协同凝集反应+金葡菌课件.ppt

1、医学免疫学实验医学免疫学实验 一、凝集试验、吞噬试验 二、沉淀试验、溶血反应 三、免疫标记技术； 免疫细胞的分离； 细胞免疫功能测定实验一实验一 （一）（一）凝集试验凝集试验 1、直接凝集反应（、直接凝集反应（ABO血型鉴定）血型鉴定） 2、间接凝集反应（类风湿因子测定）、间接凝集反应（类风湿因子测定） 3、金黄色葡萄球菌协同凝集试验、金黄色葡萄球菌协同凝集试验 （二）（二）吞噬试验吞噬试验（示教）（示教）（310室）室） 1、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬）、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬） 2、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬）、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬） （一）凝集试验 1、直接凝集反应（ABO

2、血型鉴定） 2、间接凝集反应（类风湿因子测定） 3、金黄色葡萄球菌协同凝集试验（什么是凝集试验或直接、间接、协同凝集试验？）免疫学检测技术免疫学检测技术 利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子（抗体、补体、细胞因子和粘附分子等）（抗体、补体、细胞因子和粘附分子等）及免疫细胞等免疫学研究对象的实验过程。及免疫细胞等免疫学研究对象的实验过程。 一、一、 抗原抗体的检测抗原抗体的检测凝集试验 二、二、 免疫细胞数量、功能的检测免疫细胞数量、功能的检测 吞噬试验 三、其他，如细胞因子的检测三、其他，如细胞因子的检测回顾几个概念：1 1、 抗原，抗原，AgAg能诱导免疫系统

3、产生特异性免能诱导免疫系统产生特异性免疫应答疫应答（抗体和效应（抗体和效应T T细胞）细胞）的异物。的异物。2 2、 抗体，抗体， AbAb特异性蛋白质，由抗原诱导，特异性蛋白质，由抗原诱导，通过特异性免疫应答产生（通过特异性免疫应答产生（B B细胞分化为浆细胞分化为浆细胞分泌）。与抗原一一对应细胞分泌）。与抗原一一对应3 3、抗原抗体反应的特异性抗原抗体反应的特异性4 4、免疫系统的、免疫系统的免疫应答或特异性免疫应答免疫应答或特异性免疫应答 免疫系统（通过产生抗体或效应免疫系统（通过产生抗体或效应T T细胞）清除异物细胞）清除异物的过程的过程 AD: antigenic determina

4、nt of Ag, epitope CDR( of Ab ):complementarity determining region，a shape complementary to corresponding AD Ag-ADCDRs-Ab7（抗体）如何检测抗原或抗体？（基本原则）抗原抗原 抗体抗体 抗原抗体反应现象抗原抗体反应现象 （抗原抗体结合反应的高度特异性） ？ 抗体抗体 抗原抗原 + ? ?有现象 （有相应抗原）（有相应抗原）无现象 （无相应（无相应 抗原）抗原）有反应现象 （有相应（有相应 抗体抗体)无反应现象 （无相应抗体（无相应抗体）抗原抗体反应的可见性：抗原抗体反应的可见性：

5、AgAb AgAb AgAb AgAbAbAbAbAgAg、Ab比比例合适：例合适：AgAb：AgAb：AgAbAb Ab，游离，游离AbAbAgAg，游离，游离Ag(visible)（凝集或沉淀）(unvisible)抗原抗体反应的可见性与抗原抗体比例：抗原抗体反应的可见性与抗原抗体比例：（形成可见的大抗原抗体复合物合适条件：）（形成可见的大抗原抗体复合物合适条件：）AgAb AgAb AgAb AgAbAbAbAbAgAg、Ab比比例合适：例合适：AgAb：AgAb：AgAbAb Ab，游离，游离AbAbAgAg，游离，游离Ag(visible)（凝集或沉淀）(unvisible)12Eq

6、uivalence Lattice formationAb excessAg excess(Visible)13Free antigen Free antibody - - + - -Antigen addedAntibody excess zoneEquivalence zoneA n t i g e n excess zoneImmune complex在抗原抗体比例合适时形成大的可见抗原抗体复合物抗原抗体的结合是可逆的 抗原抗体反应特点：抗原抗体反应特点： 1）特异性）特异性 2）可见性）可见性 阶段性与可见性阶段性与可见性 比例性与可见性比例性与可见性 3）可逆性）可逆性 【凝集反应凝

