层析分离技术课件.pptx

1、层析分离技术层析分离技术4 4 层析分离技术层析分离技术概述概述吸附层析吸附层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析离子交换层析离子交换层析亲和层析亲和层析反相层析反相层析疏水作用层析疏水作用层析4.1 4.1 概述概述层析，又称色谱（层析，又称色谱（chromatographychromatography），是一类分离分），是一类分离分析方法，利用混合物中各组分析方法，利用混合物中各组分理化性质（分子大小、理化性质（分子大小、吸附性质、电荷、极性、生物学亲和力等）的差异吸附性质、电荷、极性、生物学亲和力等）的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相，因而随使各组分以不同程度分布在固定相和流动相，因而

2、随流动相移动速度存在差异而得以相互分离。流动相移动速度存在差异而得以相互分离。特点：分离效率高，能分离性质极其类似的物质；既特点：分离效率高，能分离性质极其类似的物质；既可用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分可用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离制备。离制备。4.1.1 4.1.1 基本概念基本概念固定相固定相 是层析的基质，可以是固体物质（如吸附剂，是层析的基质，可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在滤纸、硅胶或纤维素上的溶液），这些基固定在滤纸、硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物

3、进行可逆的吸附，溶解，质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用，交换等作用，对层析的效果起关键的作用对层析的效果起关键的作用。（二）金属的物理性质:常温下，单质都是固体，汞(Hg)除外；大多数金属呈银白色，有金属光泽，但金(Au)色，铜(Cu)色，铋(Bi) 色，铅(Pb) 色。 黄 红 微红 蓝白 不同金属熔点、硬度差别较大； 良好的导电性，分析原因：金属中存在着大量的可自由移动的电子。 良好的导热性，分析原因：通过自由电子和金属阳离子的相互碰撞传递热量。 良好的延展性。金铂 金属单质在化学反应中只作还原剂，在化合物中金属元素只显正价。（二）、金属的物理性质（二）、金属的物理性质

4、合金：合金：概念：概念：两种或两种以上的金属（或金属与非金属）熔合而两种或两种以上的金属（或金属与非金属）熔合而成的具有金属特性的物质。成的具有金属特性的物质。性质：性质：具备金属特性具备金属特性(光泽、热电良导体、延展性等光泽、热电良导体、延展性等)。熔沸点一般低于组分单质；熔沸点一般低于组分单质； 硬度一般比组分单质大。硬度一般比组分单质大。 （三）、金属的化学性质（三）、金属的化学性质 金属原子易失去价电子成为阳离子，因而表现出金属原子易失去价电子成为阳离子，因而表现出较强的还原性。由于不同的金属原子结构、原子较强的还原性。由于不同的金属原子结构、原子半径的不同，表现的还原性也有强弱不同

5、。半径的不同，表现的还原性也有强弱不同。(1)与与O2反应反应K Ca Na Mg Al Zn Fe Sn Pb（H） Cu Hg Ag Pt Au常温迅速常温迅速 成膜加热成膜加热 加热能反应加热能反应 不反不反应应(2)与与H2O反应反应 K Ca Na Mg Al Zn Fe Sn Pb 条件：条件：冷水剧烈冷水剧烈 热水缓慢热水缓慢 水蒸气高温水蒸气高温 不反不反应应产物：产物： 氢氧化物和氢气氢氧化物和氢气 氧化物和氢气氧化物和氢气(3)与酸反应与酸反应K Ca Na Mg Al Zn Fe Sn Pb Cu Hg Ag Pt Au 常温下与非氧化性酸反应常温下与非氧化性酸反应 氧化

6、性酸氧化性酸 王水王水(4)置换反应置换反应(5)特例：特例：2Al+2NaOH+2H2O=2NaAlO2+3H2金属活动性顺序的应用金属活动性顺序的应用K Ca Na Mg Al Mn Zn Fe Ni Sn Pb H Cu Hg Ag Pt Au判断金属的活动性顺序。判断金属与酸溶液反应的激烈程度等情况。判断金属单质还原性强弱。判断金属低价阳离子的氧化性强弱。判断金属金属性的强弱顺序。判断原电池的正负极。判断和水、氧气反应条件以及产物。判断相同浓度相同阴离子溶液的酸碱性强弱顺序。判断电解时阳离子和金属电极的放电顺序。判断金属单质的制备方法。一、碱金属和碱土金属的概述一、碱金属和碱土金属的概

