体积排阻色谱和光散射技术SECMALS专题培训课课件.ppt

1、 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved102-102-1体积排阻色谱体积排阻色谱和光散射技术和光散射技术SEC-SEC-MALSMALS Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved2主要内容主要内容 SEC技术与SEC-MALS技术 仪器参数确定 小 结 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved3多角度光散射法：多角度光散射法：两种测定模式两种测定模式 2scattereddcdnMcI 单机模式

2、单机模式 (Batch mode) Mw (weight-averaged molar mass)，Rz (z-averaged RMS radius) ， A2 无法测定：样品多分散性系数（ PDI ）； 联机模式联机模式 (Online mode, flow mode) Molar Mass，RMS ，Distributions，PDI； Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved4 SEC = Size Exclusion Chromatography（体积排阻色谱） Size Exclusion Chromatograph

3、y (SEC) ：基于高分子分子尺寸大小不同而分离的色谱法。（分子尺寸大小：hydrodynamic volume.） MALS = Multi-Angle Light Scattering（多角度光散射） SEC-MALS: 多角度光散射与体积排阻法联用技术什么是什么是 SEC-MALS ? Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved5体积排阻色谱体积排阻色谱 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved6传统传统SEC 假设弊端假设弊端Size exclusion

4、chromatography of native and reduced, carboxymethylated RnaseAdapted from “Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions” by J. Wen, et al., Anal. Biochem. 240 155166 (1996).传统传统SEC 假设待测样与标样性质相假设待测

5、样与标样性质相似：似：构象相似；密度相似；与柱填料无任何相互作用。 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved7高分子表征的需要高分子表征的需要BSALSRIMwDextranLSRIMw多分散性样品多分散性样品: Mn, Mw, Mz, PDI (Mw/Mn)单分散性样品单分散性样品: 检测，识别聚集体以及各组分的数量。检测，识别聚集体以及各组分的数量。 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved8典型光散射与色谱联用配置典型光散射与色谱联用配置 Wyatt Tec

6、hnology Corporation 2014 All Rights Reserved9 对于水相体系，建议使用0.1 m 对流动相过滤；而对于有机相体系，建议使用0.2 m 对流动相过滤； 使用在线脱气装置（In-line degasser）； 添加在线过滤器（ In-line membrane filter ）： 水相体系：PEEK 材质在线过滤器；有机相体系：不锈钢材质在线过滤器； 逐步增加或降低流速，切不可大幅度调整流速；SEC - MALS 测定法几点建议测定法几点建议* 以上建议有助于延长泵、柱子的寿命（即使不使用光散射仪）。 Wyatt Technology Corporati

7、on 2014 All Rights Reserved10摩尔质量摩尔质量 - 定义定义Number average molar mass:Weight average molar mass:Z-average molar mass: 色谱洗脱曲线中，每一洗脱体积其摩尔质量由光散射仪测定。 色谱洗脱曲线中，每一洗脱体积其浓度由浓度型检测器测定。 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved11范例范例: 2 个分子 (“1-mer” 和 “9-mer”) 相对分子质量分别是1和9ass范例：摩尔质量计算范例：摩尔质量计算 Wyatt

8、 Technology Corporation 2014 All Rights Reserved12LSRI多分散性样品的摩尔质量多分散性样品的摩尔质量 Mn Mv Mw Mz Mw 直接有LS测定 良好的SEC分离效果是精确测定摩尔质量的重要前提。MzMwMpMn Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved13均方根半径均方根半径 （旋转半径）（旋转半径）Mean Square Radius: z-average mean square radius 直接由MALS测定 。 Astra 直接计算出数均、重均以及z-均方根半径。

9、Root Mean Square (rms) Radius rg: 单分子链中质量为mj链段多分散性高分子：多分散性高分子：Z-average Mean Square Radius mjrj Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved14 模板参数创建（模板参数创建（Template Generation ）: 归一化系数（Normalization coefficients）激光光电二极管检测能力差异修正 延迟体积（Alignment ）：检测器间管路体积。 宽峰校正（Band broadening）：样品稀释效应修正。 仪器系

10、统有效性确认（仪器系统有效性确认（System Validation）模板参数创建与系统有效性确认模板参数创建与系统有效性确认 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved15建立仪器参数建立仪器参数: “第一针第一针” - BSAASTRA 通过仪器配置自动识别、标记不同仪器、并存储数据。也可以支持第三方检测器如UV、RI等。LS 90UV Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved16数据分析数据分析- Baselines设定LS与浓度信号基线设定基线时，其应覆盖可