7、集反应】： （1）概念：）概念：颗粒性颗粒性AgAb （凝集块）凝集块）可溶性可溶性AgAb （沉淀物）沉淀物）AgAb AgAbAbAgAbAb（凝集反应）（凝集反应）（细菌、细胞）（细菌、细胞）AgAb AgAbAbAg（蛋白质、多糖）（蛋白质、多糖）Ab（沉淀反应）（沉淀反应）颗粒性颗粒性AgAb 凝集块（直接凝集反应）凝集块（直接凝集反应）可溶性可溶性Ag载体载体 Ab 凝集块凝集块（间接凝集反应）（间接凝集反应） （细胞、细菌等）细胞、细菌等） （正向间接凝集反应正向间接凝集反应） 可溶性可溶性Ag 载体载体Ab 凝集块（凝集块（反向间接凝集反应反向间接凝集反应） Ag 金葡菌金葡菌

8、Ab 凝集块（协同凝集反应）凝集块（协同凝集反应）一定条件一定条件（2）类型）类型（致敏载体（致敏载体?）（3）凝集试验检测原理颗粒性颗粒性AgAb 凝集块（直接凝集反应）凝集块（直接凝集反应） ？ 已知已知Ab Ag 金葡菌金葡菌Ab 凝集块（协同凝集反应）凝集块（协同凝集反应） ？金葡菌已知金葡菌已知Ab 凝集（有对应凝集（有对应Ag）无凝集（无对应无凝集（无对应Ag）一定条件一定条件一定条件一定条件凝集（有对应凝集（有对应Ag）无凝集（无对应无凝集（无对应Ag）一定条件一定条件（一）（一）1、ABO血型鉴定血型鉴定直接凝集反应：直接凝集反应：颗粒性抗原颗粒性抗原 + 抗体抗体 凝集块凝集

9、块 RBC 抗抗A或抗或抗B 凝集块凝集块 血型血型 RBC抗原抗原 抗抗A 抗抗B A A抗原抗原 B B抗原抗原 AB 有有A、B O 无无A、B 实验步骤：实验步骤： 1、制备红细胞悬液。、制备红细胞悬液。 2、加抗、加抗A或抗或抗B。 3、加红细胞悬液。、加红细胞悬液。 4、结果观察。、结果观察。 （2人/组）【方法方法】1. 用酒精棉球消毒被检者的耳垂或手指尖端，以采血针刺破皮肤，稍加挤压，使血液流出，滴12滴血液于含有生理盐水的试管内，摇匀，使成为血球悬液。用灭菌干棉球止血。2. 取白瓷板1块，将抗A、抗B分型试剂分别滴加1滴于白瓷板的两个圆孔内。3. 用毛细吸管吸取血球悬液，在白

10、瓷板的两个圆孔内各加1滴。4.将白瓷板前后左右不停地摇动，使其充分混匀，510min后观察血球有无凝集发生。如有凝集，可见红细胞凝集成块；无凝集，红细胞呈均匀分散。5. 记录受检者红细胞凝集情况，根据ABO血型鉴定表，判断受检者的血型。 Bilateralis of the ring finger tip（一）（一）2、血清类风湿因子测定、血清类风湿因子测定 正向间接凝集反应、血球凝集试验：正向间接凝集反应、血球凝集试验：可溶性可溶性Ag载体载体 Ab 凝集凝集 人人IgG-红细胞红细胞 类风湿因子类风湿因子 （致敏红细胞）（致敏红细胞） （待测）（待测） （半定量）（半定量） （效价）（效价

11、） 效价（滴度）：效价（滴度）：以出现明显抗原抗体反应以出现明显抗原抗体反应现象（及以上）的最高稀释度作为待检现象（及以上）的最高稀释度作为待检抗原（或抗体）的效价，可反应待检物含量。抗原（或抗体）的效价，可反应待检物含量。 1.稀释液稀释液 50ul 50 50 50 50 50 50 50 50ul +ve2.待检血清待检血清（1：10） （Ab?）50ul Ab稀释度稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560弃去509 10 50ul 50 50 50 50 50 5050ul1.稀释液稀释液 50ul 50 50 50 50 5

12、0 50 50 50ul +ve2.待检血清待检血清（1：10） （Ab?）50 3. 加加Ag 50ul 50 50 50 50 50 50 50 50ul 50 Ab最终稀释度最终稀释度 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:51204. 现象现象 （效价）（效价）1:320 + + + + - - - - 1:160 1:40 + - - - - - - - 1:40 5. 效价效价1：40，判断待检标本为抗体（类风湿因子）阳性；否则阴性，判断待检标本为抗体（类风湿因子）阳性；否则阴性 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320

13、 1:640 1:1280 1:2560弃去5050ul + + + + + + + +Result 1: + + + + + + + Agglutination deposition -vecontrol +vecontrol 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 + + + + - standards to judge agglutination:+ all the red blood cells agglutinate+ most red blood cells agglutinate+ half red blood cells agglutinate no agglutinatio

