全柱成像毛细管电泳cIEF课件.ppt

1、全柱成像毛细管电泳（cIEF-WCID）:新一代毛细管电泳技术蛋白质药物快速表征的利器蛋白质药物快速表征的利器报告内容 毛细管等电聚焦（Capillary Isoelectric Focusing, cIEF）：一种根据蛋白质等电点 pI 不同而进行分离的技术。cIEF 是蛋白质等两性分子分析最有力的工具之一，是生物实验室被广泛应用的分析技术。传统的传统的 cIEF cIEF 的问题：的问题：u需移动条带u分析速度慢(40min)u分辨率下降u聚焦时间不易优化u方法开发时间长u重复性不佳CEInfinite: 全柱成像等电聚焦系统全柱成像等电聚焦系统Advanced Electrophores

2、is Solutions, LtdCambridge, Ontario, CanadaCEInfiniteCEInfinite：毛细管电泳等电聚焦毛细管电泳等电聚焦-全柱成全柱成像检测技术（像检测技术（cIEF-WCID）AES (Advanced Electrophoresis Solutions, Ltd.) 专注于全柱检测高效毛细管电泳技术（专注于全柱检测高效毛细管电泳技术（CECE）的研发）的研发 CEInfinite 将 UV 的点光源转换为线光源均匀地分布在长度为 5cm 的分离柱上，整个聚焦过程大约5-10min，聚焦过程中蛋白质在分离柱内的任何变化都能通过动态检测器（CMOS照

3、相机）得到实时的成像检测。CEInfinite (10 min)传统传统 cIEF (40 min)离子交换离子交换 (60 min)GEL IEF (400 min)CEInfinite 的优势的优势u省去移动过程，缩短分析时间省去移动过程，缩短分析时间u 快速分析（ 10 min）；u 保持cIEF的高分辨率；u 复杂蛋白质的分离和 pI 点的测定变得异常轻松；u 超高通量和出色的重复性；u 蛋白质 pI 点测定的黄金技术！CEInfinite 的优势的优势u蛋白分析过程全程可视蛋白分析过程全程可视蛋白药物的动态聚焦过程u CMOS照相技术，全程成像显示蛋 白聚焦或变化过程；u 蛋白分离方

4、法开发更简单；u 彻底颠覆了传统电泳技术在 蛋白质表征中的定义！CEInfinite 的优势的优势u快速开发蛋白分离方法快速开发蛋白分离方法u 快速 - 5-12 min 聚焦时间u 方法优化简单- Ampholytes- Urea- Focusing timeu 多种不同涂层的分离柱（FC/DB/PA），满足不同蛋白的分离需求u 涂层均匀稳定，寿命长久，分辨率高，重复性好u 多种内径：100um、180um、200um u 200um内径减少蛋白凝聚，不易发生堵塞，灵敏度更高、更快的进样速度50次进样的重复性200 m id 100 m idpH10pH3CEInfinite 的优势的优势u

5、高灵敏度的毛细管柱高灵敏度的毛细管柱u AES公司自主研发的两性电解质，共两个系列，10种pH 范围u HR 3-10、2.5-5、5-8、6-9、8-10.5，适用于一般蛋白的分离u SH 3-10、2.5-5、5-8、6-9、8-10.5，适用于复杂蛋白，如融合蛋白、ADC等u 有效成分高、低蛋白吸附、pH梯度线性好、280nm背景吸收低。Aeslyte超高的分辨率CEInfinite 的优势的优势u完善的两性电解质载体完善的两性电解质载体Aeslyte 8-10.5Servalyte 9-11u Ampholytes, cartrige coating and markers can b

6、e customizedCEInfinite 的优势的优势-相对于市面上同种类仪器相对于市面上同种类仪器CEInfinite 的优势的优势-相对于市面上同种类仪器相对于市面上同种类仪器u More stable auto-samplerCIEF of a monoclonal antibody with CEInfinite 1% HR pH 3-10 and 3% HR5-8CIEF of an antibody drug conjugate (ADC) with CEInfinite 2% HR pH 3-10 and 2% SH8-10.5CIEF of a fusion protein

7、 with SH 4-8 CIEF of hemoglobin AFSC with different pH range CAs SH pH 4-8SH pH 5.5-7CIEF of fusion protein with different pH range CAs u AES公司自主研发的pI标记物，数量多达29种，pI 范围 2.8-10.5u 小分子pI标记物，pI 标示准确、稳定性好u 每 0.5 pH单位有一对Marker, 有足够的Marker和样品峰尽量靠近，保证pI 校正的重 复性和准确性。2.8510.453.213.53.597.057.06.616.145.855.9