7、述 二、碱金属和碱土金属的性质与用途二、碱金属和碱土金属的性质与用途三、碱金属和碱土金属的氧化物、氢氧三、碱金属和碱土金属的氧化物、氢氧 化物及盐类化物及盐类 第二节第二节 碱金属和碱土金属碱金属和碱土金属一、碱金属和碱土金属的概述 IA IIA Li Be Na Mg K Ca Rb Sr Cs Ba原子半径减小金属性、还原性减弱电离能、电负性增大原子半径增大金属性、还原性增强电离能、电负性减小价层电子构型：IA、IIA，21nsns 、均以矿物形式存在:钠长石: 钾长石:光卤石:明矾石:锂辉石:绿柱石:菱镁矿:石膏:萤石天青石:重晶石:大理石:83OAlSiNa83OAlSiKO6HMgC

8、lKCl22O3H)(SOK(AlO)224323)LiAl(SiO6323)(SiOAlBe3MgCOO2HCaSO243CaCO2CaF4SrSO4BaSO元素的存在流动相流动相 指在层析过程中，推动固定相上待分离的物质指在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等。朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的层剂。它也是层析分离中的重要影响因素重要影响因素之一。之一。迁移率迁移率R Rf f 指在一定条件下，在相同的时间内某一组分在指在一定条件下，在相同

9、的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。迁移率的差异程度往往是决定几种物质比值。迁移率的差异程度往往是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。采用层析方法能否分离的先决条件。 分辨率分辨率 RsRs 是用来描述两种物质之是用来描述两种物质之间分离效果的好坏参数，间分离效果的好坏参数，其定义是两个洗脱峰峰其定义是两个洗脱峰峰顶对映的洗脱体积之差顶对映的洗脱体积之差比上两峰在基线上峰宽比上两峰在基线上峰宽的和的平均值。的和的平均值。主体分离主体分离基线分离基线分离不同不同RsRs下的分离效果下的分离效果4.1.2 4.1.2 层析

10、法的分类层析法的分类根据固定相基质的形式分类根据固定相基质的形式分类 分为纸层析、薄层层析和柱层析。分为纸层析、薄层层析和柱层析。 根据流动相的形式分类根据流动相的形式分类 分为液相层析和气相层析。分为液相层析和气相层析。 根据分离的原理不同分类根据分离的原理不同分类 分为吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作分为吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作用层析、反相层析、亲和层析等。用层析、反相层析、亲和层析等。4.2 4.2 吸附层析吸附层析吸附层析（吸附层析（Adsorption Chromatography Adsorption Chromatography ）是以吸附剂）是以

11、吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术。达到分离目的的一种层析技术。按吸附剂和吸附物之间的作用力不同，吸附可分为三按吸附剂和吸附物之间的作用力不同，吸附可分为三种类型：种类型：u物理吸附：范德华力，吸附解吸速度快，选择性较差物理吸附：范德华力，吸附解吸速度快，选择性较差u化学吸附：生成化学键，达到平衡慢，选择性较好化学吸附：生成化学键，达到平衡慢，选择性较好u交换吸附：极性分子或离子之间发生交换吸附交换吸附：极性分子或离子之间发生交换吸附.常用吸附剂按其化学结构可分两类常用吸附剂按其化学结构可分两类u有机吸附

12、剂，如：活性炭、纤维素、大孔吸附有机吸附剂，如：活性炭、纤维素、大孔吸附树脂、聚酰胺等树脂、聚酰胺等u无机吸附剂，如：硅胶、氧化铝、硅酸镁、硅无机吸附剂，如：硅胶、氧化铝、硅酸镁、硅藻土、羟基磷灰石等藻土、羟基磷灰石等常用吸附剂简介常用吸附剂简介硅胶硅胶是一种极性吸附剂，又是一种弱酸性阳离子交换是一种极性吸附剂，又是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，遇较强碱性化合物，则可因离子交换反应而吸附遇较强碱性化合物，则可因离子交换反应而吸附碱性化合物；碱性化合物；应用于萜类、固醇、生物碱、酸性化合物、磷脂、应用于萜类、固醇、生物碱、

13、酸性化合物、磷脂、脂肪、氨基酸等的吸附分离。脂肪、氨基酸等的吸附分离。氧化铝氧化铝对于分离一些碱性中草药成分，如生物碱类颇为理想；对于分离一些碱性中草药成分，如生物碱类颇为理想；用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝，不仅可中和含有的碱用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝，不仅可中和含有的碱性杂质，并可使颗粒表面带有阴离子，具离子交换剂性杂质，并可使颗粒表面带有阴离子，具离子交换剂的性质，适合于酸性成分的层析，这种氧化铝称为酸的性质，适合于酸性成分的层析，这种氧化铝称为酸性氧化铝；性氧化铝；经不同的处理还可得到中性氧化铝或碱性氧化铝，它经不同的处理还可得到中性氧化铝或碱性氧化铝，它们分别适用于不同物质的分离。们分别

