基于PCR信号放大的微量蛋白检测技术-邻位连接延课件.ppt

1、基于PCR信号放大的微量蛋白检测技术主要内容邻位连接分析技术（proximity ligation assay）邻位延伸分析技术（proximity extension assay）CytoploRare 技术一、PLA技术（邻位连接分析技术）背景：瑞典ULF Landegren 研究小组2002年提出了一种新的蛋白体外分析方法-邻位连接技术(proximity ligation assay , PLA），通过一对亲和探针对目的分子双识别，继而产生可扩增的检测信号，从而将对蛋白质的检测转变成为对DNA 的检测，实现了微量蛋白的分析。是一种研究蛋白定量、定位、相互作用、修饰以及功能的新蛋白分析技

2、术。PLA反应原理1.当识别同一抗原上的两个抗体结合到抗原，则抗体上偶联寡核苷酸序列彼此靠近。2.溶液中可以与这两个探针末端互补的连接片段的作用下，形成有一个断裂点的dsDNA片段。3.在DNA连接酶的作用下形成完整的dsDNA。4.以连接完整的DNA作为模板，进行定量PCR的检测；靶抗原的浓度与DNA模板的量成比例，进行蛋白定量转化。PLA基本过程共分为3步：孵育：孵育：样品与靶特异性抗体的一对邻位探针共孵育连接：连接：结合到同一蛋白上的邻位探针与连接片段杂交并发生邻位连接反应，形成一个环状的蛋白质一蛋白识别分子一单链DNA复合物扩增：扩增：qPCR扩增复合物中的单链DNA部分PLA类型PL

3、A可分为三种：均相（液相）、固相和原位均相（液相）、固相和原位。 均相（液相）均相（液相），待测样品、探针、荧光PCR引物以及连接试剂加入同一管中进行荧光定量PCR，适用于微量蛋白质的快速检测。 固相固相，待测蛋白预先固定于微孔板上，洗涤去除未结合分子，去除游离探针，检测含量过低的蛋白。原位原位，邻位探针与待测的2个具有相互作用的蛋白质分子分别结合，反应体系中加入的DNA短序列与探针上的DNA链互补，在连接酶的作用下形成环状DNA，RCA扩增。蛋白互作、细胞或组织内定位的PLA方法。 PLAPLA类型根据抗体类型：直接直接PLA与间接间接PLAA图直接PLA，B图间接PLA，区别在于间接法用到

4、的探针为二抗连接的亲和探针，一抗为捕获抗体。PLA技术检测蛋白的核心邻位探针邻位探针：不同的DNA单链与一对蛋白识别分子相结合形成，使其通过免疫吸附的方式结合到待测蛋白上。为什么说PLA的核心是一对邻位探针？1.DNA与蛋白结合效率低。2.通过筛选（指数富集配体系统进化技术SELEX）技术，难以得到与蛋白分子高特异性、高亲和力的核酸适体。3.核酸适体的种类有限，难以满足PLA实验要求。以上三个原因，限制了PLA的发展应用PLA探针的发展探针的发展： 核酸适体：从一个体外合成的随机寡核苷酸文库中筛选出与靶分子特异性结合的小分子DNA。缺点：盲目、过程繁琐，核酸适配体种类有限。 化学法：多功能交换

5、试剂SMPB：抗体与巯基修饰的单链DNA结合。 生物法：streptavidin与biotin高亲和力。PLA探针已经走向商业化，Solulink公司可定做抗体DNA复合探针，可直接用于PLA反应。PLA国内外研究现状国外：国外：Olink公司在PLA方面做了较多基础研究，并对PLA技术申请了专利。相关产品：Dolink（13000RMB）该技术平台于2015年12月被sigma-Aldrich公司收购，目前该产品正是该公司网站上的主推产品。国内：国内：目前处于实验室研究阶段，无相关产品从2010年到2014年邻位连接技术的文献引用次数从41次到156次，到2015年关于PLA技术的报道为55

6、篇。Olink公司PLA技术Olink公司PLA技术应用领域蛋白质互作及其修饰的检测细胞蛋白定位分析数字化定量采用荧光染色，没有复杂判读标准，极有可能取代免疫组化Olink公司PLA 检测原理蛋白In Situ （原位）检测抗体偶联亲和探针为正负链，再加入与正负链两端同时互补的寡核苷酸序列（a，b），而这两条链在探针链上存在一个断裂点，在连接酶的作用，连接成为一个环状DNA。以正链探针为引物，以环状DNA为模板，进行滚环扩增(RCA)，得到单链的串联PCR。定量方法Olink 采用了终点定量的方法，加入荧光杂交探针，在荧光显微镜下检测。PLA的应用举例1. 检测稳定、瞬时和微弱的蛋白互作（可视

