色氨酸(trp)操纵子课件.ppt

1、l lac 和和ara操纵子是编码操纵子是编码分解代谢分解代谢途径酶系的操纵子，途径酶系的操纵子，负责碳源（例如乳糖和阿拉伯糖等）的分解利用，这些操负责碳源（例如乳糖和阿拉伯糖等）的分解利用，这些操纵子的表达受相应碳源的诱导。纵子的表达受相应碳源的诱导。l 在细菌中还有负责一些物质在细菌中还有负责一些物质合成代谢合成代谢的操纵子，例如的操纵子，例如色氨酸操纵子（色氨酸操纵子（tryptophan operon,trp operon）就是）就是负责色氨酸合成的操纵子。负责色氨酸合成的操纵子。trp操纵子是由一个启动子和操纵子是由一个启动子和一个操纵基因区组成，该操纵基因区控制一个编码色氨酸一个操

2、纵基因区组成，该操纵基因区控制一个编码色氨酸生物合成需要的生物合成需要的5种蛋白的多顺反子种蛋白的多顺反子mRNA的表达。的表达。l 由于由于trp体系参与生物合成而不是降解体系参与生物合成而不是降解，它不受，它不受葡萄葡萄糖或糖或cAMP-CRP的调控。的调控。l 色氨酸的合成主要分色氨酸的合成主要分5步完成，有步完成，有7个基因参与整个个基因参与整个合成过程。合成过程。trpE和和trpG编码邻氨基苯甲酸合酶，编码邻氨基苯甲酸合酶，trpD编编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶，码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶，trpF编码异构酶，编码异构酶，trpC编码吲哚甘油磷酸合酶，编码吲哚甘油磷酸合酶，tr

3、pA和和trpB则分别编码色则分别编码色氨酸合酶的氨酸合酶的和和亚基。亚基。l trpE trpE基因是第一个被翻译基因是第一个被翻译的基因，和的基因，和trpEtrpE紧邻的是紧邻的是启启动子区和操纵区动子区和操纵区。另。另外，前导区和弱化子区分别定名为前导区和弱化子区分别定名为trpLtrpL和和trpatrpa（不是（不是trpAtrpA）。）。l trptrp操纵子中产生阻遏物的基因是操纵子中产生阻遏物的基因是trpRtrpR，该基因距，该基因距trptrp基因簇很远。后者位于大肠杆菌染色体图上基因簇很远。后者位于大肠杆菌染色体图上2525分钟处，而分钟处，而前者则位于前者则位于909

4、0分钟处。在位于分钟处。在位于6565分钟处还有一个分钟处还有一个trpStrpS（色（色氨酸氨酸tRNAtRNA合成酶），它与携带有色氨酸的合成酶），它与携带有色氨酸的tRNAtRNATrpTrp共同参与共同参与trptrp操纵子的调控作用。操纵子的调控作用。 l 在在trp mRNA 5 端端trpE基因的起始密码前有一个长基因的起始密码前有一个长162bp的的mRNA片段被称为前导区，其中片段被称为前导区，其中123150位碱基序列如果位碱基序列如果缺失，缺失，trp基因表达可提高基因表达可提高6-10倍，而且无论是在阻遏细胞内倍，而且无论是在阻遏细胞内还是在永久性突变的细胞内都是这样。

5、当还是在永久性突变的细胞内都是这样。当mRNA合成起始以合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有止，产生一个仅有140个核苷酸的个核苷酸的RNA分子，终止分子，终止trp基因转基因转录，这就是录，这就是123150区序列缺失会提高区序列缺失会提高trp基因表达的原因。基因表达的原因。因为转录终止发生在这一区域，并且这种终止是被调节的，因为转录终止发生在这一区域，并且这种终止是被调节的，这个区域就被称为弱化子。这个区域就被称为弱化子。 l研究引起终止的研究引起终止的mRNA碱基序列碱基序列，发现发现该区该区

