蛋白质分析技术课件.pptx

1、理化性质理化性质蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质浓度测定蛋白质浓度测定蛋白质印迹实验蛋白质印迹实验酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验免疫免疫沉淀沉淀其他其他氨基酸氨基酸多肽链多肽链蛋白质蛋白质一级结构、二级结构、三级结构、四级结构一级结构、二级结构、三级结构、四级结构分子量分子量等电点等电点活性活性溶解度溶解度分子量分子量所带所带电荷电荷特殊亲和性特殊亲和性影响因素影响因素pHpH值值离子强度离子强度介电常数介电常数温度温度同同一条件下一条件下, ,不同的蛋白质不同的蛋白质因分因分子结构的不同而有不同子结构的不同而有不同的的溶解度。根据溶解度。根据蛋白质分子结构的特点蛋白质分子结构的特点, ,

2、适当地改变外部条适当地改变外部条件件, ,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度, ,达到分离纯化蛋白质的目的。达到分离纯化蛋白质的目的。不同蛋白质的等电点不同,而蛋白质在其等电点时溶解度最低。等电点沉淀等电点沉淀有些蛋白质在特定pH值时溶解较高，因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。pHpH值调节值调节中性盐可显著影响球状蛋白质溶解度。增加蛋白质溶解度的现象称盐溶,反之为盐析。对比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl，同样浓度的二价离子中性盐,如MgCl2、(NH4)2SO4对蛋白质溶解度影响更明显。盐析是提取血液中免疫球蛋白

3、的常用方法,如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法,其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产。利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后,通常要使用透析或凝胶过滤的方法除去中性盐。盐溶和盐析盐溶和盐析与水互溶的有机溶剂能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。室温下,有机溶剂使蛋白质沉淀的同时伴随着变性。将有机溶剂冷却, 加入时不断搅拌防止局部浓度过高。对于和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质,可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取,它们有一定的亲水性和较强的亲脂性,是理想的提取液。冷乙醇分离法最初用于免疫球蛋白的提取，是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法。分辨率高、提纯效果好。有机溶剂提取法有机溶剂提

4、取法ATPE（Aqueous two phase extraction）, 是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相,被分离物在两相中分配不同便可实现分离。此方法可以在室温环境下进行,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高。对于细胞内的蛋白质,需要先对细胞进行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到浓缩,细胞碎片等固体物分布在下相中。采用双水相系统浓缩目的蛋白,受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响。双水相萃取技术双水相萃取技术利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的。反胶团是当表面活性剂在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体。优

5、点是萃取过程中蛋白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护。反胶团萃取法反胶团萃取法蛋白质是一种大分子物质蛋白质是一种大分子物质, ,并且不同并且不同蛋白质的蛋白质的分子量大分子量大小小不同不同, ,因此可以利用一些较简单的方法使因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质蛋白质和小分子和小分子物质分开物质分开, ,并且不同分子量的蛋白质也并且不同分子量的蛋白质也得到分离得到分离。透析超滤离心凝胶过滤常常用用方方法法透析透析将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤超滤利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。由于超滤过程中,滤膜表面容易被

6、吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果。这两种方法都可以将蛋白质大分子与无机盐为主的小分子这两种方法都可以将蛋白质大分子与无机盐为主的小分子分开，经分开，经常常和盐析、盐溶方法和盐析、盐溶方法联用。在联用。在进行盐析或盐溶进行盐析或盐溶后，这后，这两种方法除去引两种方法除去引入的无机盐入的无机盐。离 心离 心经常和其它方法联用的一种分离蛋白质的方法。蛋白质和杂质的溶解度不同时，可利用离心进行分离。蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合

7、成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。凝 胶 过 滤凝 胶 过 滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。电泳电泳在外电场的作用下, 不处于等电点状态的蛋白质分子将向着与其电性相反的电极移动。聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦电泳双向电泳离子交换层析离子交换层析是以离子交换剂为固定相,依据流动相中