14、适用于不同物质的分离。活性炭活性炭是使用较多的一种非极性吸附剂。一般选用颗粒活性是使用较多的一种非极性吸附剂。一般选用颗粒活性炭，主要用于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类及某炭，主要用于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类及某些甙。些甙。活性炭的吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中活性炭的吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则较低。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。则较低。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。羟基磷灰石羟基磷灰石（hydroxyapatitehydroxyapatite, HA, HA） HAHA材料特点材料特点 羟基磷灰石的晶体结构羟基磷灰石的晶体结构 多孔球形羟基磷灰石颗

15、粒多孔球形羟基磷灰石颗粒 HAHA的吸附机理的吸附机理 HA HA机理的主要观点是：机理的主要观点是：HAHA的的CaCa2+2+和生物分子表和生物分子表面的负电荷基团的结合，对生物分子的分离起重面的负电荷基团的结合，对生物分子的分离起重要作用；而要作用；而HAHA的磷酸基团与生物分子表面的正的磷酸基团与生物分子表面的正电荷基团的结合，则起次要作用。电荷基团的结合，则起次要作用。 大孔吸附树脂大孔吸附树脂特点特点u大孔型颗粒，其孔隙、骨架结构和极性可按需要选大孔型颗粒，其孔隙、骨架结构和极性可按需要选不同的原料和合成条件而改变；不同的原料和合成条件而改变；u借助范德华力吸附有机物质，不受无机盐

16、干扰；借助范德华力吸附有机物质，不受无机盐干扰；u解吸容易、机械强度好、可反复使用。解吸容易、机械强度好、可反复使用。应用：适用于对水中溶解度不大而较易溶于有机溶剂应用：适用于对水中溶解度不大而较易溶于有机溶剂的活性物质提取分离，如维生素的活性物质提取分离，如维生素B12B12、四环素、土霉、四环素、土霉素等，还可用于污水处理、糖浆脱色等。素等，还可用于污水处理、糖浆脱色等。大孔吸附树脂的选择和使用大孔吸附树脂的选择和使用选择依据：选择依据：吸附剂及吸附物的极性吸附剂及吸附物的极性 一般来说，非极性吸附剂易从极性溶剂中吸附非极性一般来说，非极性吸附剂易从极性溶剂中吸附非极性物质；极性吸附剂易从

17、非极性溶剂中吸附极性物质；物质；极性吸附剂易从非极性溶剂中吸附极性物质；中等极性的吸附剂对上述两种情况都具有吸附能力。中等极性的吸附剂对上述两种情况都具有吸附能力。吸附物质的大小吸附物质的大小 吸附物分子较大的，应选择大孔树脂中孔径大的。吸附物分子较大的，应选择大孔树脂中孔径大的。吸附层析的分离效果，决定于吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、吸附剂、溶剂、被分离化合物的性质及吸附条件溶剂、被分离化合物的性质及吸附条件等因素。等因素。 吸附剂的性质吸附剂的性质吸附剂的比表面积、颗粒度、孔径、极性对吸附的吸附剂的比表面积、颗粒度、孔径、极性对吸附的影响很大。影响很大。比表面积越大，空隙度越高，吸附容

18、量越大；而颗比表面积越大，空隙度越高，吸附容量越大；而颗粒度越小，吸附速度就越快。粒度越小，吸附速度就越快。一般要吸附相对分子量大的，要选择孔径大的吸附一般要吸附相对分子量大的，要选择孔径大的吸附剂；吸附相对分子量小的则选择比表面积高及孔径剂；吸附相对分子量小的则选择比表面积高及孔径小的。小的。极性吸附剂层析时，当被分离物质为弱极性物质，极性吸附剂层析时，当被分离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂；被分离物质为强极一般选用弱极性溶剂为洗脱剂；被分离物质为强极性成分，则须选用极性溶剂为洗脱剂。性成分，则须选用极性溶剂为洗脱剂。而对非极性吸附剂，如活性炭，则正好与上述顺序而对非极性吸附剂