14、n all, agg. most, agg. half, agg. few, agg. no agglutination + + + + - （ + ） （ + ） all, agg. most, agg. half, agg. few, agg. no agglutination + + + + + + - - - + 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120titer is 1:640; So, titer 1:40, Test sample (sample serum) is positive.Rheumatoid factor i

15、s positive.Rheumatoid factor is at relatively high concentration. Agglutination deposition (result 1) + + + + + + + + - + +1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120maybe, titer is 1:5120, or 1:5120,So, titer 1:40,Test sample (sample sera) is positive.Rheumatoid factor is positive, in high lev

16、el. Agglutination deposition (result 2) + + + + + - - - - + 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120titer is ?, (titer 1:40, or titer 1:40?)Test sample (sample serum, rheumatoid factor) is positive or negative? Agglutination deposition (result 3) Titer ： The maximum dilution that gives obvio

17、usly visible agglutination (+) is called the titer. Titer ： The highest dilution of the serum capable of agglutinating half of the red blood cells (+) is the agglutination titer. The results are also reported as the reciprocal of the maximal dilution that gives visible agglutination.33 So, Titer, 1:

18、320 ( or 320), Titer, 1:160 ( or 160), Titer, 1:20 ( or 20),34 If Titer 1:40 (or 40 ), positive (Ab positive) If Titer 1:40 (or 40 ), negative (Ab negative) Titer, 1:320 ( or 320), 1:40(40), rheumatoid factor positive Titer, 1:160 ( or 160), 1:40(40), rheumatoid factor positive Titer, 1:20 ( or 20),

19、 1:40 (40), rheumatoid factor negative351.稀释液稀释液 50l 50 50 50 50 50 50 50 50ul +ve2.待检血清待检血清（1：10） （Ab?）50 3. 加加Ag 50l 50 50 50 50 50 50 50 50ul 50 Ab最终稀释度最终稀释度 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:51204. 现象现象 （效价）（效价）1:320 + + + + - - - - 1:160 1:40 + - - - - - - - 1:40 5. 效价效价1：40，判断待检标本为抗体

20、（类风湿因子）阳性；否则阴性，判断待检标本为抗体（类风湿因子）阳性；否则阴性 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560弃去5050ul +【方法方法】1. 用微量移液器吸取稀释液加于微量反应板的19孔内，每孔50l，第10孔加50l阳性对照血清。2. 第1孔内加待检血清50l，混匀后吸出50l加于第2孔内，依次作倍比稀释至第8孔，并从第8孔中吸出50l弃去。各孔的血清稀释度为1:20、1:40、1:80。第9孔为阴性对照，第10孔为阳性对照。3. 将致敏红细胞悬液混匀，从第9孔起依次向前各孔内加入50l致敏红细胞悬液。4. 第10孔阳性对照加

21、50l致敏红细胞悬液。将反应板置于微量振荡器上，振荡1min，37静置30min后观察结果。 先做类风湿因子测定先做类风湿因子测定 （2人/组） 微量移液器的使用微量移液器的使用How to Use a Micropipettor Set the desired volume by turning the centrally located rings. (Never exceed the upper or lower limits of pipettors. 10, 20, 40100, 200ul) Place a tip on the discharge end of the pipet

22、tor. Depress the plunger until you feel the initial resistance and insert tip into the solution, just barely below the surface of the liquid and not as deep as possible.(for accurate/precise volume) 0500 5 0 050ul Carefully and slowly release plunger. (Allow the pipet tip to fill to final volume bef

23、ore removing it from solution to avoid the presence of bubbles in the plastic tip.) Discharge the solution into the appropriate container by depressing plunger. Remember to change tips between solutions to avoid mixing or contaminating the solutions used.（一）（一）3、协同凝集试验、协同凝集试验 金葡菌金葡菌 SPA 已知抗体已知抗体（IgG

24、） （ 致敏金葡菌致敏金葡菌 ） Ag 金葡菌金葡菌Ab 凝集块凝集块(协同凝集反应协同凝集反应) 请按照实验指导讲义方法进行操作；请按照实验指导讲义方法进行操作； 注意观察第注意观察第1格内的凝集现象，并分析第格内的凝集现象，并分析第2、3格为何不出现凝集。格为何不出现凝集。 1. Ab- s.aureus Ab- s.aureus s.aureus 2. CSF(Ag) normal saline CSF(Ag) 3. joggle, 4. (result) agglutinate CSF: cerebrospinal fluid from the patient with meningi