8、的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法带有正电荷的阴离子交换树脂带有负电荷的阳离子交换树脂。电泳电泳在外电场的作用下, 不处于等电点状态的蛋白质分子将向着与其电性相反的电极移动。聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦电泳双向电泳离子交换层析离子交换层析是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法带有正电荷的阴离子交换树脂带有负电荷的阳离子交换树脂。丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺聚合形成网状结构。丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺聚合形成网状结构。分子筛效应分子筛效应调节浓度可控制孔径大小调节浓度可控制孔径

9、大小与所带电荷、分子量大小有关与所带电荷、分子量大小有关非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGENative-PAGE）在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态。依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGESDS-PAGE）根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基磺酸钠）。蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺Tris-HCl

10、Tris-HCl缓冲系统，调节pH值。强还原剂如巯基乙醇强还原剂如巯基乙醇，使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。SDSSDS阴离子去污剂，去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。过过硫酸铵（硫酸铵（APAP）、四）、四甲基乙二胺（甲基乙二胺（TEMEDTEMED）AP催化单丙和双丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED加速AP催化作用；电泳电泳在外电场的作用下, 不处于等电点状态的蛋白质分子将向着与其电性相反的电极移动。聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦电泳双向电泳离子交换层析离子交换层析是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别

11、而进行分离的一种层析方法带有正电荷的阴离子交换树脂带有负电荷的阳离子交换树脂。利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在载体（常用在载体（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pHpH梯度。梯度。电泳电泳时每种时每种蛋白质迁移蛋白质迁移到等于其等电点（到等于其等电点（pIpI）的）的pHpH处处时，此时，此蛋白质不再带有净的正或蛋白质不再带有净的正或负电荷，从而停止迁负电荷，从而停止迁移形成移形成一个很窄的区带一个很窄的区带。每每种蛋白质的等电点不同，从而达到分离蛋白质的目种蛋白质的等电点不同，从而达到分离蛋白质的目的。的。电泳电泳在外电场的作用下

12、, 不处于等电点状态的蛋白质分子将向着与其电性相反的电极移动。聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦电泳双向电泳离子交换层析离子交换层析是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法带有正电荷的阴离子交换树脂带有负电荷的阳离子交换树脂。第一向第一向等电聚焦电泳：蛋白质按照pI进行分离第二向第二向SDS-聚丙烯酰胺电泳：蛋白质按照分子量进行分离电泳电泳在外电场的作用下, 不处于等电点状态的蛋白质分子将向着与其电性相反的电极移动。聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦电泳双向电泳离子交换层析离子交换层析是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子

13、与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法带有正电荷的阴离子交换树脂带有负电荷的阳离子交换树脂。亲和层析法亲和层析法利用蛋白质与配基之间特异性又可逆的结合这一特性，利用蛋白质与配基之间特异性又可逆的结合这一特性，对蛋白质进行层析分离的技术。对蛋白质进行层析分离的技术。常用配基常用配基抗原抗体激素受体蛋白酶底物（抑制剂）层析层析载体常用琼脂糖凝胶等。载体常用琼脂糖凝胶等。凯氏定氮法凯氏定氮法双缩脲双缩脲法法酚酚试剂法（试剂法（lowrylowry法）法）紫紫外吸收法外吸收法考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法凯氏定氮法凯氏定氮法样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨（消化）

14、，氨与硫酸作用变成硫酸氨。再经强碱分解释放氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。计算所得结果为样品总氮量，总氮量减去非蛋白氮即得蛋白氮量，样品中蛋白氮乘以625即得样品蛋白量。灵敏度较低。双缩脲法双缩脲法在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。蛋白质分子含有肽键(CO-NH)，可发生双缩脲反应，呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比。测定范围为1-10mg蛋白质。优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要

15、十分精确的蛋白质测定。酚试剂法酚试剂法在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物，即双缩脲反应。Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。兰色深浅度与蛋白质量成正比。优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，专一性较差，干扰物质较多。检 测 的 最 低 蛋 白 质 量 达 5 g 。 通 常 测 定 范 围 是20250g。紫外吸收法紫外吸收法蛋白质在280nm处有吸收高峰，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。