19、，如活性炭，则正好与上述顺序相反相反 。 洗脱剂（溶剂）洗脱剂（溶剂） 被分离物质的性质被分离物质的性质 在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分的分离情况，直接与被分离物质的结构与性质的分离情况，直接与被分离物质的结构与性质有关。有关。吸附条件吸附条件温度：吸附一般是放热的，升高温度会使吸附量降低；温度：吸附一般是放热的，升高温度会使吸附量降低；蛋白质或酶类的吸附却往往是吸热的，升高温度会使吸蛋白质或酶类的吸附却往往是吸热的，升高温度会使吸附量提高，但需注意热稳定性。附量提高，但需注意热稳定性。pHpH：溶液的：溶液的pHpH往往会影响吸附剂或吸附物的

20、解离情况，往往会影响吸附剂或吸附物的解离情况，进而影响吸附量，一般需通过具体实验来确定。进而影响吸附量，一般需通过具体实验来确定。盐的浓度：影响比较复杂，对不同物质不同，需要考察盐的浓度：影响比较复杂，对不同物质不同，需要考察后确定。后确定。4.3 4.3 凝胶过滤层析凝胶过滤层析概述概述凝胶过滤层析基本理论凝胶过滤层析基本理论凝胶过滤介质凝胶过滤介质凝胶过滤层析实验技术凝胶过滤层析实验技术应用举例应用举例4.3.1 4.3.1 概述概述凝胶过滤层析凝胶过滤层析 gel filtration chromatographygel filtration chromatography 亦称分子筛层析

21、亦称分子筛层析 molecular sieve chromatography molecular sieve chromatography 凝胶渗透层析凝胶渗透层析 gel permeation chromatographygel permeation chromatography 分子排阻层析分子排阻层析 molecular exclusion chromatographymolecular exclusion chromatography是利用具网状结构的凝胶的分子筛作用，据被分是利用具网状结构的凝胶的分子筛作用，据被分离物的分子大小不同来进行分离离物的分子大小不同来进行分离优点优点u分离

22、条件温和分离条件温和u样品回收率高样品回收率高u实验的重复性高实验的重复性高u操作时间短，设备简便经济操作时间短，设备简便经济4.3.2 4.3.2 凝胶过滤层析基本理论凝胶过滤层析基本理论4.3.2.1 4.3.2.1 凝胶过滤层析基本原理凝胶过滤层析基本原理凝胶颗粒具三维网状结构，可对大小不同的分子凝胶颗粒具三维网状结构，可对大小不同的分子流动产生不同的阻滞作用流动产生不同的阻滞作用 颗粒粒径几十到几百颗粒粒径几十到几百 mm 间隙几到几十间隙几到几十 mm 孔隙的孔径孔隙的孔径nmnm级级（一般大分子也在（一般大分子也在nmnm级）级）待分离物质按分子大小分为三类待分离物质按分子大小分为

23、三类A A类：类：d dA A最大孔径，全排阻（出），凝胶对它无最大孔径，全排阻（出），凝胶对它无阻滞，最早流出；阻滞，最早流出；C C类：类：d dC C最小孔径，能进入全部孔隙区，阻滞最最小孔径，能进入全部孔隙区，阻滞最大，流速最慢，最晚流出；大，流速最慢，最晚流出；B B类：最小孔径类：最小孔径d dB B最大孔径，进入部分孔隙区，最大孔径，进入部分孔隙区，大小不同大小不同B B类分子之间阻滞不同，可以分离类分子之间阻滞不同，可以分离把把B B类分子的分离称为类分子的分离称为分级分离分级分离；把；把A A、B B、C C类分类分子间分离称为子间分离称为组别分离组别分离4.3.2.2 4.

24、3.2.2 凝胶过滤柱的有关参数凝胶过滤柱的有关参数（1 1 ）凝胶的参数）凝胶的参数排阻极限排阻极限 用用A A类分子中最小分子量表示类分子中最小分子量表示工作（分级）范围工作（分级）范围 实际是实际是B B类分子的分子量范围类分子的分子量范围 （2 2） 凝胶床凝胶床流动相流动相间隙液体间隙液体固定相固定相孔隙液体孔隙液体洗脱剂洗脱剂：往往是具有一定：往往是具有一定pHpH、盐、盐浓度的缓冲液浓度的缓冲液洗脱液洗脱液：从柱下流出的含有溶质：从柱下流出的含有溶质的洗脱剂的洗脱剂床高（床高（H H或或L L）床直径（床直径（D D）沉积表面沉积表面（床面）（床面）凝胶凝胶底板底板总床体积总床体