25、tis, There are meningococcuses(Ag) in CSF from the patient with bacterial meningitis. (two persons each group)【方法】【方法】1. 在玻片的第1、2格分别加1滴致敏金葡菌液，第3格加未致敏金葡菌液。2. 于第1、3格各加1滴病人脑脊液，第2格加1滴生理盐水，将玻片轻轻摇动35min，观察结果。【结果】【结果】第1格内细菌形成白色凝集，表明病人脑脊液中A群脑膜炎球菌阳性；第2格为致敏金葡菌液对照，细菌不凝集；第3格为未致敏金葡菌液对照，细菌也不出现凝集。 （二）非特异性免疫实验 吞噬试验

26、（示教） 1、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬）、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬） 了解小吞噬试验检测意义、原理，观察中性粒细胞及其吞噬的葡萄球菌； （310室） 2、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬）、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬） 了解大吞噬试验检测意义、原理，观察巨噬细胞及其吞噬的鸡红细胞。 （310室） 吞噬百分率= 100% 吞噬指数= 100%吞噬细菌的中性粒细胞数观察记录的中性粒总数(100)被吞噬的细菌总数观察记录的吞噬细胞总数(100)Phagocytic cellsmonocyteneutrophilPhagocytic cells中性粒细胞内的脑膜炎奈瑟菌中性粒细胞内的脑膜炎奈瑟菌_革

27、兰染色革兰染色脑膜炎奈瑟菌脑膜炎奈瑟菌噬血细胞综合征骨髓涂片中出现体积较大的噬血组织细胞，吞噬物为形态完整的白细胞，有核红细胞，成熟红细胞及血小板，亦可为不完整的细胞及细胞碎片等噬血细胞综合征和噬血细胞噬血细胞：巨噬细胞大小为2040微米，或更大，胞浆丰富，吞噬多个成熟红细胞，或幼红细胞或血小板等豚鼠红细胞鸡红细胞吞噬鸡红细胞的巨噬细胞Innate immune responseMacrophage Attacking E.coli 实验报告（今天交）：1. 三个凝集实验的现象和结论2. 示教实验图 返回附：反复感染的儿童应该做哪些免疫试验附：反复感染的儿童应该做哪些免疫试验 一、检查血清免疫

28、球蛋白(即抗体)有无异常或缺陷 ； 二、检查外周血象和淋巴细胞计数； 三、做皮肤迟发性超敏反应试验；附：反复感染的儿童应该做哪些免疫试验附：反复感染的儿童应该做哪些免疫试验 当怀疑免疫缺陷时，建议进行实验室筛查试验，包括全部血细胞计数及分类计数（淋巴细胞计数）和血小板计数;测定IgG，IgM和IgA浓度;抗体功能测定等 ； 若所有这些筛查试验均正常，则免疫缺陷(特别是抗体缺陷)可排除。但若证实有慢性感染，病史毫无疑问或筛查试验阳性，则必须进一步作高级试验检查。 B细胞(抗体)缺陷的试验 只要总免疫球蛋白很低(200mg/dl)，就可确立抗体缺陷的诊断，再结合其他一些试验用于确定具体的疾病和检定

29、有无其他免疫缺陷 如用荧光抗B细胞特异抗体(如CD19，CD20)经流式细胞仪来计算B细胞 进一步进行血清IgG亚类，IgD和IgE浓度测定等 T细胞缺陷的试验 1.胸部X线检查是筛查婴儿T细胞缺陷的有用方法 （如看不到胸腺影像，提示有T细胞缺陷 ）； 2.做皮肤迟发性超敏反应试验（迟发型皮肤超敏反应试验对2岁以上儿童是有价值的筛查T细胞缺陷的试验）； 3.诊断细胞免疫最有价值的先进试验是T细胞和T细胞亚群(辅助/诱导细胞和抑制/细胞毒细胞)的计数 4.测量病人淋巴细胞增殖和增大(转化)能力的另一种有效的先进试验 5.其他：测细胞因子等等吞噬细胞缺陷的试验 当病人有确切的免疫缺陷病史而B细胞和T细胞免疫正常时，需检查有无吞噬细胞障碍 如四唑氮蓝(NBT)还原试验 吞噬作用还可通过计数分离的粒细胞或单核细胞吞噬胶乳粒子或细菌的情况作检测 大、小吞噬作用补体缺陷的试验 补体异常的筛查是测定血清总补体活性(CH50)以及血清C3，C4浓度。发现其中任何一种浓度低下时，必须接着做经典途径和替代途径的补体滴定，和各个补体成分的测定 还可用抗血清测定补体调控蛋白；遗传性血管性水肿多伴有C1抑制物缺陷，C3分解代谢过盛的C3缺陷伴有因子(C3抑制物)缺陷。测定血清调理活性，趋化活性或杀菌活性可作为判断补体功能的间接试验。