膜片钳技术课件.ppt
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- 关 键 词:
- 膜片 技术 课件
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1、1六、膜片钳技术六、膜片钳技术2膜片钳技术运用微玻管电极(膜片电极膜片钳技术运用微玻管电极(膜片电极或膜片吸管)接触细胞膜,以千兆欧姆或膜片吸管)接触细胞膜,以千兆欧姆giga giga ohm seal,10ohm seal,101010欧姆(欧姆(GG) 以上的阻抗使之以上的阻抗使之对接,使与电极尖开口处相接的细胞膜小片对接,使与电极尖开口处相接的细胞膜小片区域(膜片)与其周围在电学上分隔,在此区域(膜片)与其周围在电学上分隔,在此基础上固定电位,对此膜片上的离子通道的基础上固定电位,对此膜片上的离子通道的离子电流(离子电流(pApA级)进行检测记录。级)进行检测记录。34膜片钳技术膜片钳
2、技术An electrical wave, which propagates along the nerve fiberCaused by the sequential opening of Na+ and K+ channelsBeing generated at the axon hillock by the integration of excitatory and inhibitory synaptic inputs Hodgkin 和和 Huxley 1952: 动作电位是神经细胞膜通透性改变的结果动作电位是神经细胞膜通透性改变的结果单通道的到来单通道的到来:1969人工膜上的人工膜
3、上的短杆菌肽通道短杆菌肽通道Individual Channel Currents superimpose to Noise:单通道电流单通道电流有噪音叠加有噪音叠加7l19761976年德国马普生物物理化学研究所年德国马普生物物理化学研究所NeherNeher和和SakmannSakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时,记录到位的同时,记录到AChACh激活的单通道离子电流,激活的单通道离子电流,从而产生了膜片钳(从而产生了膜片钳(patch clamppatch clamp)技术)技术膜片钳技术发展的历史膜片钳技术发展的历史89 内尔内尔(N
4、eher) 萨克曼萨克曼(Sakmann) (1944-) (1942-) (德国细胞生理学家)(德国细胞生理学家) (德国细胞生理学家)(德国细胞生理学家)10Patch Clamp (1976 ve sonras)11第一次记录第一次记录:12l19801980年年SigworthSigworth等在记录电极内施加等在记录电极内施加5-50 cmH5-50 cmH2 2O O的负压吸引,得到的负压吸引,得到10-100G10-100G的高阻封接的高阻封接(Giga-sealGiga-seal),大大降低了记录时的噪声,实),大大降低了记录时的噪声,实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电
5、现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。流的突破。13第一次记录第一次记录:改进改进: 千兆欧(千兆欧(G)封接)封接14l19811981年年HamillHamill和和NeherNeher等对该技术进行了改等对该技术进行了改进,引进了膜片游离技术和全细胞记录技术,进,引进了膜片游离技术和全细胞记录技术,从而使该技术更趋完善,具有从而使该技术更趋完善,具有1pA1pA的电流灵的电流灵敏度、敏度、1m1m的空间分辨率和的空间分辨率和10s10s的时间分的时间分辨率。辨率。15l19831983年年1010月月Single-Channel RecordingSingle-Channel
6、 Recording一书问世,奠定了膜片钳技术的里程碑。一书问世,奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann Sakmann 和和NeherNeher也因其杰出的工作和突出也因其杰出的工作和突出贡献,荣获贡献,荣获19911991年诺贝尔奖。年诺贝尔奖。16THE PATCH-CLAMP TECHNIQUEErwin NeherBert SakmannGermany(1991 Nobel Laureates) gigaseal17 1983年年10月第一版月第一版 Single-Channel Recording封面封面1819202122(二)膜片钳记录的基本模式(二)膜片钳记录的基本模式1.
7、 贴附式记录模式贴附式记录模式 (Cell-attached or On cell mode)2. 内膜向外记录模式内膜向外记录模式 (Inside-out mode)3. 外膜向外记录模式外膜向外记录模式 (Outside-out mode)4. 全细胞记录模式全细胞记录模式 (Whole-cell recording)23CELL-ATTACHED24Pipette HolderP: pipetteO: O-ringsTd: threadsT: teflon body sectionsA: aluminium body shieldsAg: chlorided silver electro
8、deS: silicone tubing to apply suctionBNC: connector pin 26微电极在显微镜下贴近细胞后,给微电微电极在显微镜下贴近细胞后,给微电极施加一负压,形成高阻抗封接。此时可看极施加一负压,形成高阻抗封接。此时可看到背景噪音明显减少,通常选取电极下仅有到背景噪音明显减少,通常选取电极下仅有一个通道的膜片进行分析,即单通道记录,一个通道的膜片进行分析,即单通道记录,以利于不失真的观察一个通道的活动状态。以利于不失真的观察一个通道的活动状态。27Looking through the microscopePatch pipetteEjection pi
9、petteCell body50mIsolated neuronalcell bodymaintained inculturepatch-clamp techniquefor recordingelectrical activityDEET3132INSIDE-OUT33电极接触细胞电极接触细胞负压吸引形成负压吸引形成形膜囊泡形膜囊泡提起电极提起电极,囊泡与细胞脱离囊泡与细胞脱离ABCD大鼠肌球细胞大鼠肌球细胞ACh受体单通道电流受体单通道电流34OUTSIDE-OUT35WHOLE-CELL19:073619:0737穿孔膜片钳法穿孔膜片钳法其特点是不打破电极腔下的细胞膜片,而代之其特点是不
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