25、积 V Vt t由凝胶骨架体积、孔隙内液体体积和凝胶由凝胶骨架体积、孔隙内液体体积和凝胶颗粒间隙液体体积三部分组成颗粒间隙液体体积三部分组成外水体积外水体积 V V0 0：间隙液体体积：间隙液体体积内水体积内水体积 V Vi i：凝胶孔隙内液体体积：凝胶孔隙内液体体积凝胶（溶胀）体积凝胶（溶胀）体积 V VX X = V = Vt t -V -V0 0 = V = Vi i +V +Vg g凝胶骨架（干胶）体积凝胶骨架（干胶）体积V Vg g = V = VX X -V -Vi i（3 3）凝胶过滤中溶质运动的特征）凝胶过滤中溶质运动的特征洗脱体积洗脱体积V Ve e V Ve e与样品体积与

26、样品体积V VS S有关，分有关，分三种情况：三种情况： V VS S与与V Vt t相比可以忽略相比可以忽略 V VS S不能忽略不能忽略 V VS S很大洗脱曲线出现平台很大洗脱曲线出现平台凝胶过滤层析中三类分子洗脱情况凝胶过滤层析中三类分子洗脱情况组分组分A A为全排阻分子，组分为全排阻分子，组分B B为部分渗透分子，为部分渗透分子，组分组分C C为全渗透为全渗透分子分子分配系数分配系数K Kd duA A类分子类分子 K Kd d=0 =0 V Ve e = V = V0 0uC C类分子类分子 K Kd d=1 =1 V Ve e = V = Vi i + V + V0 0uB B类

27、分子类分子 0 0 K Kd d 1 1 V Ve e = V = Vi i . . K Kd d + V + V0 0)/()/(LgLgKd流动相中溶质浓度固定相中溶质浓度iedVVVK0K Kd d0 1 1 凝胶对溶质凝胶对溶质分子可能有吸附作用分子可能有吸附作用在在K Kd d的表达式中，的表达式中，V Vi i 较难测定，于是提出了有效较难测定，于是提出了有效分配系数分配系数K KavavxeavVVVK0gitxVVVVV0溶质分子量与溶质分子量与K Kd d的关系选择性曲线的关系选择性曲线 在分级范围内，在分级范围内， 不同凝胶不同凝胶b, cb, c值不同值不同10Kdlog

28、 MC B A 工作范围（分级范围）工作范围（分级范围）cMbKdlogK Kavav-log M-log M曲线及曲线及V Ve e/ V/ V0 0- -log M, log M, V Ve e-log M -log M 曲线称曲线称为相对洗脱曲线为相对洗脱曲线4.3.3 4.3.3 凝胶过滤介质凝胶过滤介质GelGel的定义：含大量液体的具三维网状开孔弹性的定义：含大量液体的具三维网状开孔弹性结构的多聚体结构。（一般制成球状颗粒）结构的多聚体结构。（一般制成球状颗粒）层析用凝胶的要求层析用凝胶的要求: : 多孔、孔隙区大，多孔、孔隙区大，V Vi i 要大要大 亲水亲水 惰性惰性 稳定稳

29、定 层析性能好层析性能好4.3.3.1 4.3.3.1 交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（SephadexSephadex）骨架：葡聚糖（骨架：葡聚糖（dextrandextran）主链：主链：-1,6-1,6-糖苷键糖苷键 （约（约95%95%）分支：分支：-1,3-1,3-糖苷键（约糖苷键（约5%5%）交联剂：环氧氯丙烷以醚键交联交联剂：环氧氯丙烷以醚键交联 * *控制葡聚糖与交联剂比例可制造不同孔径凝胶控制葡聚糖与交联剂比例可制造不同孔径凝胶 G-XG-X可表示型号，可表示型号，X X从从1020010200 （其数字表示（其数字表示10g10g干胶的吸水量干胶的吸水量mlml）Sepha

30、dexSephadex的局部结构的局部结构 环氧氯丙烷环氧氯丙烷SephadexSephadex G G系列凝胶的类型和部分性质系列凝胶的类型和部分性质 Sephadex型号水化颗粒直径m得水值ml/g干胶床体积ml/g干胶分级范围pH稳定范围葡聚糖球状蛋白G-10551661.00.12371027102213G-15601811.50.22.53.51.5103 0.02I 0.02Bio-Gel PBio-Gel P系列凝胶的类型和部分性质系列凝胶的类型和部分性质Bio-Gel P型号规格水化颗粒直径m得水值ml/g干胶床体积ml/g干胶分级范围流速cm/hBio-Gel P-2细459

31、01.5311021.8103510特细4510Bio-Gel P-4中901802.44810241031520细45901015特细4510Bio-Gel P-6中901803.76.5110361031520细45901015特细45 0.05I 0.05Sephacryl HR型号水化颗粒直径m分级范围pH稳定范围(长程)pH稳定范围(短程)球状蛋白葡聚糖DNA排阻限S-100 HR257511031105311213S-200 HR257551032.510511038104118311213S-300 HR257511041.510621034105118311213S-400 H

