分子生物学研究方法.课件.ppt

1、分子生物学研究方法分子生物学研究方法第一节 基因操作的主要技术原理 1 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide) 将某种分子放到特定的电场中，它就会以将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作用下的迁移速度叫作电泳的速率电泳的速率，它与电场强度，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。质的粘度系数等）。

2、在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，离子化的，所以，DNA和和RNA实际上呈实际上呈多聚阴多聚阴离子离子状态（状态（Polyanions）。将）。将DNA、RNA放到电放到电场中，它就会由负极场中，它就会由负极正极移动。正极移动。2 核酸的分子杂交技术核酸的分子杂交技术 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳电泳 分离的分离的DNA或或RNA分子，都是在杂交分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地凝胶中的位置原封不动地“吸印吸印” 转移到转移到

3、滤膜上的。滤膜上的。 常用的滤膜有常用的滤膜有尼龙滤膜尼龙滤膜、硝酸纤维素硝酸纤维素滤膜滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：核酸分子杂交实验包括如下两个步骤： 1.将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌

4、斑印迹法菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)； 2.将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的记或其它标记的DNA或或RNA探针进行杂交。探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。 3 细菌的转化细菌的转化 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的的菌株叫做菌株叫做供体菌株供体菌

5、株，而接受转化，而接受转化DNA的寄主菌株的寄主菌株则称做则称做受体菌株受体菌株。大肠杆菌大肠杆菌是最广泛使用的实验是最广泛使用的实验菌株。在加入转化菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用之前，必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（Competent Cells）。）。Mg2+对维持外源对维持外源DNA的稳定性起重要作的稳定性起重要作用，质粒用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。中的抗生素是筛选标记。 4 DNA序列分析序列分析a. Sanger的双脱氧链终止法的双脱氧链终止法 Cambridge的的F. Sanger在在1977年发明用双脱年发明用

6、双脱氧链终止法测定单链氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如的序列，其基本原理如下：下：DNA聚合酶能够用单链聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确作为模板，合成准确的的DNA互补链；互补链； DNA聚合酶常用聚合酶常用Klenow大片段，大片段，无无53外切酶活性。外切酶活性。该酶能够用该酶能够用2，3-双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸作底物并作底物并将将其聚合到新生寡核苷酸链的其聚合到新生寡核苷酸链的3-末端末端，从而，从而终止其终止其延伸反应延伸反应。在。在DNA测序反应中，加入模板测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），等），

7、DNA聚合酶，聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一种和一种ddNTP。双脱氧链末端终止法测序基本原理示意图 b DNA序列分析自序列分析自动化动化(分析反应分析反应读读片过程片过程 ) 用用四甲基若丹明四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作为作为荧光剂荧光剂标记标记DNA引物，带引物，带有这种引物的有这种引物的DNA片段能在激光诱导片段能在激光诱导下发出荧光。下发出荧光。按照按照标准的双脱氧终止标准的双脱氧终止法法或化学终止法或化学终止法进进行测序反应行测序反应，跑，跑DNA凝胶后凝胶后,用计用计算机检测。算机检测。DNA测序的全过程测序的全过程(实际实际)5

8、 基因的定点诱变（基因的定点诱变（site-directed mutagenesis） 使已克隆基因或使已克隆基因或DNA片段中的任何一个片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作程叫作基因的定点诱变基因的定点诱变，是基因工程和蛋，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。白质工程的重要手段。 如：如： 盒式诱变盒式诱变(cassette mutagenesis)，包括，包括盒盒式取代诱变式取代诱变和和混合寡核苷酸诱变混合寡核苷酸诱变两种方式。两种方式。 6 利用利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究与蛋白质的相互作用进行核酸研究. a.凝胶滞缓凝