6、mRNA通通过自我配对可以形成茎过自我配对可以形成茎-环环结构，有典型的终止子特点。结构，有典型的终止子特点。l实验表明衰减作用需要负载实验表明衰减作用需要负载tRNATrp参与，参与，这意味着前导序列的某些部分被翻译了。这意味着前导序列的某些部分被翻译了。分析前导序列发现，它包括起始密码子分析前导序列发现，它包括起始密码子AUG和终止密码子和终止密码子UGA；如果翻译起始；如果翻译起始于于AUG，应该产生一个含有，应该产生一个含有14个氨基酸个氨基酸的多肽。这个假设的多肽（还未实际观的多肽。这个假设的多肽（还未实际观察到）被称为前导肽。察到）被称为前导肽。 l前导序列具有一个非常有意义的特点

7、，在其前导序列具有一个非常有意义的特点，在其第第10和和第第11位位上有相邻的上有相邻的两个色氨酸密码子两个色氨酸密码子。这一点很重。这一点很重要，因为组氨酸操纵子中，也具有弱化子，也具有要，因为组氨酸操纵子中，也具有弱化子，也具有一个类似的能编码前导肽的碱基序列，此序列中含一个类似的能编码前导肽的碱基序列，此序列中含有有7个相邻的组氨酸密码子。苯丙氨酸操纵子中同个相邻的组氨酸密码子。苯丙氨酸操纵子中同样存在弱化子结构，其前导序列中也有样存在弱化子结构，其前导序列中也有7个苯丙氨个苯丙氨酸密码子。这些密码子参与了酸密码子。这些密码子参与了trp及及其他操纵子中的其他操纵子中的转录弱化机制。转录

8、弱化机制。ltrp前导区的碱基序列已经全部测定，引人注目的是前导区的碱基序列已经全部测定，引人注目的是其中其中4个分别以个分别以1、2、3和和4表示的片段能以两种不同表示的片段能以两种不同的方式进行碱基配对（图的方式进行碱基配对（图6-22），有时以），有时以1-2和和3-4配配对，有时只以对，有时只以2-3方式互补配对。方式互补配对。RNaseT1降解实验降解实验（此酶不能水解配对的（此酶不能水解配对的RNA）表明，纯化的）表明，纯化的trp前导前导序列中确有序列中确有1-2和和3-4的配对方式，由此定位的的配对方式，由此定位的3-4配对配对区正好位于终止密码子的识别区，当这个区域发生破区正

9、好位于终止密码子的识别区，当这个区域发生破坏自我配对的碱基突变时有利于转录的继续进行坏自我配对的碱基突变时有利于转录的继续进行。l转录的弱化理论认为转录的弱化理论认为mRNA转录的终止是通过前导转录的终止是通过前导肽基因的翻译来调节的。肽基因的翻译来调节的。因为在前导肽基因中有两因为在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以这个前导肽的翻译必个相邻的色氨酸密码子，所以这个前导肽的翻译必定对定对tRNATrp的浓度敏感。的浓度敏感。l当培养基中色氨酸的浓度很低时，负载有色氨酸的当培养基中色氨酸的浓度很低时，负载有色氨酸的tRNATrp也就少，这样翻译通过两个相邻色氨酸密也就少，这样翻译通过两个

10、相邻色氨酸密码子的速度就会很慢，当码子的速度就会很慢，当4区被转录完成时，核糖区被转录完成时，核糖体才进行到体才进行到1区（或停留在两个相邻的区（或停留在两个相邻的trp密码子密码子处），这时的前导区结构是处），这时的前导区结构是2-3配对，不形成配对，不形成3-4配配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到将对的终止结构，所以转录可继续进行，直到将trp操纵子中的结构基因全部转录。操纵子中的结构基因全部转录。l而当培养基中色氨酸浓度高时，核糖体可顺利而当培养基中色氨酸浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录区被转录之前，核糖体就到达之前，核糖

11、体就到达2区，这样使区，这样使2-3不能配对，不能配对，3-4区可以自由配对形成茎区可以自由配对形成茎-环状终止子结构，环状终止子结构，转录停止，转录停止，trp操纵子中的结构基因被关闭而操纵子中的结构基因被关闭而不再合成色氨酸（图不再合成色氨酸（图6-24）。所以，弱化子对）。所以，弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的所处的位置。位置。The trp operon is negatively regulated by the Trp repressorTrp repressor binds its target DNA sequence