32、R25752104810611042106271311213S-500 HR2575410421071078311213SephacrylSephacryl HR HR系列凝胶的类型和部分性质系列凝胶的类型和部分性质 Pressure drop as a function of flow rate for Pressure drop as a function of flow rate for SephacrylSephacryl HR. HR.Selectivity curves for Selectivity curves for SephacrylSephacryl HR in phos

33、phate buffer HR in phosphate buffer (0.05 M, pH 7.0) containing (0.05 M, pH 7.0) containing NaClNaCl (0.15 M). (0.15 M).（2 2）SuperdexSuperdex系列凝胶系列凝胶是由安玛西亚公司开发的一类新型凝胶过滤介质，是由安玛西亚公司开发的一类新型凝胶过滤介质，是目前分辨率和选择性最高的凝胶介质之一是目前分辨率和选择性最高的凝胶介质之一SuperdexSuperdex是将葡聚糖与高度交联的琼脂糖颗粒共是将葡聚糖与高度交联的琼脂糖颗粒共价结合而形成的，属于复合型凝胶价结合而

34、形成的，属于复合型凝胶在该凝胶的结构中，在该凝胶的结构中，琼脂糖基质决定了凝胶具有琼脂糖基质决定了凝胶具有高度的理化稳定性，而葡聚糖链决定了凝胶的层高度的理化稳定性，而葡聚糖链决定了凝胶的层析特性析特性Structure of Structure of SuperdexSuperdex. . DextranDextran chains are covalently chains are covalently linked to a highly cross-linked linked to a highly cross-linked agaroseagarose matrix. matrix.

35、SuperdexSuperdex凝胶颗粒很小，且大小均匀，柱效非常高，凝胶颗粒很小，且大小均匀，柱效非常高，即使运行在很高的流速下仍能获得非常高的分辨率；即使运行在很高的流速下仍能获得非常高的分辨率；物理稳定性良好，物理稳定性良好，pH7pH7条件下能够承受高压灭菌；条件下能够承受高压灭菌； pHpH稳定性良好，清洗时（短程）可以暴露在极端稳定性良好，清洗时（短程）可以暴露在极端pHpH（1 11414）下而不会对层析行为产生影响；）下而不会对层析行为产生影响；凝胶的分离行为不受去污剂如凝胶的分离行为不受去污剂如1%SDS1%SDS，促溶盐类，变，促溶盐类，变性剂如性剂如8mol/L8mol/

36、L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍的影响。该介质同样盐酸胍的影响。该介质同样能在有机溶剂中使用。能在有机溶剂中使用。Superdex型号颗粒直径m分级范围pH稳定范围(长程)pH稳定范围(短程)流速cm/h球状蛋白葡聚糖Superdex peptide111511027103312114100Superdex 30 prep grade2444104312114100Superdex 75 prep grade24443103710451023104312114100Superdex 7511153103710451023104312114100Superdex 200 prep g

37、rade24441104610511031105312114100Superdex 20011151104610511031105312114100SuperdexSuperdex系列凝胶的类型和部分性质系列凝胶的类型和部分性质 Selectivity curves for Superdex.Selectivity curves for Superdex.（3 3）UltroGelUltroGel AcAAcA系列凝胶系列凝胶 ReactifsReactifs IBF IBF公司开发，为公司开发，为琼脂糖和聚丙烯酰胺混合琼脂糖和聚丙烯酰胺混合型型凝胶介质，由于聚丙烯酰胺的机械强度优于琼脂糖，凝

38、胶介质，由于聚丙烯酰胺的机械强度优于琼脂糖，因此该系列凝胶介质在机械和理化稳定性上强于普通因此该系列凝胶介质在机械和理化稳定性上强于普通的琼脂糖凝胶。的琼脂糖凝胶。根据琼脂糖及聚丙烯酰胺的含量不同，根据琼脂糖及聚丙烯酰胺的含量不同，UltroGelUltroGel AcAAcA系列凝胶有几种具有不同分级范围的型号，系列凝胶有几种具有不同分级范围的型号，UltroGelUltroGel AcAAcA后面两个数字分别表示聚丙烯酰胺和琼脂糖的含后面两个数字分别表示聚丙烯酰胺和琼脂糖的含量，数字越大，凝胶网孔越小，分级范围越低；数字量，数字越大，凝胶网孔越小，分级范围越低；数字越小，凝胶网孔越大，分级