7、化）Fig. 1 培养48 h的大鼠胚胎海马神经元，原位显示ER （雌激素受体）与DYX1C1在神经突触中的互作。红色：ER alpha/DYX1C1复合物；绿色：actin蛋白；蓝色：细胞核PLA的应用举例2.检测蛋白的翻译后修饰Fig. 2 EGF（表皮细胞生长因子）刺激前后，用免疫荧光染色和PLA方法检测U343细胞中EGFR磷酸化水平的变化。PLA方法可以检测到EGFR的激活，而IF方法则不能。红色：磷酸化的EGFR蛋白；蓝色：细胞核传统分析方法需要：凝胶电泳、质谱、高效液相色谱法和免疫组化结合。PLA的应用举例3.高灵敏度的检测低丰度蛋白的表达Fig. 3 分别用免疫荧光和PLA方法

8、检测A431细胞中EGFR的表达。与IF方法相比，PLA方法的信噪比高出100倍。红色：EGFR蛋白；蓝色：细胞核如果需要在天然状态下对蛋白质进行研究，必需对目的蛋白质进行过表达、标记或遗传修饰。PLA的应用举例4.数字化定量 在定量过程中，可以对细胞和组织的图像进行分析。通过细胞核的自动检测，以及细胞质大小的估算，研究者能够对组织或细胞群中的蛋白质表达水平进行单细胞统计学分析。Stadler, Charlotte, et al. (2012) Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation fo

9、r protein localization in mammalian cells. Nature. doi:10.1038/nmeth.2377二、PEA（邻位延伸技术） 邻位延伸分析技术（PEA）， 不需要额外的寡核苷酸将探针拉近连接，其两条探针末端含有5bp配对碱基，在延伸酶的作用下形成双链模板，利用qPCR进行检测，有效的避免探针的损失。PEA相关的产品国外：国外：Olink拥有该技术的相关专利，并推出了相关产品 产品品牌：Proseek Multiplex 蛋白高通量检测国内：国内：未见相关报道左图：抗体识别正确且邻位探针可以形成互补结构 中图：抗体交叉反应，但邻位探针无法形成互补结

10、构 右图：PEA反应过程，采用微流控芯片qPCR系统检测Olink公司PEA技术特点Olink 公司 PEA 特点：1.qPCR定量采用微流控芯片，实现了蛋白高通量的定量检测（96样本x96种抗体探针对）：可以同时检测96个样本，和96组引物(探针)；实现了多个指标的高通量检测。2.样本加样可实现自动化3.样本加样量少：体积1uL、血清、血浆等4.检测灵敏度 优于ELSA ，检测浓度可到达fg/mL（10-15），较宽检测线性范围（105）反应区引物（探针）孔引物（探针）孔样本孔样本孔PEA技术的应用左图：PEA 检测IL-18线性范围：0.24-31250pg/mL右图：ELISA 检测IL

11、-18 线性范围：78-5000pg/mL细胞因子IL-18的检测Olink公司基于PLA与PEA的服务Olink 公司提供下面几个方面的服务： 心血管疾病标志物物的检测 神经疾病方面标志物物的检测 肿瘤相关标志物（92种肿瘤相关蛋白）的研究服务 主要是用于科研服务，尚未发现临床试验报道三、国内基于PCR信号放大技术-CytoploRare CFDA 2016年01月11日批准了国内首个通过PCR信号放大检测肺癌循环肿瘤细胞试剂盒-CytoploRare （靶向PCR CTC）格诺思博生物科技有限公司（南通）格诺思博生物科技有限公司（南通）用途：定量检测肺癌血清中叶酸受体阳性循环肿瘤细胞，用于

12、肺癌的辅助诊断与疗效评估。CytoploRare 技术特点1. 免疫磁珠反向富集循环细胞2. 循环细胞与偶联寡核苷酸探针的叶酸分子结合；3.洗涤；4.将与细胞结合的叶酸-寡核苷酸探针从细胞上解离下来；5.含有寡核苷酸探针的洗脱液加入25uL的PCR mix 溶液中；6. 进行qPCR （Taqman 探针法），计算样本中寡核苷酸的浓度；并依据标准曲线转换为CTC units相对单位。免疫磁珠反向富集CTC检测示意图CytoploRare 用于临床上图：肺癌CTC 检测在临床应用方面，灵敏度73.2%、特异性84.1%，优于其他常用标志物。不同检测技术的比较优点优点缺点缺点PLA高灵敏度探针存在损失PEA高灵敏度探针不存在损失免疫PCR高灵敏度非特异性吸附、检测背景信号高ELISA技术平台成熟样品量大、手工操作，干扰因素多WB技术平台成熟操作复杂，难以做成商品化总结基于PCR信号放大检测方法，在检测特异性、灵敏度和线性范围都非常具有优势。采用链霉亲和素与生物素系统，二抗偶联探针，利于将PLA探针形成产业化。PCR方法的高灵敏度是一把双刃剑，可能产生较高的背景信号，这是基于PCR信号放大检测都需要考虑的重点问题。基于PCR信号放大的检测方法通常操作过程繁琐，过程引入的变异因素较多，制约着临床实际应用；未来全自动化装置的引入（微流控芯片）或可降低这方面的影响。谢谢欢迎批评指正！