9、胶滞缓实验实验(Gel retardation assay)，又称又称DNA迁迁移率变化试移率变化试验验(DNA mobility shift assay-EMSA)。 b DNase I 印迹试验（印迹试验（DNase I foot printing） 主要步骤：主要步骤： 用用32P标记标记DNA双链末端，并用双链末端，并用RE切去一端；切去一端； 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育；加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； 加入适量加入适量DNaseI或硫酸二甲酯或硫酸二甲酯-六氢吡啶，六氢吡啶，使使DNA链发生断裂。链发生断裂。这一反应中，这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关或

10、硫酸二甲酯的用量非常关键，键，要保证每一条要保证每一条DNA链只发生一次磷酸二酯断链只发生一次磷酸二酯断裂！裂！沉淀沉淀DNA（包括与（包括与DNA相结合的蛋白质）；相结合的蛋白质）；进行进行DNA凝胶分析。凝胶分析。 如果某个蛋白质已经与如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带白质结合的部位不产生放射性标记的条带,而是出而是出现了一个空白的区域现了一个空白的区域,形象地称

11、为足迹。形象地称为足迹。 7 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术PCR（polymerase chain reaction）：聚合酶链式反应。1983年由美国科学家Kary Mullis提出，1993年因此而获诺贝尔奖。PCR技术是指通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术，它包括变性、退火、延伸三个步骤。Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用引物（而不

12、是一个引物）去扩增模板DNA 的想法.Mullis开车的时候开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的的两条链，自己的车和对面开来的车象是车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成聚合酶，面对面地合成.DNA， 1983年9月中旬。PCR的基本原理的基本原理 引物引物 dNTP 耐热耐热DNA聚合酶聚合酶 模板模板DNA 变性（变性（denaturation）：）：9098； 退火（退火（annealing）：）：37 72 ； 延伸（延伸（extension）：）：72 。基本要素扩增步骤5-GGTATCAT-33-CCATAGTA-55GGTA-OH

13、（引物（引物1）5 ATGA-OH（引物（引物2）90983-CCATAGTA-55-GGTATCAT-337723-CCATAGTA-55-GGTATCAT-35GGTA-OHOH-AGTA570755-GGTATCAT-33-CCATAGTA-55-GGTATCAT-33-CCATAGTA-5909837723-CCATAGTA-55-GGTATCAT-35GGTA-OHOH-AGTA570755-GGTATCAT-33-CCATAGTA-55-GGTATCAT-33-CCATAGTA-53-CCATAGTA-55-GGTATCAT-3(略)(底物底物DNA)(略)(略)PCR扩增特异性扩

14、增特异性DNA片段全过程片段全过程PCR反应体系反应体系1、脱氧核苷三磷酸（、脱氧核苷三磷酸（dNTP）dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP是PCR的原材料，通过PCR过程聚合成互补链DNA。贮存浓度：贮存浓度：2.5mM使用浓度：使用浓度：200M 使用浓度不当会影响扩增的产量、特异性和保真度。使用浓度不当会影响扩增的产量、特异性和保真度。2、缓冲液（、缓冲液（buffer）标准标准10：140mM Tris-HCl（pH8.8） 48mM MgCl2 40mM (NH4)2SO4 30g/ml BSA 16mM DTT不同厂家生产的不同厂家生产的DNA聚合酶所用到的聚合酶所用到的b

15、uffer不同。不同。3、引物（、引物（primer） 最佳引物使用浓度为最佳引物使用浓度为0.1 M 1.0 M 之间。引物浓度太低，之间。引物浓度太低，扩增产物太少；引物浓度太高，易出现非特异性扩增反应。扩增产物太少；引物浓度太高，易出现非特异性扩增反应。一般贮存浓度：一般贮存浓度：10 M 使用浓度：使用浓度：0.4 M 引物设计要求引物设计要求: :p 设计的引物的核苷酸序列必须与模板链设计的引物的核苷酸序列必须与模板链3端的一段核苷酸序端的一段核苷酸序列互补列互补,且且3端必须有游离的端必须有游离的-OH基团；基团；p 引物一般由引物一般由2030个核苷酸组成，个核苷酸组成，4种核苷

