/z离子，可选择较低的电压或较短的离子，可选择较低的电压或较短的延迟时间。需要注意的是延迟提取技术仅能改善一定质量延迟时间。需要注意的是延迟提取技术仅能改善一定质量范围离子的分辨率，且对高质量的离子不是非常有效。范围离子的分辨率，且对高质量的离子不是非常有效。.连续提取和延迟脉冲提取技术示意图连续提取和延迟脉冲提取技术示意图连续提取连续提取延迟提取延迟提取延迟提取技延迟提取技术使质谱峰术使质谱峰明显变窄，明显变窄，因此分辨率因此分辨率显著提高显著提高.反射技术反射技术

45、安装反射镜安装反射镜TOFTOF质谱仪示意图质谱仪示意图图中：实心点表示相同图中：实心点表示相同m/zm/z带有较大的动能带有较大的动能 空心点表示相同空心点表示相同m/zm/z带有较小的动能带有较小的动能.（1）（2）（3）（4）在反射场中飞行总时间在反射场中飞行总时间在飞行管中飞行的总时间：在飞行管中飞行的总时间：总飞行时间总飞行时间与线性与线性TOFTOF原理的数学表达式相同原理的数学表达式相同.采用反射镜技术后如何达到能量聚焦采用反射镜技术后如何达到能量聚焦 假设具有相同质荷比但带有不同动能的两种离子，其中假设具有相同质荷比但带有不同动能的两种离子，其中一个动能为一个动能为Ek，另一个

46、的动能为，另一个的动能为Ek，且两个离子的动能比，且两个离子的动能比为为a2，即：，即：（1）我们推导出两个离子的总飞行时间分别为：我们推导出两个离子的总飞行时间分别为：（2）. 由公式（由公式（2 2）看出：如果）看出：如果a a1 1，那么带有较多动能的离，那么带有较多动能的离子在无场飞行管中的飞行时间较短，而在反射镜中的飞行时子在无场飞行管中的飞行时间较短，而在反射镜中的飞行时间较长；对于间较长；对于a a 1 1的情况，结果正好相反。这种飞行时间的情况，结果正好相反。这种飞行时间在两个飞行部分相互补偿，最终使具有相同质荷比但不同动在两个飞行部分相互补偿，最终使具有相同质荷比但不同动能的

47、离子具有相同的总的飞行时间而同时到达监测器。能的离子具有相同的总的飞行时间而同时到达监测器。 需要注意的是增加反射镜虽然没有增加质谱仪的尺寸，需要注意的是增加反射镜虽然没有增加质谱仪的尺寸，但其提高分辨率是以牺牲质谱的灵敏度和降低检测质量范围但其提高分辨率是以牺牲质谱的灵敏度和降低检测质量范围为代价的。为代价的。.Ion Source #2Ion Source #2Ion Source #1Ion Source #1Precursor Ion Selector (TIS)Collision CellMassMassAnalyzer #2Analyzer #2DetectorDetectorMa

48、ssAnalyzer #1Generates and Accelerates IonsTOF 1 Separates IonsInduces CID Fragmentation of PrecursorRe-Accelerates FragmentsTOF 2 with Mirror Separates FragmentsSelects Ions.如何实现如何实现MS/MSMS/MS分析？分析？ 凭借时间离子选择装置（凭借时间离子选择装置（Timed-Ion-Selector，TIS) )选择选择母离子，在母离子，在CID中与一定压力的惰性气体分子发生碰撞得到碎中与一定压力的惰性气体分子发生碰

49、撞得到碎片离子，然后进行片离子，然后进行TOFTOF分离和检测。分离和检测。 TIS具有两种功能：一是可以抑制来自基质和样品中不感具有两种功能：一是可以抑制来自基质和样品中不感兴趣的低质量的离子；二是为兴趣的低质量的离子；二是为MS/MSMS/MS分析选择母离子。分析选择母离子。 操作步骤：依据选择离子达到的时间适时的施加电压操作步骤：依据选择离子达到的时间适时的施加电压（关门）偏转离子的飞行轨道或接地（开门）使离子通过。（关门）偏转离子的飞行轨道或接地（开门）使离子通过。.VoltageDetectorDetector OutputTimeIntensity+Mass 50Mass 100M

50、ass 500Mass 50AccelDrift+Time = 0-+.VoltageDetectorMass 50Mass 100Mass 500Detector OutputMass 50TimeIntensityAccelDriftTime = A-+Mass 50Mass 100Mass 500Mass 50.Time = BVoltageDetectorDetector OutputTimeIntensityAccelDrift+Mass 50Mass 100Mass 500Mass 50.VoltageDetectorDetector OutputTimeIntensityAcce