8、15.124.654.224.54.147.558.187.658.48.718.799.339.469.7710.17.4pI 标记物CEInfinite 的优势的优势u宽范围覆盖的宽范围覆盖的 pI pI 标记物标记物报告内容报告内容 全柱成像 cIEF 技术作为一种创新的等电聚焦方法，可以应用于蛋白质或其他两性物质等电点的测定，等电点的测定可精确至0.01个pH单位。 在生物制药厂的实验室里，全柱成像 cIEF 可应用于药物研发药物研发、细胞株筛选细胞株筛选、生产过程分析生产过程分析、药物制剂研究分析药物制剂研究分析、药物稳定性研究药物稳定性研究以及最终产品的质量质量控制分析控制分析。

9、单克隆抗体 重组蛋白 疫苗等电点测定及异质性表征：CEInfinite: 抗体药物表征的利器抗体药物表征的利器 根据蛋白质电荷特性的差异可区分鉴别蛋白，因此通过测定蛋白质的等电点，可以部分地确定蛋白质的属性。通过对所分离的不同蛋白变异株的定量，可评估其异质性。某单克隆抗体的全柱成像cIEF结果IEF条件：蛋白浓度：0.4mg/mlCA：4% HR pH 3-10 电场：600V/minUrea：4mol/L聚焦时间：5 minPeak 1Peak 2Peak 3Peak 4Peak 5Peak 6Peak 77.147.277.377.487.547.627.797.147.267.377.4

10、77.547.627.79u蛋白质 pI 测定 在生产和纯化过程中，蛋白质能表现出多种电荷异质性改变，这些变化不仅影响药物的稳定性，也影响活性，而且还可能导致有害的免疫反应。所以，开发和生产过程中蛋白药物的电荷异异构体的分析非常关键。pI45678mAbsorbance050100150200250pI 6.14pI 9.22pI 4.22pI 8.18pI5.56.06.57.07.5mAbsorbance050100pI 6.14pI 9.226.29 6.37 6.42 6.49 6.56 6.64 6.70 Charged IsomerpI (n=2)16.2726.3336.4146

11、.4856.5666.6476.73u蛋白质药物和抗体药物的电荷异质性表征pI56789Absorbance0.00.20.40.60.8pI 6.14pI 9.22Fab (Human)IgG (Human)IgG (Mouse)u药物差异化表征3 种不同的种不同的 IgG：人源与鼠源差异明显：人源与鼠源差异明显pI4.04.55.05.56.06.5mAUAbsorbance0200400600pI 6.61pI 4.226.08 6.12 6.18 6.24 6.29 HSA: 厂家厂家 1HSA: 厂家厂家 2HSA: 厂家厂家 3国内国内 3 厂家的人血清白蛋白厂家的人血清白蛋白 H

12、SAu细胞株筛选标准对照标准对照细胞株细胞株 1细胞株细胞株 2细胞株细胞株 3细胞株细胞株 4细胞株细胞株 5u蛋白质药物的稳定性研究TemperaturepI-1pI-2pI-3pI-425oC8.288.107.978.4240oC8.288.097.958.4060oC8.288.107.968.40在 25、40、65 三个Incubation 温度条件下，目标蛋白质构象保持稳定，四个电荷异构体的CIEF-WCID 电泳图没有明显差异；在25、40、65 三个Incubation 温度条件下，四个电荷异构体的pI值完全一致，说明在65oC的高温下，蛋白质没有变性，其构象稳定。 每个温

13、度下的样品重复二次分析，其重复性出色，pI 值测定的RSD1%。25oC40oC65oC1234将 Incubation 温度持续提高到 75， 研究发现其 CIEF-WCID的电泳图发生显著改变（与25-65），意味着蛋白质发生明显变性，其构象完全改变， 75为其构象改变的临界温度； 在75的温度下，与25-65相比，四个主要电荷异构体的峰消失，形成一个 “宽包”峰 （pI 范围 7.4-8.3），整体 pI 点向酸性位移；在75的温度下，整体 pI 点向酸性位移，意味着蛋白质变性，更多的酸性功能基团暴露。65oC75oCu定量分析Main PeakOtherspIArea%Area% of

14、 acid peaksArea% of basic peaks9.0858.8365.2mAbPeak NO.Peak1Peak2Peak3Peak4Peak5Peak6Peak7Peak8Peak9Peak10Peak11Peak12Peak13Area (%)1.92.35.68.013.216.618.515.910.95.41.50.20.1ADCFusion ProteinArea% of each peak7.107.217.337.437.567.687.817.938.048.218.331st4.04.16.810.513.716.116.313.79.14.11.62nd4