12、 only when it itself is bound by its co-repressor, tryptophan.ltrp操纵子转录的调控是通过操纵子转录的调控是通过Trp阻遏物阻遏物实现的，它实现的，它结合于结合于trp操纵基因序列操纵基因序列 ，但，但Trp阻遏物的阻遏物的DNA结结合活性直接受色氨酸调控，色氨酸结合合活性直接受色氨酸调控，色氨酸结合Trp阻遏物，阻遏物，并起着一个效应分子的作用（也称之辅阻遏物）。并起着一个效应分子的作用（也称之辅阻遏物）。l在有在有高浓度色氨酸高浓度色氨酸存在时，存在时，Trp阻遏物阻遏物-色氨酸复合色氨酸复合物形成一个同源二聚体，并且紧密结合

13、于物形成一个同源二聚体，并且紧密结合于trp操纵基操纵基因序列，因此可以阻止转录。然而当因序列，因此可以阻止转录。然而当色氨酸水平低色氨酸水平低时，缺少色氨酸的时，缺少色氨酸的Trp阻遏物以一种非活性形式存在，阻遏物以一种非活性形式存在，不能结合不能结合DNA。在这样的条件下，。在这样的条件下，trp操纵子被操纵子被RNA聚合酶转录，同时色氨酸生物合成途径被激活。聚合酶转录，同时色氨酸生物合成途径被激活。ltrp操纵子的另一种转录调控是称之衰减作用操纵子的另一种转录调控是称之衰减作用（attenuation）的调控机制，这是一种将翻译与）的调控机制，这是一种将翻译与转录联系在一起的新的转录调控

14、形式。细胞内转录联系在一起的新的转录调控形式。细胞内Trp-tRNATrp浓度决定核糖体是否停留在浓度决定核糖体是否停留在trp mRNA中的前导序列内的两个连续的色氨酸密码中的前导序列内的两个连续的色氨酸密码子处。当色氨酸水平高和子处。当色氨酸水平高和Trp-tRNATrp可利用可利用时，起转录终止作用的发卡环结构（由区时，起转录终止作用的发卡环结构（由区3和区和区4之间）形成，之间）形成，RNA聚合酶刚好在一个聚尿嘧啶的聚合酶刚好在一个聚尿嘧啶的下游处脱离下游处脱离DNA模板，转录终止。模板，转录终止。l当由于细胞内色氨酸有限，当由于细胞内色氨酸有限，Trp-tRNATrp水水平低时，核糖

15、体就停留在平低时，核糖体就停留在RNA中连续的一对中连续的一对色氨酸密码子处。核糖体这一瞬间的停留给出色氨酸密码子处。核糖体这一瞬间的停留给出时间使得一种替换的发卡结构在新的时间使得一种替换的发卡结构在新的RNA中中（由区（由区2和区和区3之间）形成，是一种抗终止的之间）形成，是一种抗终止的RNA结构，它破坏了转录终止信号，使得结构，它破坏了转录终止信号，使得RNA聚合酶能够继续沿着聚合酶能够继续沿着DNA模板滑动完成模板滑动完成转录。转录。P = promoterT = terminatorO = operatortrpRtrpAP OPTTPolycistronic mRNA (encod

16、es 5 proteins)mRNATrpR (repressor)5 separate proteins that were synthesized from one mRNAtrpBtrpCtrpDtrpEAttenuatorTrpREffectively adds a fine tuning to the regulation of the trp operon.Several key points:1. Transcription & translation are tightly coupled in bacteria (attenuation requires this).2. S

17、ynthesis of a leader sequence rich in Trp influences whether transcription of the trp operon is complete.3. If Trp is adequate transcription is terminated before the trp operon.4. If Trp is inadequate transcription is completed.5. Termination of transcription is determined by leader mRNA sequence. m

