分子生物学技术CRISPR课件.pptx

1、CRISPR/Cas介导的基因组定点编辑编辑技术2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ CRISPR-associated(Cas)9基因改造系统出现，它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成，其特点是制作简单， 成本低，作用高效CRISPR研究历史1987年，日本课题组在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后的研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中2002年，科学家将其正式命名为clustered regularly

2、 interspaced short palindromic repeats(CRISPR)2005年，三个研究小组均发现CRISPR的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测其功能可能与细菌抵抗外源遗传物质入侵的免疫系统有关2007年，Barrangou等首次发现并证明细菌可能利用CRSPR系统对抵抗噬菌体入侵 2008 年 ，Marraffini等又发现细菌CRISPR系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了CRISPR系统的功能，由此科学家们揭开了研究CRISPR系统作用机制的序幕 CRISPR/Cas的基因座结构3端为CRISPR基因座，由启动子区域和众多

3、的间隔序列(spacers)和重复序列(direct repeats)顺序排列组成5端为tracrRNA基因中间为一系列Cas蛋 白 编 码 基 因 ， 包 括 Cas9, Cas1, Cas2和Csn2接近90%的古细菌和40%的细菌的基因组或是质粒中至少存在一个CRISPR基因座CRISPR中的高度可变间隔序列主要来源于噬菌体或是质粒，长度范围在21-72 bp，不同的CRISPR基因座包含的间隔序列的数量差异很大，从几个到几百个不等目前发现间隔序列数量最多的CRISPR存在于一种黏液细菌(DSM 14365)中 ，包含587个间隔序列CRISPR中的重复序列长度范围在21-48 bp，序

4、列并非严格保守，甚至在同一个细菌内的不同CRISPR基因座的重复序列也有不同，但它的5端和3端部分为保守序列，分别为GTTT/g和GAAAC 重复序列里还包含部分回文结构，转录出的RNA能形成稳定且保守的二级结构，可能在与Cas蛋白结合形成核糖核蛋白复合物的过程中发挥重要作用CRISPR/Cas的免疫机制分为相对独立的层次：第一个层次主要是对外来信息的处理和加工，形成免疫记忆，也就是新的间隔序列的获得，主要由通用的核心蛋白Cas1和Cas2参与完成；第二个层次主要为初级CRISPR RNA成熟以及识别和降解入侵的外源遗传物质 CRISPR的高度可变的间隔区(spacer)获得指外来入侵的噬菌体

5、或是质粒DNA的一小段DNA序列被整合到宿主菌的基因组，整合的位置位于CRRSPR的5端的两个重复序列之间(repeats) 噬菌体或是质粒上与间隔序列对应的序列被称为protospacer，通常protospacer的5或是3端延伸几个碱基序列很保守，被称为PAM (protospacer adjacent motifs)，它的长度一般为2-5碱基，一般与protospacer相隔1- 4碱基首先识别入侵的核酸和扫描外源DNA潜在的PAM，将临近PAM的序列作为候选protospacer;然后在CRISPR基因座的5端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间CRISPR的高度可变

6、的间隔区(spacer)获得CRISPR/Cas系统分为：Type Type Type三种不同类型Type系统的主要特征是包含一个标志性的Cas9蛋白(分子质量很大的多功能蛋白)参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA或是外源质粒Cas9蛋白包含两个功能结构域，一个在N端，有类似于Ruc核酸酶的活性，一个在中部有类似HNH核酸酶的活性 CRISPR/Cas系统编码tracrRNA(trans-activating crRNA)，其指导RNase和Cas9完成前体crRNA的成熟 随后tracrRNA还能与成熟的crRNA的重复序列配对形成RNA二聚体，进而和Cas9蛋白结合成核糖核蛋白复

7、合体，发挥识别和降解入侵的外源DNA功能Cas9 HNH结构域切割互补DNA链，而RuvC样结构域切割非互补DNA链CRISPR/Cas系统的影响因素Cas9对系统的影响 tracrRNA在DNA识别的过程中是必须的，可能是参与tracrRNA与目标DNA定向结合tracrRNA对系统的影响tracrRNA保留23-48bp的序列就能够支持Cas9催化的DNA切割crRNA5端截短10个碱基将会导致切割失败，而从3端截短10个碱基不影响切割。tracrRNA和crRNA完整性对系统的影响Protospacer准确性对系统的影响Protospaer序列越靠近3端准确性越重要PAM对系统的影响Ca

8、s9 可以识别化学合成的单链RNA发挥作用。CRISPR/Cas系统应用的前提CRISPR/Cas系统的作用特性与限制性核酸内切酶相似，它对序列的特异性切割主要依赖于crRNA与Cas蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别靶序列上的PAM 以 及protospacerCRISPR/Cas系统在基因改造中的应用三 类CRISPR/Cas系统中，Type型系统的核糖核蛋白复合物相对简单，除crRNA和tracrRNA外，只有Cas9一个蛋白 目前，产脓链球菌(SF370)的Type型系统是被改造的最为成功的人工核酸内切酶，已经在人类细胞 小鼠 斑马鱼中成功实现了基因组定点修饰发现tracrRNA对靶点的识

9、别和切割是必需的，tracrRNA的5端与成熟的crRNA 3端有部分序列(约13 bp)能够配对进而形成茎环结构，对维持crRNA与靶点的配对可能十分重要 根据tracrRNA与crRNA的结构特性，他们tracrRNA和crRNA表达为一条嵌合的向导RNA (guide RNA，gRNA)，并在体外证明gRNA可以发挥tracrRNA和crRNA的功能哺乳动物细胞中实验SpRNase III不是必须的切割产生多种微缺失插入突变两个基因同时切割CRISPR/Cas 系统可以介导一个基因的多重编辑哺乳动物ES细胞中实验基因敲除小鼠的获得双基因敲除小鼠的获得NHEJ-介导的基因突变产生不同的不可预测的插入或缺失突变单体精确突变小鼠的获得共转染Cas9 mRNA, sgRNAs, and single-stranded DNA oligos进入同一个ES细胞能精确的同源指导修复homology directed repair (HDR)-介导的基因编辑