16、优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。缺点：准确度较差，干扰物质多（核酸、缓冲液等），酪氨酸和色氨酸含量不同的蛋白质，有一定的误差。考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合后变为青色，在595 nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2 min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。优点操作简便灵敏度高稳定性好缺点不同蛋白质测定存在一定偏差，标准品采用-球蛋白可减少偏差。要求样品完全溶解。样品不能回收。注意事项反应时间过长会产生沉淀影响检测，一般在10min内完

17、成测定。被检测物是蛋白质“探针”是抗体“显色”用标记的二抗。蛋白质印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。原理原理蛋白质样品经过PAGE分离后，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上；固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变；以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应；再与酶或同位素标记的第二抗体起反应；经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。l蛋白质的提取、纯化、定量l蛋白质变性（加

18、热)l样品缓冲液（指示剂、阴离子去污剂等）l制胶（分离胶、浓缩胶、加样孔）l加样（缓慢均匀）l电泳（指示剂的位置）膜正胶负膜正胶负、隔绝空气、避免短路非特异性蛋白质占据膜上没有蛋白质的位点，防止抗体吸附，形成假阳性。针对待测蛋白的特异性抗原抗体反应带有标记集团的二抗与一抗蛋白结合二抗所带集团决定显色方法：酶显色、化学发光、放射显影、荧光。使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。1 9 7 1 年 E n g v a l l 和 P e r l m a n n 发 表 了 酶 联 免 疫

19、吸 附 剂 测 定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。抗原抗原抗体结合原理，具有特异性。抗体结合原理，具有特异性。标记抗体所连接的酶作用于底物产生显色反应，具有标记抗体所连接的酶作用于底物产生显色反应，具有放大效应。放大效应。根据根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。l灵敏l特异l快速l简单l易于自动化操作ELISAELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在可用于测定

20、抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有这种测定方法中有3 3种必要的试剂：种必要的试剂：固相固相的抗原或的抗原或抗体（免疫吸附物）抗体（免疫吸附物）酶标记酶标记的抗原或的抗原或抗体（标记物）抗体（标记物）酶酶作用的作用的底物（显色剂）底物（显色剂）根据根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。件，可设计出各种不同类型的检测方法。常用酶及其底物常用酶及其底物利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合；再与蛋白A/G（Protein

21、A/G）或二抗偶联的agarose或Sepharose珠子孵育；离心得到珠子珠子- -蛋白蛋白A/GA/G或二抗或二抗- -抗体抗体- -目的蛋白复合物目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。优点优点相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以

22、避免人为的影响；可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点缺点可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。灵敏度没有亲和色谱高。高效液相色谱高效液相色谱质质谱分析谱分析蛋白蛋白芯片芯片其他其他高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。“

23、四高一广四高一广”的特点：的特点：高压高速高效高灵敏度应用范围广质谱分析是一种测量离子荷质比（电荷-质量比）的分析方法。基本原理样品各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离子；经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器；质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。质谱分析技术在蛋白质研究中的应用质谱分析技术在蛋白质研究中的应用蛋白质序列分析蛋白质分子量确定蛋白质复合物的组分分析蛋白质的修饰：硫酸化、糖基化、N段封闭等蛋白芯片是一种高通量监测系统，通过靶分子和捕捉分子相互作用来监测蛋白分子之间的相互作用。捕获分子一般都预固定在芯片表面，由于抗体的高度特异性和与抗原强结合特性所以被广泛的用做捕获分子。将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测的芯片；用标记了有特定荧光物质的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对应的蛋白质结合，抗体上的荧光将指示对应的蛋白质及其表达数量。在将未与芯片上的蛋白质互补结合的抗体洗去之后利用荧光扫描仪或激光共聚扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白之间相互作用的关系，由此达到测定各种基因表达功能的目的。