16、酸尽可能随机分布，种核苷酸尽可能随机分布，GC含量应达含量应达4060%；p 引物中应尽量避免回纹序列出现；引物中应尽量避免回纹序列出现；p 引物中最好含有进一步操作中可利用的限制性核酸内切酶识引物中最好含有进一步操作中可利用的限制性核酸内切酶识别序列。别序列。Tm（解链温度）值的计算公式：（解链温度）值的计算公式：引物长度引物长度20nt时：时：Tm=4（G+C）+2（A+T）引物长度引物长度20nt时：时：Tm=81.5+0.41（GC）%600/LPCR过程中选择退火温度时，一般为（过程中选择退火温度时，一般为（Tm 5）4、模板、模板DNA作为作为PCR 的靶的靶DNA一般是一个待扩增

17、的特定双链一般是一个待扩增的特定双链DNA片片段，应知道其两端段，应知道其两端2030bp的核苷酸序列，供设计一对引的核苷酸序列，供设计一对引物之用。物之用。PCR的模板是一条单链的模板是一条单链DNA片段，其片段，其3端具有端具有与引物杂交的序列。与引物杂交的序列。5、耐高温、耐高温DNA聚合酶聚合酶 Taq DNA聚合酶 来自嗜热古细菌来自嗜热古细菌Thermus aquaticus。该菌。该菌1967年从温泉中分离，最适年从温泉中分离，最适生长温度生长温度70。现市场上销售的是该基因在。现市场上销售的是该基因在E.coli细胞中的表达产物。细胞中的表达产物。特征：特征：相对分子质量为相对

18、分子质量为94103，为单分子酶，具较强的，为单分子酶，具较强的53DNA聚合聚合酶活性和较弱的酶活性和较弱的53外切酶活性，缺乏外切酶活性，缺乏3 5外切酶活性。最适外切酶活性。最适pH9.0，最适反应温度最适反应温度75。合成出错几率。合成出错几率8.910-51.110-4。 Pwo DNA聚合酶聚合酶 来自喜温性古细菌来自喜温性古细菌Pyrococcus woesei。现市场上销售的是该基因在现市场上销售的是该基因在E.coli细胞中的表达产物。细胞中的表达产物。特征：特征：相对分子质量为相对分子质量为90103，具较强的，具较强的53DNA聚合酶活性，兼聚合酶活性，兼35外切酶活性。

19、耐热性更高，保真度比外切酶活性。耐热性更高，保真度比TaqDNA聚合酶高聚合酶高10倍。倍。 Tth DNA聚合酶聚合酶来自喜温性真细菌来自喜温性真细菌Thermus thermophilus HB8。具较强的。具较强的53DNA聚聚合酶活性，缺乏合酶活性，缺乏3 5 外切酶活性。最适外切酶活性。最适pH9.0，最适反应温度，最适反应温度75。Mg2+存在时，以存在时，以DNA为模板合成为模板合成DNA，Mn2+存在时，可以存在时，可以RNA为模板为模板合成合成cDNA，用于，用于RT-PCR系统。系统。 Vent DNA 聚合酶聚合酶来自嗜热高温球菌来自嗜热高温球菌Thermococcus

20、litoralis 。相对分子质量。相对分子质量85103。100时该酶半衰期为时该酶半衰期为1.8hr，具有，具有3 5 外切酶校对活性。合成的准确外切酶校对活性。合成的准确度比用度比用Taq DNA 聚合酶高聚合酶高5 15倍。倍。 Pfu DNA 聚合酶聚合酶来自激烈热球菌来自激烈热球菌Pyrococcus fariosus。保真度较高。保真度较高。 KOD DNA 聚合酶聚合酶特征：具有强力的35核酸外切酶活性，与Taq DNA聚合酶相比，保真度比后者高50倍左右。合成速度比Taq DNA聚合酶快2倍，比Pfu DNA聚合酶快6倍。耐热性比Taq DNA聚合酶好，在100、1小时的热处

