聚合酶链反应技术课件.ppt
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- 聚合 反应 技术 课件
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1、2022-6-91聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术Polymerase Chain Reaction李伟李伟温州医科大学温州医科大学 检验医学院生命科学学院检验医学院生命科学学院2022-6-92 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术是生物技术领域中最重要的四项生物技术(即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术)之一。由于通过体外(试管内)扩增,可以将目的基因(或靶基因)片段百万倍的放大,从而达到极大地提高核酸分子检测的灵敏度,理论上其检测的灵敏度可以达到一个细胞、甚至一个分子的水平。 2022-6-93主要内容主要内容第一节 聚合酶链反
2、应技术的原理第二节 聚合酶链反应技术的常见问题及体系优化第三节 聚合酶链反应技术的方法发展及相关技术第四节 荧光定量聚合酶链反应技术第五节 聚合酶链反应方法的标准化2022-6-94第一节第一节 聚合酶链反应技术的原理2022-6-95一、聚合酶链反应技术的简史一、聚合酶链反应技术的简史 Watson、Crick:DNA双螺旋结构 Meselson、Stahl:半保留复制模型 Khorana:最早提出体外扩增核酸的设想 Kary. B. Mullis:发明聚合酶链反应 Saiki:发现耐热DNA聚合酶2022-6-96二二. . 聚合酶链反应技术的原理聚合酶链反应技术的原理PCR技术实际上是模
3、拟体内DNA半保留复制过程,在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下,依赖于DNA聚合酶的酶促反应,由变性退火延伸三个基本反应步骤构成。 2022-6-97模板DNA94变性55退火72引物延伸第二次循环模板变性退火延伸经25-30次循环,目的DNA增加106-7图6-1 PCR原理示意图2022-6-981234522557294时间(min)温度()PCRPCR的基本原理的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍2022-6-99PCR的基本原理PCR反应条件PCR
4、过程PCR的特点1234522557294时间(min)温度()适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA942022-6-910PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点9455引物1引物2DNA引物2022-6-911PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点55引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶2022-6-912PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束94第2轮开始2022-6-913PCR的基本原理PCR反应条
5、件PCR过程PCR的特点945572TaqTaqTaqTaq2022-6-914PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束2022-6-915PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增2022-6-916 在下一轮循环中,DNA双链再经变性、退火、延伸三步, 模板DNA数量翻一倍(假设扩增效率为100%)。如此反复循环,便可使DNA以指数形式进行扩增。每完成一个循环需2-4min, 2-3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。
6、2022-6-917nyny图6-2-1 图6-2-2图6-2 PCR扩增效率图y=A(1+R)n y=A2n 2022-6-918 反应组成: (五要素) 模板(template)引物(primer) 预扩增核酸片段两端的已知序列,决定特异三、三、PCRPCR反应体系反应体系 DNA RNA:总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、 病毒RNA基因组DNA质粒DNA2022-6-919- DNA 聚合酶(DNA polymerase) - dNTP: 包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP- PCR buffer:一般组成:50mM KCl, 10-50mM Tris-Cl(室温PH8.
