PCR技术上岗培训课件.ppt
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1、PCR技术上岗培训2疾病的诊断分子诊断分子诊断影象学诊断细胞/组织诊断 临 床 诊 断免疫诊断3几乎所有的疾病都是基因病n科学研究已证明,基因可以揭示疾病的本质,人类几乎所有疾病都直接或间接与基因有关,在某种意义上都是基因病, 4567PCR技术n1985年美国人莫里斯(Kary Mullis)发明了一种模拟DNA体内复制过程,在体外复制特定DNA片段的方法,并将其命名为聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction,PCR)。PCR可以在短时间内倍增极微量DNA (理论上说,仅有一个足够了)至百万或十亿倍,通过PCR可以简便、快速地从微量生物材料中获得大量特定的核酸,并具有
2、很高的灵敏度和特异性,可用于微量核酸样品的检测。 8PCR技术nPCR技术被科学界誉为生物技术领域最伟大的发明之一,美国人莫里斯在发明该技术不久就因此于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR及其相关技术于80年代末在国外开始应用:欧共体(现欧盟)、日本、美国相继把PCR这一基因诊断核心技术列入献血员筛查,美国食物与药品管理局已批准了60多种基因诊断试剂用于临床,美国国家疾病控制中心已把PCR技术列入疾病诊断的常规技术。 910111.DNA变性(90-96):双链DNA模板在热作用下, 氢键断裂,形成单链DNA2.退火(25-65):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。3.延伸(70
3、-75):在Taq酶(在72左右最佳的活性)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5端3端延伸,合成与模板互补的DNA链。 每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍。 标准的PCR过程分为三步12荧光荧光PCRPCR检测技术是在传统检测技术是在传统PCRPCR技术基础上,加入荧光技术基础上,加入荧光标记的基因探针,通过探针与扩增产物的结合释放出标记的基因探针,通过探针与扩增产物的结合释放出荧光信号,再通过专门的仪器(荧光荧光信号,再通过专门的仪器(荧光PCRPCR仪)对荧光信仪)对荧光信号的实时检测,经过电脑分析以后,可以准确计算出号的实时检测,经过电脑分析以后,可以准确计算出目的基因
4、的初始数量,实现定量检测。与传统目的基因的初始数量,实现定量检测。与传统PCRPCR检测检测相比,荧光相比,荧光PCRPCR检测技术不仅实现了检测技术不仅实现了PCRPCR检测从定性到检测从定性到定量的飞跃,而且它具有特异性更强、有效解决定量的飞跃,而且它具有特异性更强、有效解决PCRPCR污污染问题、自动化程度高等特点。因此,荧光染问题、自动化程度高等特点。因此,荧光PCRPCR检测技检测技术自二十世纪九十年代中期出现以来,已成为最具代术自二十世纪九十年代中期出现以来,已成为最具代表性的表性的PCRPCR检测技术,为检测技术,为PCRPCR检测技术临床应用打开了检测技术临床应用打开了方便之门
5、,现已得到广泛应用。方便之门,现已得到广泛应用。荧光荧光PCRPCR检测技术简介检测技术简介 13短柄圆环探针荧光PCR原理分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链,一般含有2535个核苷酸。在结构上,分子信标大体上可以分为三部分:(1)、环状区:一般由1530个核苷酸组成,可以与靶分子特异结合;(2)、茎干区:一般由58个碱基对组成,在分子信标与靶分子结合过程中可发生可逆性解离。(3)、荧光基团和淬灭基团:荧光基团一般连接在5端;淬灭基团一般连接在3端,常用4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(DABCYL)作为淬灭基团。根据Foerster理论,中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以
6、只有荧光基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。14荧光标记n荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态,而后产生发射光。常用的有绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白DsRed 、CY3、CY5、FAM及其它荧光报告基团 15探针荧光标记及荧光基团:如红色荧光Cy3和绿色荧光Cy5标记探针淬灭基团常:用4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(DABCYL)16影响分子信标的主要因素n分子信标中,荧光基团和淬灭基团之间的距离是影响分子信标的最主要因素。根据Foerster理论,荧光基团与淬灭基团之间的距离直接影响荧光的强度。 n另外,温度也是影响分子信标的一个重要因素。在较低温度下,分
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