21、理后仍可保持约70的活性，故根据需要可以将热变性步骤的温度设定值提得更高，这对处理GC含量高的模板等具有特异性高级结构的样品非常有利。PCR反应程序反应程序 1、常规程序、常规程序9098 预热预热30sec5min；9098 变性变性15 30sec；40 60 退火退火30sec；72 延伸延伸1min（1kb）；）；72 延伸延伸7 10min；4 保存。保存。2035循环反应底物和产物在DNA扩增中不断发生变化，最终将会导致聚合反应进入平台期，平台期出现的时间与聚合酶的特性有关。研究表明，利用Klenow片段进行20次扩增后进入平台期，累积产物拷贝数为2105，当采用Taq DNA聚合

22、酶时，扩增25次后才进入平台期，拷贝数可达4106。出现平台期的原因可能有：后期循环酶浓度或聚合时间不足；引物耗尽；dNTP耗尽；产物浓度过高，以致ds-DNA解链后又迅速退火，不能与引物结合。 一、基因工程概述一、基因工程概述 1.1.概念概念 基因工程：基因工程：是指将外源基因经过剪切加工，是指将外源基因经过剪切加工，再插入到一个具有自我复制能力的载体再插入到一个具有自我复制能力的载体DNA中，中，就得到重组就得到重组DNA，再将重组，再将重组DNA转移到一个寄转移到一个寄主细胞中，外源基因就可以随着寄主细胞的分主细胞中，外源基因就可以随着寄主细胞的分裂进行繁殖，寄主细胞也借此获得外源基因

23、所裂进行繁殖，寄主细胞也借此获得外源基因所携带的新特性。携带的新特性。 第二节第二节 基因工程基因工程2.基因工程的基本程序及技术特点：基因工程的基本程序及技术特点： 基本程序：基本程序： 分分 切切 接接 转转 筛筛基因工程的基本程序基因工程的基本程序 技术特点：技术特点： 1. 可在体外根据需要进行人工的、可在体外根据需要进行人工的、有目的的基因有目的的基因重组重组、表达表达、测序测序、诱变、诱变、修复；修复； 2. 方法简便、快速、准确、特异，方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发的需要。能保证研究与开发的需要。3.基因工程的主要技术基因工程的主要技术 DNA、RNA的分离纯化的分

24、离纯化 凝胶电泳技术凝胶电泳技术 PCR技术技术 DNA合成技术合成技术 DNA重组重组 微生物的培养、保存微生物的培养、保存 酶切酶切 鉴定鉴定 DNA测序测序 分子杂交分子杂交4.1概念概念4.基因克隆基因克隆克隆的概念克隆的概念在多细胞的高等生物个体水平上，在多细胞的高等生物个体水平上，是指由具有是指由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。群体。在细胞水平上，在细胞水平上，是指由同一个祖细胞分裂而来是指由同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。的一群遗传上同一的子细胞群体。在分子生物学上，在分子生物学上，是指将外源是指将外

25、源DNA插入具有复插入具有复制能力的载体制能力的载体DNA中，使之永久保存和复制的过中，使之永久保存和复制的过程。程。 亚克隆的概念亚克隆的概念 是对已经获得的目的是对已经获得的目的DNA片段进行重新片段进行重新克隆，其目的在于对目的克隆，其目的在于对目的DNA进行进一进行进一步分析，或者进行重组改造等。步分析，或者进行重组改造等。 基因克隆基因克隆 是指应用酶学的方法，在体外将是指应用酶学的方法，在体外将目目的基因的基因与与载体载体DNA结合成一具有自我复结合成一具有自我复制能力的制能力的DNA分子（分子（重组体重组体），继而通），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目过转化或转染宿主细胞

26、、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量相同的取获得大量相同的DNA分子拷贝分子拷贝。4.2基因克隆示意图基因克隆示意图 载体DNA(限制性内切酶切开)目的基因宿主细胞重组体已转化的宿主细胞阳性克隆株繁殖表达二二.基因工程的要素及实施基因工程的要素及实施（一）、工具酶（一）、工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切割识别并在特定位点切割DNADNA连接酶连接酶通过生成通过生成3, 5-磷酸二酯键磷酸二酯键,把两个或多个把两个或多个DNA片段连接成一个片段连接成一个DNA分子分子DNA聚合酶聚合酶探针标记、探针标记、 从从3-O