18、RNA leader sequenceAttenuator110140trpELeader polypeptide14 aa with 2 Trp aa1162Typical stem loopof Termination site12344231mRNATrp codonsmRNA sections1 base pairs with 23 base pairs with 4ONLY 3 + 4 generatethe termination site1234mRNATrp codons2 314Ribosome stalls due to low TrpThis large stem loo

19、p of 2 + 3 does NOT act as a terminator. Transcription continues!RNA polymerase1234431Ribosome moves Rapidly along mRNAmRNA sections3 base pairs with 4 to form a termination site, such that RNApolymeraseprematurely falls off themRNA and aborts furthertranscription. mRNAlAttenuation works by have the

20、 RNA polymerase stop (terminate) before the transcription of the structural genes, but AFTER it has already started to make an RNA.l The key is the region of the operon called trpL (see the figures above).lWe have considered in detail three operons: the lac operon, the ara operon, and the trp operon

21、. The first two are operons concerned with the control of catabolic processes (utilization of energy substrates) while the third is concerned with anabolic processes (synthesis of a molecule the cell needs). lAll three share negative control features, using repressor proteins binding to operators to

22、 place the operon in the off state. The first two have positive control features that increase transcription in response to low glucose (CAP-cAMP binding to the CAP site). This is not the case for the tryptophan operon. The tryptophan operon, however, has the additional negative control feature of a

23、ttenuation. These features are summarized in the following table:consensusTATA (Pribnow) boxE. coli Promoters Allosteric EffectorsBinding can also be required for binding of repressor (e.g. Trp) or can block an activator.Genomic Organization of the Trp Operon The Trp Operon Note that the order of th

24、e genes follows the order of the biosynthetic pathway!Control of Gene Expression in the Trp Operon1) The enzyme catalyzing the first step in the pathway is inhibited by Trp (feedback control).2) In the presence of Trp, a repressor protein binds to an operator upstream of the Trp operon and shuts off

25、 transcription3) Attenuation. There is a 160 base pair region in the Trp mRNA that causes transcription to terminate prematurely if Trp is present. Feedback Control Transcriptional ControlAttenuation ControlAttenuation ControlHigh Trp LevelsRibosome proceedsLoop 3/4 forms Transcription terminatesLow

26、 Trp LevelsRibosome stallsLoop 2/3 formsTranscription continues58trpR P O 1 2 3 4 trpE trpD trp C trp B trpAattenuatorLeaderattenuation can form under certain conditionsbase-pairing can occur between1 - 2 2 - 3 3 - 4Attenuation59transcription & translation occur simultaneously in Prokaryotesleader t

27、ranscript (1) has 2 trp codons (UGGUGG)ribosomes moves fast along transcriptstem-loop 3 - 4 forms, poly Us afterearly termination of transcription, translation stops (only leader peptide forms - has no function)60ribosome stalls at UGGUGG in leader transcript (1)stem-loop 2 - 3 forms, no poly U afte

28、rtranscription continues61ribosome stalls way earlystem-loops 1-2 & 3-4 form, poly U afterearly termination of transcriptionSTOPRight therePolymeraseTrpTrpRepressorRepressorRepressorPromo.trpDtrpBLead.OperatortrpAtrpCtrpEAten.RNAPol.FoiledAgain!Repressor mRNAHey man, Im constitutive3553RibosomeRibos

29、ome5mRNARNAPol. Met-Lys-Ala-Ile-Phe-Val-AAGUUCACGUAAAAAGGGUAUCGACA-AUG-AAA-GCA-AUU-UUC-GUA-Leu-Lys-Gly-Trp-Trp-Arg-Thr-Ser-STOPCUG-AAA-GGU-UGG-UGG-CGC-ACU-UCC-UGA-AACGGGCAGUGUAUUCACCAUGCGUAAAGCAAUCAGAUACCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUU Met-Gln-Thr-Gln-Lys-ProUUUU-GAACAAAAUUAGAGAAUAACA-AUG-CAA-ACA-CAA-AAA-CCG trpE . . .Terminator41234123Terminatorharipin412335534123RNAPol.RibosomeHelp,I needTryptophan35534123RNAPol.RibosomeRNAPol.