15、.14.36.610.314.016.116.313.89.04.01.53rd3.93.86.810.413.716.216.914.09.23.81.3RSD (%)2.56.21.70.91.30.42.11.11.13.910.4报告内容报告内容Preparative cIEFcIEF-WCID tandem MSAES独有专利技术独有专利技术在完成在完成cIEF-WCID聚焦分聚焦分离后，在移动聚焦蛋白区带离后，在移动聚焦蛋白区带的过程中，分辨率不会发生的过程中，分辨率不会发生明显的降低明显的降低AES 在生物制药和蛋白质组学研究中的重要突破在生物制药和蛋白质组学研究中的重要突破Sc

16、hematic of CEInfinite scanning imaging preparative CIEFPreparative CIEF with CEInfinite proprietary cartridges (patent pending) allows the focused peaks to be transferred into individual collection vials or ion sources of mass spectrometers (MS) for further structure based characterization. Protein

17、Peak TransferPreparative scanning imaging CIEF hemoglobin AFSC individual peak collection1. Preparative cIEF- Step A: FractionationCIEF confirmation of individual peak collection Preparative cIEF- Step B: cIEF confirmation2. cIEF-WCID tandem MS: new breakthrough for protein identification报告内容报告内容 生物

18、大分子、蛋白质-药物之间的相互作用能够直接反应其功能和活性机制。相互作用的研究在蛋白质药物和疫苗药物的研发和生产中起到非常重要作用，不仅能够阐明治病机理、药理机理，而且对于蛋白质药物的质量控制和生产工艺起到决定性的作用。CEInfinite: 抗体药物表征的利器抗体药物表征的利器Wu X Z,Huang T M. et al., Journal of Microcolumn Separation., 13, 322-326, 2001Protein ControlProtein-Compound 1Protein-Compound 2pI 7.30pI 7.26pI 7.30pI 7.32u

19、蛋白质-小分子药物1：Protein从单一峰分叉变成两个峰，很清楚的表明相互作用的产生。 此复合物的 pI 向碱性区域移动 0.02 pI单位，标志着由于相互作用，蛋白质构象发生改变，其表面负电荷被遮蔽，正电荷密度增强（推测次此小分子可能为碱性药物）。而且，所加入的小分子药物的摩尔比偏低，蛋白质没有发生完全作用（原型蛋白被部分保留)，继续加大小分子药物浓度，可能会观察到多作用靶点的存在（多个复合物的峰)；初步推测此相互作用是动态可逆过程；u 蛋白质-小分子药物2：与 Control 相比，仍然保持单一峰，但其 pI 为 7.26，向酸性区域移动0.04 pI 单位，标志着由于相互作用，蛋白质构

20、象发生改变，其表面正电荷被遮蔽，负电荷密度增强（推测次此小分子可能为酸性药物）。而且由于原型蛋白基本消失，表明蛋白质和小分子药物完全发生反应形成复合物，而且形成复合物的速度 （K值）大于其解离速度，由于复合物的峰较宽，而且存在肩峰，推测存在多靶点的相互作用，从而产生多重蛋白质-小分子药物的复合物。Protein molecule complex *Protein*pI 9.33*Calculation of Kd and kon, koff can be done with a novel method. 1.Make protein and small molecule solution i

21、n IEF solution with protein at 0.0001 M, and small molecule at 0.0001 M.2.The increase of protein peak and decrease of protein complex were observed in the E-gram. 0 S67 S134 S201 S302 SKoffCalculation method for KD1.The initial protein concentration was 0.0001 M, and small molecule at 0.0001 M. 2.T

22、he equilibrium protein concentration can be calculated 0.00009M.3.The equilibrium small molecule concentration was calculated 0.00009M.4. The Kd can be calculated to be 8.1 10-4 M, and Kb 1.2 103 M-1T h e a p p l i c a t i o n w a s cooperated with Rock Dans Group from Amgen, Seattle.CEInfinite: 研发新

23、进展研发新进展uTemperature control of the separation chamber in CEInfinite C01uCGE Cartridge development.uWhole column fluorescence detection CE instrument with CMOS sensoruHigh resolution protein fractionationuSuper narrow range carrier ampholytesuCarrier ampholytes for 214 nm detectionCEInfinite: 选择原因选择原

24、因u Data from AES can be consistent with or better than PSu The instrument costs less (at least 200K RMB, 20% less)u The cost performance of consumable item is perfect（330K RMB less）u More stable auto-sampleru Higher efficiency of operationu Ampholytes and markers can be customizedu Software can meet clients requirementu Strong R&D team (also in application)u Wide applications like MS and protein-protein interactionGlobal users of CEInfiniteThank You!