27、H端补平双链中端补平双链中的缺口的缺口反转录酶反转录酶以以RNA链为模板，进行链为模板，进行cDNA合成合成多核苷酸激酶多核苷酸激酶5磷酸化、探针标记磷酸化、探针标记末端转移酶末端转移酶在双链核酸的末端在双链核酸的末端3加上多聚单核加上多聚单核苷酸苷酸碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除切除5末端磷酸基末端磷酸基1.常用的工具酶的功能：常用的工具酶的功能：酶类名称酶类名称功能功能 阿尔伯阿尔伯(Arber)(Arber)、史密斯、史密斯(Smith)(Smith)和内森斯和内森斯(Nathans)(Nathans)，获，获19781978年度诺贝尔生理学和医学奖年度诺贝尔生理学和医学奖. .2.一把特殊的

28、剪刀一把特殊的剪刀限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现3.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction enzyme)的分类、作用及的分类、作用及命名命名 作用作用：识别：识别双链双链DNA内部内部特异位点特异位点并裂解磷酸并裂解磷酸二酯键二酯键 分类分类：型、型、型型、型型 命名命名（举例举例）EcoR(E：属名；：属名；co：种名；：种名；R：株；：株；：发现次序：发现次序)3.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction enzyme)的识别的识别和切割和切割 识别和切割位点：识别和切割位点： 回文结构回文结构 46 bp 出现两种末端：出现两种末端：*粘性末端粘

29、性末端 （粘端）粘端） *平头末端平头末端 （平端）平端） 产生了平产生了平头末端头末端产生了粘产生了粘性末端性末端粘性末端与平头末端粘性末端与平头末端EcoRGAATTCCTTAAG5533553355G GCTTAACTTAAAATTCAATTCG G333355粘性末端粘性末端SmaCCCGGGGGGCCC5533335555CCCCCCGGGGGGGGGGGGCCCCCC333355平头末端平头末端4.修饰与限制作用修饰与限制作用 活性：活性： 5 3聚合酶活性：聚合酶活性： 核酸外切酶活性：核酸外切酶活性：5 3外切酶活性外切酶活性3 5外切酶活性外切酶活性 DNA pol 经经枯草

30、杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两裂解可得大、小两个片段个片段 大片段大片段 （Klenow片段）具有片段）具有5 3聚合活性聚合活性和和 3 5外切活性，是外切活性，是常用的工具酶。常用的工具酶。5. DNA聚合酶(pol )6. DNA连接酶连接酶 7.同工异源酶：同工异源酶：来源不同，但能识别和切来源不同，但能识别和切割同一位点。割同一位点。 8.同尾酶：同尾酶：识别序列不同，但产生相同的识别序列不同，但产生相同的粘性末端。粘性末端。（二）、载体（二）、载体 （ vector） 1.本质：本质：DNA ，能在宿主细胞中进行自，能在宿主细胞中进行自我复制和表达我复制和表达 2.克隆载

31、体的种类：克隆载体的种类： 原核载体原核载体：质粒：质粒(pBR322,pUC） 噬菌体（噬菌体（，M13）等）等 真核载体真核载体：动物病毒载体：动物病毒载体pLXSN等等3.载体的基本要求：载体的基本要求： .复制单位复制单位; . 克隆位点克隆位点(多个单克隆位点多个单克隆位点); . 筛选标记筛选标记; . 分子量尽可能小分子量尽可能小; . 外源外源DNA插入后不影响载体本身的复制能力插入后不影响载体本身的复制能力. 没有一个天然的没有一个天然的DNA完全符合载体条件完全符合载体条件,故故使用时需进行改造使用时需进行改造. 4.常用的克隆载体常用的克隆载体：质质粒粒质粒质粒(plas

