PCR技术简介课件.ppt
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1、PCR技术简介PCR技术简介技术简介-定义定义 PCR: polymerase chain reaction 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 PCR技术是一种体外模拟自然技术是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增复制过程的核酸扩增技术,亦称为无细胞分子克隆技术。它是以待扩增的两条技术,亦称为无细胞分子克隆技术。它是以待扩增的两条DNA链为模板,在一对人工合成的寡核苷酸引物的介导下,链为模板,在一对人工合成的寡核苷酸引物的介导下,通过耐高温通过耐高温DNA聚合酶的酶促作用,快速特异地扩增出特聚合酶的酶促作用,快速特异地扩增出特定的定的DNA片断。片断。 简单的讲,简单的讲, PCR技术即通过引
2、物延伸核酸的某个区域而技术即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向进行的重复双向DNA合成。合成。PCR技术简介技术简介-目的目的 目的:目的: 用于扩增位于两段已知序列之间的用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片断片断。 由于由于PCR技术具有简单、快速、特异和灵敏的特点,技术具有简单、快速、特异和灵敏的特点,所以自所以自1985年年Mullis发明发明PCR技术和技术和1988年年Erlich发现发现耐高温的耐高温的DNA聚合酶以来,该技术以惊人的速度广泛聚合酶以来,该技术以惊人的速度广泛应用于生命科学的各个领域,特别是在细胞学、病毒学、应用于生命科学的各个领域,特别是在细胞学、病毒学
3、、肿瘤学、遗传病学、法医学、动植物免疫学等方面取得肿瘤学、遗传病学、法医学、动植物免疫学等方面取得了巨大的成绩,成为当代分子生物学发展史上的一个里了巨大的成绩,成为当代分子生物学发展史上的一个里程碑。程碑。PCR技术简介技术简介-原理 设计两段寡核苷酸引物,这两段寡核苷酸引物序列互不相同,设计两段寡核苷酸引物,这两段寡核苷酸引物序列互不相同,并分别与模板并分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补,而这两段模两条链上的各一段序列互补,而这两段模板序列由分别位于待扩增板序列由分别位于待扩增DNA区段的两侧。反应时,首先在区段的两侧。反应时,首先在摩尔数大大过量的两段引物及四种摩尔数大大过量的两段引
4、物及四种dNTP参与下对模板参与下对模板DNA进行加热变性;随之,将反应混合液冷却到某一温度,这一进行加热变性;随之,将反应混合液冷却到某一温度,这一温度可使引物与它的靶序列退火;此后退火引物在温度可使引物与它的靶序列退火;此后退火引物在DNA聚合聚合酶作用下得以延伸。如此反复进行变性、退火和酶作用下得以延伸。如此反复进行变性、退火和DNA合成这合成这一循环。由于一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板,所一循环。由于一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板,所以在这一周而复始的过程中每完成一个循环,就基本上使目以在这一周而复始的过程中每完成一个循环,就基本上使目的的DNA产物增加一倍。这一指数反应的
5、主产物是一段双链产物增加一倍。这一指数反应的主产物是一段双链DNA,它的两个末端由寡核苷酸引物的它的两个末端由寡核苷酸引物的5端来决定,而长度端来决定,而长度则取决于两引物间的距离。则取决于两引物间的距离。PCR技术简介技术简介PCR反应所用酶:反应所用酶: 早期的早期的PCR方法采用大肠杆菌方法采用大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的的Klenow片断催化退火的寡核苷酸引物进行延伸反应。片断催化退火的寡核苷酸引物进行延伸反应。由于该酶会在进行由于该酶会在进行DNA变性的温度下失活,所以在每一变性的温度下失活,所以在每一轮合成反应中都须重新加轮合成反应中都须重新加1份酶。并且在扩增较长模板份酶。并且