7、3) ,1.5mM MgCl2 2022-6-920(六)(六)PCRPCR一般方案一般方案150 ul PCR反应体系的组成1)组成:样品DNA 0.11ug;正链引物(25umol/L)1.0ul;负链引物(25umol/L)1.0ul;脱氧核苷三磷酸(dNTP各2.5mmol/L)4.0ul;10PCR缓冲液 5.0ul;MgCl2(25mmol/L)3.0ul;Taq DNA聚合酶12.5u;蒸馏的去离子水补至50ul。加入30ul石蜡油,短暂离心混匀。 2)对照:阳性对照、空白对照分别以阳性模板DNA、蒸馏的去离子水取代样品DNA。2022-6-9212PCR仪工作参数的设置94 3
8、060sec,553060sec,723060sec,循环30次,最后72延伸5min。3PCR产物的保存与检测PCR产物于4保存,PCR产物检测。2022-6-922四四. PCR. PCR扩增产物的检测方法扩增产物的检测方法 凝胶电泳:琼脂糖凝胶电泳法 、聚丙烯酰胺凝胶电泳法 PCR-限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP) 单链构型多态性分析法(PCR-SSCP) 核酸探针杂交法 PCR产物测序 PCR-OLA(PCR-oligonucleotide ligation assay) 荧光PCR2022-6-923( (一一) )聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及用途聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及用
9、途 特点:分辨力高,长度仅相差1bp的DNA分子即可分开;上样量远大于琼脂糖凝胶;回收的DNA纯度高;采用银染色DNA或RNA,灵敏度高,比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍,而且避免EB易退色的弱点。 用途:PCR扩增指纹图、多重PCR、PCR产物限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析。2022-6-924( (二二)PCR-)PCR-限制性片段长度多态性分析法限制性片段长度多态性分析法(polymerase chain reaction based on restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP) 不同的限制性核酸内切酶有具
10、识别的特异DNA序列,所以用特定的限制性核酸内切酶对目的DNA分子进行消化,得到的酶切片段其大小和数量可以在一定程度上反应出目的DNA分子的序列信息用途:传染病病原体基因分型 人类基因的变异性研究。是诊断遗传病和传染病病原体基因分型的常用方法2022-6-925PCR-RFLP法: 限制性内切酶恶性肿瘤(癌基因或抑癌基因)恶性肿瘤(癌基因或抑癌基因)Ras基因突变限制性内切酶2022-6-926( (三三) ) 核酸探针杂交法核酸探针杂交法1点杂交(dot blot)2反向点杂交(reverse dot blot)3微孔板杂交(microplate hybridization)4PCR-EIA
11、:(RNA probe hybridization enzyme immunoassay, RPEIA)5Southern印迹杂交(Southern blot)2022-6-927点杂交(点杂交(dot blotdot blot) 原理:将扩增产物变性后直接点在尼龙膜或硝酸纤维素膜上,再用放射性或非放射性标记物标记的寡核苷酸探针与之杂交。 探针:放射性同位素标记探针检测的敏感、特异,具有不稳定性和放射性危害。非放射性物质(如生物素、地高辛、荧光素等)标记的探针稳定性高、使用安全、检测速度快 用途:主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。2022-6-928反向点杂交反向点杂交(reverse
12、dot blot)(reverse dot blot) 原理:使用带有标记物的引物进行PCR扩增,然后将扩增产物变性。将不同的寡核酸探针固定在尼龙膜上,用变性的PCR产物与之杂交。 探针:严格设计,具有相同的杂交反应条件。 用途:反向点杂交特别适用于遗传性疾病多个位点的点突变分析。 结果分析:正常纯合子突变纯合子杂合子2022-6-929SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交(Southern blot)(Southern blot)2022-6-930( (四四) PCR-ELISA) PCR-ELISA 引物采用双标记,即一个引物5端标记便于PCR产物固定的功能基团(如生物素),
13、另一个引物5端标记便于PCR产物检测的基团(如地高辛、荧光素等)。 本法避免了电泳和杂交的步骤,适用于常规ELISA记数仪检测2022-6-931( (五五) ) 单链构型多态性分析法(单链构型多态性分析法(PCR-Single Strand PCR-Single Strand Conformation PolymorphismConformation Polymorphism,简称,简称PCR-SSCPPCR-SSCP) 本法就是将PCR 产物双链DNA(dsDNA)变性为单链DNA (ssDNA),加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,由于DNA 分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有