32、mid)存在于细菌染色体外的小型存在于细菌染色体外的小型环状双链环状双链DNA分子。分子。 * 大小大小 210kb； * 优点：易于操作、保存；优点：易于操作、保存； * 缺点：转化效率较低；缺点：转化效率较低； * 转化方法：转化方法：化学法化学法 电转移法电转移法 * 应用：应用：a. 小基因组的克隆小基因组的克隆 b. 单一序列的克隆单一序列的克隆( 目的基因的目的基因的 克隆克隆)（1）质粒载体的一般特点：）质粒载体的一般特点：（2）理想的质粒载体具有如下特点：）理想的质粒载体具有如下特点： * 拷贝数多拷贝数多; * 两三个遗传标志，如抗药性基因：两三个遗传标志，如抗药性基因：抗抗

33、氨苄青霉素基因氨苄青霉素基因(ampr) 、抗四环素基因抗四环素基因(terr)；-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因(lac Z) 筛选筛选标志标志* 多个限制酶的单一切点，即多个限制酶的单一切点，即多克隆位多克隆位点点(multiple cloning sites,MCS)pBR系列系列 来源于来源于Psc101、colE1和和RSF2124三个天然三个天然质粒改造重组而成。质粒改造重组而成。 pBR322是应用最多的大肠是应用最多的大肠杆菌质粒载体，用氯霉素扩增法可使质粒杆菌质粒载体，用氯霉素扩增法可使质粒DNA占占细胞细胞DNA总量的总量的50%，这对制备大量质粒，这对制备大量质粒DNA极为

34、有利。极为有利。（3）质粒载体举例）质粒载体举例 四环素抗性基因氨苄青霉素 抗性基因O r i Pst Sal Pvu Ava Bam HHind Eco RpBR322(amp(ampr r) )(ter(terr r) )pUC系列系列 pUC系列质粒（系列质粒（ pUC 8、9、12、13、18、19）具有）具有pBR和和M13的许多特性，一般的许多特性，一般2.7kb. 含含有有Ampr基因和基因和LacZ基因的一部分基因的一部分。EcoSacKpnSmaBamXbaSalPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalX

35、baBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)r5.常用的克隆载体常用的克隆载体噬菌体载体噬菌体载体（1）噬菌体噬菌体(phage)的特点：的特点： .一种能感染大肠杆菌的病毒，野生型含一种能感染大肠杆菌的病毒，野生型含有双链线状有双链线状DNA分子（分子（DNA ） ，长度，长度48.5kb, 分子两端各有一个分子两端各有一个12bp组成的粘性末端组成的粘性末端, 感染大感染大肠杆菌后肠杆菌后,线状线状DNA通过粘性末端互补连接成环通过粘性末端互补连接成环, 连接处称连接处称COS位点。位点。 . 本身有复制体系本身有复制

36、体系; . 感染大肠杆菌后要进行环化感染大肠杆菌后要进行环化DNA感染大肠杆菌后的环化过程感染大肠杆菌后的环化过程 . DNA在体外可包装成病毒颗粒在体外可包装成病毒颗粒, 感染效率感染效率高高; . 载体容量大载体容量大,可装入大片段外源可装入大片段外源DNA (20kb); . 可人工加入多克隆位点可人工加入多克隆位点; . 筛选容易筛选容易噬菌斑筛选噬菌斑筛选; . 主要用于主要用于DNA文库的构建文库的构建.（2）M13噬菌体噬菌体 特点：一种丝状单链噬菌体，闭环正链特点：一种丝状单链噬菌体，闭环正链ssDNA，全长，全长6.5kb, 感染大肠杆菌后感染大肠杆菌后, ssDNA 转转变