11、能的基线漂移区。 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved17数据分析数据分析 Peaks 单分散性高分子：选峰范围对结果影响很小。 多分散性高分子：选峰范围对结果影响较大。LSUV, RI Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved18 使用各向同性的高分子对（不包含90度角）不同角度光电二极管相对于90度进行归一化。 修正光电二极管灵敏度及几何形状差异。 归一化要求:各向同性散射体必须用流动相配制。同一检测池中使用。数据分析数据分析 Normalization常

12、用归一化标样常用归一化标样 水水 相相: 10,000 - 40,000 g/mol dextran, pullulan, BSA (0.02 m 过滤头) 有机相有机相: 10,000 - 40,000 g/mol polystyrene 或 PMMA Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved19光散射信号叠加图光散射信号叠加图（ Overlay plots ）归一化后，光散射信号叠加图归一化后，光散射信号叠加图可以评价归一化效果：可以评价归一化效果： 归一化效果； 是否存在杂散光（Stray light）； 流通池污染，池窗

13、污染等。 Baseline 设定是否合理。 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved20修正LS与浓度型检测器之间管路体积 。 只有单分散性样品才能使用只有单分散性样品才能使用Alignment数据分析数据分析: AlignmentUVLSRI Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved21为什么使用单分散性样品修正为什么使用单分散性样品修正?Alignment & Band Broadening 修正修正单分散性样品LS & RI 信号重合 Wyatt Techn

14、ology Corporation 2014 All Rights Reserved22Alignment & Band Broadening 修正修正 为什么不能使用多分散性样品为什么不能使用多分散性样品 ?多分散性样品多分散性样品LS & RI 不可能重合不可能重合(不能使用不能使用alignment修正修正)LSRI Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved23检测器间的宽峰效应：检测器间的宽峰效应：Band Broadening样品随流动相依次经过样品随流动相依次经过DAWN 、 RI时，导致峰变宽时，导致峰变宽宽峰效应

15、致使LS & RI 分离Mw data Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved24检测器间的宽峰效应：检测器间的宽峰效应：Band BroadeningASTRA 能修正检测器能修正检测器间的宽峰效应间的宽峰效应 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved25参数参数详细信息详细信息与与SEC 、溶、溶剂有关剂有关?与样品种与样品种类有关类有关?Calibration90 LS detector （甲苯体系）NoNoNormalization同一检测池, 同一溶剂

16、同一各性同向散射体MaybeNoDelay Volume & Band Broadening Correction相同检测池，不同检测器间管路, 单分散性样品NoNo仪器参数仪器参数 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved26 Zimm Plot ：在单机试验中，：在单机试验中，进样系列浓度不能太低。进样系列浓度不能太低。 Debye Plot ：在联机模式下，：在联机模式下，仅需要仅需要1个浓度（低浓度）。个浓度（低浓度）。 两者拟合数据的数学公式：Zimm Formalism: 其它拟合公式: Debye, Berry,

17、Random CoilZimm Plot 与与 Debye Plot Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved27 Zimm 公式的公式的 Debye Plot 拟合度为1时：高分子 rms radius 50 nm 纵坐标截距：1/Mw ； 斜率与rms radius 平方成正比。以 对 作图1/MwRrms2 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved28Zimm 公式公式Zimm 适合小到中等尺寸的高分子(RMS radii 10 nm样品* ，Mw 和 rm

18、s radius 同时可以测定； * 而半径 100 nm ）；该范围内的分子，使用Berry比Zimm拟合，其线性更好。因此，可以使用较低的拟合度。1.166 e+8 g/mol63.1 nm2nd order fit范例范例: 多糖多糖 (从肠膜明串珠菌提取从肠膜明串珠菌提取) Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved42Debye FormalismDebye 使用范围广；拟合线并非一定是直线；因此，需要设定较高的拟合度。4.514 e+7 g/mol39.4 nm2nd order fit范例范例: 多糖多糖 (从肠膜明串珠菌提取从肠膜明串珠菌提取) Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved43Random Coil Formalism范例范例: 多糖多糖 (从肠膜明串珠菌提取从肠膜明串珠菌提取)7.717 e+7 g/mol52.9 nmRandom Coil 该拟合法使用理论的形状因子P() 代替拟合多项式。该方法假设该高分子在溶液状态下呈无归线团状。