14、关,而空间结构又与ssDNA序列有关。因此,电泳结束后,ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。2022-6-932PCR-SSCPPCR-SSCP过程过程 - primer - 32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 变性 单链DNA 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 2 3 4 5 自显影 1.为正常 结果分析 2、4、5纯合患者 3.为杂合子 . 解链构像DAN原 理过 程2022-6-933( (六六) PCR-OLA) PCR-OLA法法( (七七) PCR) PCR产物测序产物测序常用的方法:双脱氧核苷酸链末端终止法化学裂解法。用途:科研2022-6-934第二节第二节 聚
15、合酶链反应技术的常见问题及体系优化2022-6-935一一. . 常见问题及其分析常见问题及其分析 1 1假阳性假阳性 PCR产物是最主要的污染源。 含有靶DNA序列的质粒的污染。 阳性对照的污染。 标本之间的交叉污染。 在采集标本时,其他污染源带来的污染。 Taq聚合酶中带有细菌DNA,当PCR扩增片段为保守的rRNA序列时,易造成假阳性。2022-6-936 2 2假阴性假阴性 假阴性是PCR反应中另一个易出现的问题。造成的原因也比较多。可以归纳以下几方面原因。 (1)标本处理的原因。 处理标本时,靶DNA丢失。 处理标本时,杂质成分没有去除干净,带入PCR反应中抑制了Taq酶活性。 标本
16、放置不当,模板发生降解(尤其是RNA)。2022-6-937 (2)PCR试剂问题。 Taq DNA聚合酶失活。 Mg2+浓度过低或是没有加。 (3)PCR扩增过程中的问题 PCR扩增仪故障。 PCR扩增反应液没有加液体石蜡油。 (4) PCR产物鉴定中的问题 电泳时没有加溴化乙锭。 电泳缓冲液和凝胶使用次数过多。 凝胶浓度过低,使扩增带跑散。2022-6-938 3 3引物二聚体引物二聚体 形成引物二聚体的原因有: 两个相同的或不同的引物分子之间有较多的碱基配对,特别是引物3端有互补区。 引物模板比例太高,可增加模板用量。 退火温度过低。 热循环次数过多。2022-6-939 4 4非特异性
17、非特异性PCRPCR产物产物 1) 造成非特异性PCR产物的常见原因及其预防措施 2)提高PCR反应特异性的办法 5PCR污染及预防措施 6RT-PCR 中避免RNA酶(RNase)的污染 (1)去除外源RNase污染 (2)抑制内源性RNase的活性2022-6-940二二. PCR. PCR反应体系的优化反应体系的优化 1模板核酸 2引物 PCR扩增产物的大小是由特异引物限定的,因此引物的设计与合成对PCR的成功与否有着决定性的意义。 引物设计要求:(1)引物长度; (2)分布的均衡性;(3)引物二聚体及二级结构;(4)引物3端、5端的特异性(5)引物的内部稳定性; (6)引物的特异性(7
18、)扩增区域的二级结构2022-6-941 长度1530bp,过短特异性降低,过长则成本增加,产量也下降。 引物碱基尽可能随机分布,避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象,引物 G+C 含量宜在45 55%左右 引物内部不能含有自身互补序列,否则会形成发夹样二级结构,两个引物之间尤其在 3 末端不应有互补链存在,不然会形成引物二聚体。 引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性(70%)或少于连续8个的互补碱基。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。2022-6-942 引物的 5 末端碱基:并没有严格的限制,只要与模板DNA结合的引物长度足够,其 5 末端碱基可以不与模板DNA匹配呈游离状态。最多可游离
19、10个碱基并不影响PCR反应进行。 引物的 3 末端碱基:原则上要求引物的3末端与模板DNA一定要配对,另外 3末端的末位碱基在很大程度上影响着 Taq 酶的延伸效率。 引物3末端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大差异,最好选T、G、C,而不选A.2022-6-943 3缓冲液 4Mg2+ Mg2+是Taq DNA聚合酶活性所必需的,也影响着引物的退火,模板与PCR产物的解链温度,产物的特异性,引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时,酶活力显著降低;过高时,则酶催化非特异的扩增。2022-6-944 5三磷酸脱氧核苷酸 过高:加快反应速度,还可增加碱基的错误掺入率和室验成本。 过低:反
20、应速度下降,可提高实验的精确性。 6耐热DNA聚合酶 酶的需要量可根据不同的模板分子或引物而变化。 偏高:引物非特异产物的扩增 偏低:产物量降低7温度循环参数: (1)变性温度与时间(2)复性温度与时间 (3)延伸温度与时间 (4)循环数和扩增效率2022-6-945 (5)其它因素 1)梯度PCR(TD PCRTouch-down PCR) 根据引物Tm值,选定一个退火温度范围(跨越1020的温度范围,引物Tm值在这个范围之内)。在设置循环参数时,让退火温度从选定范围的最高温度开始,逐步降低退火温度(每次降低15),最后结束在选定范围的最低温度。在每一个退火温度上循环25次。 2)热启动PC
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