37、为变为dsDNA, 可用作克隆载体。可用作克隆载体。 最大优点：产生单链最大优点：产生单链DNA, 可制备单链可制备单链DNA探针。探针。 柯斯质粒柯斯质粒(cosmid) 粘性质粒粘性质粒基本结构特征基本结构特征:是一种人工改造的载体是一种人工改造的载体,双链环状双链环状DNA组成组成:DNA的的 cos区区+质粒质粒+控制包装作控制包装作用的序列用的序列克隆容量克隆容量：31 45kb 常用的克隆载体常用的克隆载体柯斯质粒柯斯质粒4. cosmid较小较小, 约约4 6kb.5. cosmid重组体可象噬菌体一样进行外壳装配重组体可象噬菌体一样进行外壳装配, 形形成噬菌体颗粒成噬菌体颗粒,

38、 感染大肠杆菌效率比质粒高得多感染大肠杆菌效率比质粒高得多, 进入宿主细胞后进入宿主细胞后, 只能象质粒一样扩增只能象质粒一样扩增, 并依赖抗并依赖抗药性被筛选药性被筛选.1. 具有具有-DNA的的COS位点位点;2. 具有质粒的复制起点和抗药性标记具有质粒的复制起点和抗药性标记 (Ampr);3. 具有多种单一的酶切位点具有多种单一的酶切位点.柯斯质粒柯斯质粒(cosmid)的特点的特点: 柯斯质粒柯斯质粒的优缺点的优缺点: 1.克隆效率高克隆效率高; 2.可利用质粒可利用质粒DNA的方式扩增的方式扩增; 3.可克隆较大可克隆较大DNA片段片段; 主要用于真核基因的克隆主要用于真核基因的克隆

39、, 基基因组文库构建因组文库构建 4.缺点缺点: 产生串联现象。产生串联现象。YAC载体载体 酵母人工染色体，可容纳外源基因片段长达酵母人工染色体，可容纳外源基因片段长达200kb-1000kb，含有酵母第，含有酵母第4号染色体的着丝粒号染色体的着丝粒和自主复制序列和自主复制序列CEN4、ARS1，作为端粒的，作为端粒的Tel序列，选择性标志序列，选择性标志URA3、TRP1和和SUP4，能在，能在酵母中稳定的复制，常用于大的染色体基因组酵母中稳定的复制，常用于大的染色体基因组DNA文库构建。文库构建。其他克隆载体：其他克隆载体： 插入型载体插入型载体含单一的限制性酶切位点，含单一的限制性酶切

40、位点，可接受可接受10kb以下的外源片段，以下的外源片段，可用于可用于cDNA文库文库构建；构建； 取代型载体取代型载体含某一限制性酶的两个切点，含某一限制性酶的两个切点，可接受可接受20kb左右的外源片段，左右的外源片段，可用于基因组可用于基因组DNA文库构建。文库构建。经人工改造生成的基因克隆经人工改造生成的基因克隆载体类型载体类型目的基因目的基因(target DNA)的制备的制备 目的基因（外源基因）目的基因（外源基因） 制备基因组制备基因组DNA - 基因文库基因文库(genomic library)存在于转化细菌存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组中、克隆载体携带的所有基因组

41、DNA的集合的集合 制备制备cDNA - cDNA文库文库(cDNA library) 制备用于表达的基因片段：制备用于表达的基因片段：PCR技术、化技术、化学合成学合成文库构建文库构建 基因组文库基因组文库cDNA文库文库 区别区别 ：材料：材料 基因结构不同基因结构不同 文库内容文库内容 载体载体 使用范围使用范围构建基因文库的克隆载体构建基因文库的克隆载体粘粒粘粒(Cosmid)细菌人工染色体细菌人工染色体(BAC)酵母人工染色体酵母人工染色体(YAC)P1噬菌体人工染色体噬菌体人工染色体(PAC)基因文库的构建的步骤基因文库的构建的步骤:载体载体DNA的分离的分离真核生物真核生物DNA