39、范围越高。越小，凝胶网孔越大，分级范围越高。UltroGelUltroGel AcA22 1 AcA22 110105 51.21.210106 6UltroGelUltroGel AcA34 2 AcA34 210104 43.53.510105 5UltroGelUltroGel AcA44 1 AcA44 110104 41.31.310105 5UltroGelUltroGel AcA54 5 AcA54 510103 37 710104 4其他类型的凝胶其他类型的凝胶 4.3.4 4.3.4 凝胶过滤层析实验技术凝胶过滤层析实验技术4.3.4.1 4.3.4.1 应用目的应用目的分离

40、分离u组别分离：组别分离：A A类与类与B B类、类、B B类与类与C C类、类、A A类与类与C C类类u分级分离：分级分离：B B类分子间的分离类分子间的分离 关键在于选择合适的凝胶，好的操作方法关键在于选择合适的凝胶，好的操作方法分子量测定分子量测定 需先作标准曲线，常用需先作标准曲线，常用V Ve e-log M-log M 标准品的选择要考虑分子形状标准品的选择要考虑分子形状4.3.4.2 4.3.4.2 实验设计要点实验设计要点（1 1）目标）目标高分辨率高分辨率 RsRs应大于应大于1.2 1.2 （减小（减小WW，增大增大Y Y）2/ )(2112bbeeWWVVRsVe1Ve

41、2主体分离主体分离基线分离基线分离回收率高（减少峰宽，可提高回收率）回收率高（减少峰宽，可提高回收率）减少稀释（避免以下几种情况）减少稀释（避免以下几种情况） . . 涡流扩散涡流扩散 （通道不均匀）（通道不均匀） . . 动定相不平衡（速度过快）动定相不平衡（速度过快） . . 纵向分子扩散纵向分子扩散 （速度过慢）（速度过慢）时间短时间短 尽可能缩短时间，尤其是活性物质的分离尽可能缩短时间，尤其是活性物质的分离（2 2）凝胶的选择）凝胶的选择类型类型. .组别分离组别分离 A:CA:C效果最好，其次效果最好，其次A:BA:B，尽可能不选，尽可能不选B:CB:C. .分级分离分级分离 已知目

42、的物的已知目的物的MWMW 原则：选斜率大即原则：选斜率大即K Kd d差异大，效果好；差异大，效果好； 选排阻极限低的凝胶，可早些洗出。选排阻极限低的凝胶，可早些洗出。 未知目的物的未知目的物的MWMW 先用中等工作范围的，再据结果进行选择。先用中等工作范围的，再据结果进行选择。粒度（颗粒直径）粒度（颗粒直径） 粗粗 中中 细细 超细超细 100100300 50300 50150 70150 7080 1080 1040 40 mm Rs 1 / d Rs 1 / d粒粒 但但 RsRs增加，流速下降增加，流速下降层析介质粒径（3 3）样品的准备）样品的准备澄清，不含颗粒状物质（离心或澄清

43、，不含颗粒状物质（离心或过滤除去不溶物）过滤除去不溶物）浓度浓度 需综合考虑需综合考虑VsVs、样品溶解度、粘、样品溶解度、粘度等因素，如度等因素，如PrPr浓度浓度70mg/ml70mg/ml，一般一般101020mg/ml20mg/ml粘度增大对粘度增大对RsRs的影响的影响Elution diagrams obtained when hemoglobin and NaCl were separated. Experimental conditions were identical except that the viscosities were altered by the additi

44、on of increasing amounts of dextran.I (I (离子强度离子强度) ) I I可用中性盐调节（可用中性盐调节（KClKCl、NaClNaCl）样品体积样品体积Vs Vs 主要影响稀释度及主要影响稀释度及RsRs 综合考虑种种因素：综合考虑种种因素： 分级分离时，分级分离时，VsVs一般选一般选1 13% Vt3% Vt 组别分离时，组别分离时，VsVs可选可选30% Vt30% Vt，最好，最好151520%20%（4 4）层析柱的选择）层析柱的选择Vt Vt 据样品量确定据样品量确定 分级分离：分级分离：Vt = 30Vt = 30100 Vs100 Vs

45、 组别分离：组别分离：VtVt = 3 = 36 Vs 6 Vs H/DH/D 需考虑分辨率需考虑分辨率R RS S、稀释度、流速等因素、稀释度、流速等因素 分级分离：分级分离：H/DH/D可选择在可选择在3030100 100 ； 组别分离：组别分离：H/D H/D 相对可低些。相对可低些。材料与结构材料与结构 . . 材料材料 玻璃或有机玻璃，耐压抗溶剂且内径一致。玻璃或有机玻璃，耐压抗溶剂且内径一致。 . . 结构结构 底板不易堵塞且耐压，死体积底板不易堵塞且耐压，死体积0.1% Vt0.1% Vt（5 5）洗脱剂的选择）洗脱剂的选择根据凝胶和溶质的要求来选择根据凝胶和溶质的要求来选择

