DNA测序原理专题培训课件.ppt

1、DNADNA测序原理测序原理人类基因组计划人类基因组计划(human genome project, HGP)是由美是由美国科学家于国科学家于1985年率先提出，于年率先提出，于1990年正式启动的。年正式启动的。总体计划在总体计划在15年内投入至少年内投入至少30亿美元进行人类全基因亿美元进行人类全基因组的分析。组的分析。 美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国科学家共同参与。本和我国科学家共同参与。我国承担其中我国承担其中1%的任务，即人类的任务，即人类3号染色体短臂上约号染色体短臂上约30亿个碱亿个碱基基的测序任务。的测序任务

2、。人类基因组人类基因组线粒体基因组线粒体基因组核基因组核基因组(约约30亿个碱基亿个碱基)基因外序列基因外序列基因和基因有关序列基因和基因有关序列约约10%约约90%专一或中等重复序列专一或中等重复序列Non-coding DNA假基因假基因内含子内含子基因片段基因片段90%专一的或低专一的或低拷贝数序列拷贝数序列中度至高度重复序列中度至高度重复序列2030%7080%分散重复序列分散重复序列串联重复序列串联重复序列/成簇重复序列成簇重复序列约约60%约约40%蛋白编码蛋白编码基因基因rRNA基因基因tRNA基因基因Coding DNA序列测定的技术序列测定的技术 杂交测序法杂交测序法 质谱法

3、质谱法 单分子测序法单分子测序法 原子探针显微镜测序法原子探针显微镜测序法DNA 芯片法芯片法 经典方法经典方法:Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法(Sanger,1977)Maxam-Gilbert DNA化学降解法化学降解法(Maxam &Gilbert,1977)新技术方法新技术方法:Sanger双脱氧终止法双脱氧终止法*少一个少一个OH脱氧核甘酸脱氧核甘酸与与双脱氧核甘酸双脱氧核甘酸结构比较结构比较H荧光检测探头荧光检测探头电泳，看谁跑得快除核苷酸序列文本文件外，全自动测序仪还提供曲线图。除核苷酸序列文本文件外，全自动测序仪还提供曲线图。化学裂解法测定化学裂解法测定DNA的核苷酸

4、序列的核苷酸序列根据载体序列设计通用引物测定待测根据载体序列设计通用引物测定待测DNA片断片断鸟枪测序法鸟枪测序法(shotgun sequencing)(shotgun sequencing)：随机克：随机克隆测序隆测序将待测的将待测的DNADNA片段随机打断片段随机打断并构建随机重叠克并构建随机重叠克DNA全序列全序列切成切成小段小段小段和载体结合小段和载体结合结合后进行测序结合后进行测序Map fragmentsSequence overlappingfragmentsAssembledsequence基因组基因组DNA序列测定示意图序列测定示意图 通过随机剪切得到的大分子通过随机剪切得

5、到的大分子DNA片段克隆到载体上。绘片段克隆到载体上。绘制出这些重叠片段的图谱，并对重叠片段进行测序，通过制出这些重叠片段的图谱，并对重叠片段进行测序，通过“拼装拼装”得到基因组序列。另一种方法不是根据片段的染色得到基因组序列。另一种方法不是根据片段的染色体位置，而是根据其重叠部分进行体位置，而是根据其重叠部分进行“拼装拼装”。Sequence all fragments and assemble（一）mRNA的提取，电泳检测、反转录（二）PCR扩增目的基因预习报告，实验报告当天做完实验后根据书上的相关部分内容及笔记书写。（一）载体酶切（二）PCR产物酶切（三）酶切产物的回收（四）目的基因与载体的连接（一）感受态细胞的制备（二）重组子的转化（三）转化子的菌落PCR鉴定第四章作业：第四章作业：Southern 、Northern 、Western 杂交、生物芯片杂交、生物芯片技术、技术、RNAi技术原理分别是什么？技术原理分别是什么？ 第五章作业：第五章作业： PCR克隆与一般的克隆与一般的DNA片段的克隆有何异同点？片段的克隆有何异同点？第六章作业：第六章作业： 1 Sanger双脱氧终止法化学降解法进行序列分析的双脱氧终止法化学降解法进行序列分析的原理是什么原理是什么 ？第七章作业：第七章作业： 1 DNA诱变种类有哪些，各有何特点？