42、的分离的分离部分酶解部分酶解片段回收片段回收(9-23 kb)载体与插入片段的连接载体与插入片段的连接包装包装文库的效价测定文库的效价测定文库的扩增文库的扩增文库的保存文库的保存重组克隆鉴定重组克隆鉴定高丰度高丰度中丰度中丰度低丰度低丰度 cDNA文库的构建文库的构建cDNA文库能否构建成功的关键是文库能否构建成功的关键是: 高质量的高质量的mRNA的获得的获得一个好的一个好的cDNA文库的特征文库的特征: 包含有足够大量的独立克隆，代表最初的包含有足够大量的独立克隆，代表最初的mRNA样品中的所有转录本样品中的所有转录本 克隆中包含接近全长的克隆中包含接近全长的mRNA cDNA libra

43、ry constructionAAAAA53 mRNA (all mRNAs in cell)anneal oligo(dT) primers of 12-18 bases in lengthAAAAATTTTT535add reverse transcriptase and dNTPsAAAAATTTTT5335 cDNAadd RNaseH (specific for the RNA strand of an RNA-DNA hybrid) and carry out a partial digestionAATTTTT5short RNA fragments serve as prime

44、rs for second strand synthesis using DNA polymerase I 33AAAAATTTTT53short RNA fragments serve as primers for second strand synthesis using DNA polymerase I AAATTTTT53DNA polymerase I removes the remaining RNA with its 5 to 3 exonuclease activity and continues synthesisDNA ligase seals the gaps AAATT

45、TTT53AAAAATTTTT53double-stranded cDNAAAAAATTTTT53NNNNNNNNGNNNNNNNNCTTAAEcoRI linkers are ligated to both endsusing DNA ligaseAAAAANNNNNNNNGTTTTTNNNNNNNNCTTAA double-stranded cDNA copies of mRNA with EcoRI cohesive ends are now ready to ligate into a bacteriophage lambda vector cut with EcoRI53AATTCN

46、NNNNNNN GNNNNNNNNCIP:牛小肠碱性磷酸酶牛小肠碱性磷酸酶粘性末端连接法（粘性末端连接法（连接效率高连接效率高）和去和去磷酸连接法磷酸连接法载体与目的基因的连接方法载体与目的基因的连接方法人工接头法：人工接头法：同聚物接尾法同聚物接尾法目的基因载体DNA+dGTP+dCTPPolyGPolyC3333重组重组DNA技术的基本过程小结技术的基本过程小结 目的基因的制备目的基因的制备 载体的选择和制备载体的选择和制备 DNA分子的体外连接分子的体外连接 将外源将外源DNA导入宿主细胞导入宿主细胞 目的基因的筛选和鉴定目的基因的筛选和鉴定基因工程的基本操作步骤及其基因工程的基本操作步

47、骤及其应用意义应用意义 基因工程的基本操作步骤：基因工程的基本操作步骤：获取外源目的基因；获取外源目的基因；寻找基因载体寻找基因载体(通常为质粒、噬菌通常为质粒、噬菌体等体等)使用限制性内切酶，使目的基使用限制性内切酶，使目的基因与载体产生相同粘性末端，两个因与载体产生相同粘性末端，两个末端互补连接，形成重组末端互补连接，形成重组DNA；通过转化通过转化(或感染或感染)将重组将重组DNA引入引入寄主细胞；寄主细胞；从大量的寄主细胞中筛选出带有重从大量的寄主细胞中筛选出带有重组组DNA的细胞进行培养。的细胞进行培养。 意义：意义：利用基因工程技术，可以大量生产在一些正常利用基因工程技术，可以大量生产在一些正常细胞中产量很低的多肽物质，用于医药等工业细胞中产量很低的多肽物质，用于医药等工业生产中；生产中；定向改造生物基因结构，生产抗病强、品质优定向改造生物基因结构，生产抗病强、品质优的各种农副产品，以提高经济价值；的各种农副产品，以提高经济价值；用于生命科学的基础研究；用于生命科学的基础研究；值得注意的是，基因工程技术若使用不当、管值得注意的是，基因工程技术若使用不当、管理不善，也会给人类带来灾难。理不善，也会给人类带来灾难。