6、在扩增较长模板是效果不够理想,产率较低,有一些错配,导致产物大是效果不够理想,产率较低,有一些错配,导致产物大小不均一。小不均一。 耐热耐热DNA聚合酶是从一种嗜热细菌嗜热水生菌种聚合酶是从一种嗜热细菌嗜热水生菌种提纯出来的,经提纯出来的,经95持续温育仍有活性,不会在加热变持续温育仍有活性,不会在加热变性中失活,故无需每轮反应都重新加酶,又由于寡核苷性中失活,故无需每轮反应都重新加酶,又由于寡核苷酸引物的退火和变性可以在更高温度下进行,使引物和酸引物的退火和变性可以在更高温度下进行,使引物和模板间的误配大大减少,提高了扩增反应的特异性和产模板间的误配大大减少,提高了扩增反应的特异性和产率,并
7、且可以扩增更长的产物。率,并且可以扩增更长的产物。PCR技术简介技术简介反应体系反应体系:按照以下次序,将各充分在灭菌离心管中混合,按照以下次序,将各充分在灭菌离心管中混合,灭菌水灭菌水 ? lMgCl2溶液溶液 (25mmol/L) 6-8-10ul 1.5-2.0-2.5mmol/L10扩增缓冲液扩增缓冲液 10l4种种dNTP混合物(混合物(2.5mmol/L) 8ul(?)(?) 20mmol正向引物(正向引物(25 pmol/ul,超纯水配制)超纯水配制)4ul 100pmol反向引物(反向引物(25pmol/ul,超纯水配制)超纯水配制) 4ul 100pmolDNA Taq聚合酶
8、聚合酶 0.5l 2.5U模板模板DNA 1ul 1g总体积总体积 100ulPCR技术简介技术简介典型的反应条件典型的反应条件:循环循环 变性变性 退火退火 聚合聚合首轮循环首轮循环 94 955分钟分钟 502分钟分钟 722分钟分钟后续循环后续循环 94951分钟分钟 502分钟分钟 722分钟分钟末轮循环末轮循环 94951分钟分钟 502分钟分钟 7210分钟分钟PCR技术简介技术简介引物设计原则:引物设计原则: 1.长度以长度以1530个碱基为宜。个碱基为宜。 2.正向反向两条引物链之间的距离适中,一般使扩增出的片断在正向反向两条引物链之间的距离适中,一般使扩增出的片断在300-1
9、100bp之间。如果使用之间。如果使用RT-PCR检测检测RNA病毒,引物间距离以病毒,引物间距离以500bp最佳。片断过短影响结果判定,过长则不易扩增。最佳。片断过短影响结果判定,过长则不易扩增。 3.引物碱基组成应随机分布,引物碱基组成应随机分布,G+C含量在含量在45-55为宜。为宜。 4.引物自身不形成二级结构,引物间没有互补序列(引物自身不形成二级结构,引物间没有互补序列(4个碱基以上)。个碱基以上)。 5.引物序列必须是被检病毒特异的。引物序列必须是被检病毒特异的。 6.引物引物3端碱基与模板端碱基与模板DNA一定要配对,并且一定要配对,并且3末端碱基最好选末端碱基最好选T、 C或
10、者或者G,不选不选A。PCR技术简介技术简介引物含量计算:引物含量计算:1OD260 单位单位DNA是指在是指在1ml体积体积1cm光程标准比色皿中,光程标准比色皿中,260nm波长下吸光度为波长下吸光度为1A260DNA溶液,据此计算,溶液,据此计算,1OD260单位相当于单位相当于33ug的的DNA。 DNA分子量计算:分子量计算:MW=(A碱基数碱基数312)+(C碱基数碱基数288)+(G碱基数碱基数328)+(T碱基数碱基数303) PCR技术简介技术简介DNA近似分子量计算:近似分子量计算: MW=总碱基数总碱基数324.5(DNA中每个脱氧核苷酸中每个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近
11、似为碱基的平均分子量近似为324.5) 例:例: 若你得到若你得到1管管5 OD260的引物的引物DNA,引物长度为引物长度为20个个碱基,则碱基,则MW=20324.5=6490 质量数质量数=533=165ug 摩尔数摩尔数=165/6490=0.025umol=25nmol 若要稀释到若要稀释到25pmol/ul,即即25nmol/ml,则需要加则需要加1ml的的双蒸灭菌水稀释。双蒸灭菌水稀释。PCR技术简介技术简介设计程序中用到的温度:设计程序中用到的温度:变性温度变性温度:94C or 95C ,不变;不变;延伸温度:延伸温度:72C,不变;不变;退火温度:退火温度:50C左右,可变
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