46、洗脱剂应与平衡液一致，以免体积变化；洗脱剂应与平衡液一致，以免体积变化； 吸附较强的，调节吸附较强的，调节pHpH和离子强度；和离子强度；需冷冻干燥的，选挥发性盐类；需冷冻干燥的，选挥发性盐类；对脱盐操作，有时可选用蒸馏水。对脱盐操作，有时可选用蒸馏水。（6 6）流速的选择）流速的选择分为线性流速分为线性流速(cm/h)(cm/h)和体积流速和体积流速(ml/min)(ml/min)流速过大，动定相不平衡；流速过小，纵向扩散增加；流速过大，动定相不平衡；流速过小，纵向扩散增加；凝胶介质有建议流速和最大流速凝胶介质有建议流速和最大流速对硬胶对硬胶SephadexSephadex G-10 G-1

47、0、G-25G-25、G-50G-50 存在关系：存在关系： v = k P / Lv = k P / L对软胶对软胶SephadexSephadex G-75 G-75G-200G-200 流速与柱径有关，并在一定操作压下有最大流速，一流速与柱径有关，并在一定操作压下有最大流速，一般可查表般可查表4.3.4.3 4.3.4.3 操作要点操作要点（1 1）凝胶的准备）凝胶的准备凝胶溶胀凝胶溶胀一般商品湿胶一般商品湿胶 洗脱剂（洗脱剂（v/vv/v）=31=31的比例添加洗脱剂，的比例添加洗脱剂，搅匀后即可装柱搅匀后即可装柱 干胶用量干胶用量(g)(g)rr2 2h/h/膨胀度（床体积膨胀度（床

48、体积ml/gml/g干胶）干胶） r r和和h h分别为层析柱的半径和高度，单位均为分别为层析柱的半径和高度，单位均为cmcm，膨胀，膨胀度的数据可查凝胶商品参数度的数据可查凝胶商品参数干胶溶胀方法干胶溶胀方法 加蒸馏水室温下进行或沸水浴下进行。加蒸馏水室温下进行或沸水浴下进行。倾析倾析 用此法除去上部过细部用此法除去上部过细部分（破损凝胶）分（破损凝胶）稠度稠度 一般控制沉积体积为总一般控制沉积体积为总体积体积707075%75%脱气脱气（2 2）仪器准备）仪器准备泵泵检测检测记录记录计量计量柱柱分部收集器分部收集器（3 3）装柱）装柱要求：均匀、无裂缝、无气泡、床面平整要求：均匀、无裂缝、

49、无气泡、床面平整一般步骤：一般步骤： 固定柱固定柱 充填充填 平衡平衡 检验检验 * *对于软胶，装柱前须先校对操作压力！对于软胶，装柱前须先校对操作压力！（4 4）加样）加样要求：不能干扰凝胶床表面要求：不能干扰凝胶床表面方法：排干法、液面下加样法、加样器法方法：排干法、液面下加样法、加样器法加样量的选择加样量的选择（5 5）洗脱）洗脱流速控制流速控制 v vP P、H H、D D、t t、粘度、粘度、d d粒粒、充填方式、充填方式收集收集 自动分部收集（可计时也可计滴）自动分部收集（可计时也可计滴）检测检测 紫外连续检测，其他检测器紫外连续检测，其他检测器（6 6）清洗和贮藏）清洗和贮藏凝

50、胶柱的清洗一般用洗脱液继续平衡即可，若被脂肪凝胶柱的清洗一般用洗脱液继续平衡即可，若被脂肪污染，可用污染，可用0.10.10.5mol/L 0.5mol/L NaOHNaOH（除（除SepharoseSepharose）或）或非离子表面活性剂清洗。非离子表面活性剂清洗。贮藏须加化学试剂防腐，常用抑菌剂包括：贮藏须加化学试剂防腐，常用抑菌剂包括：0.002%0.002%的的双氯苯双胍己烷（洗必太），双氯苯双胍己烷（洗必太），20%20%乙醇，乙醇，0.0010.0010.01%0.01%的苯基汞盐，的苯基汞盐，0.020.020.05%0.05%的叠氮钠，的叠氮钠，0.01mol/L0.01mo