PCR技术及其发展和应用课件.ppt

1、PCR技术及其发展和应用张雪梅检验系临床生化教研室主要参考书1.CW迪芬巴赫、GS德弗克斯勒美主编。PCR技术实验指南2.黄留玉主编。PCR最新技术原理、方法及应用3.尹一兵主编。分子诊断学一、PCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0. .12ugDNA聚合酶 2. .5uMg2+ 1. .5mmol/LPCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点适温延伸3

2、高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍MOVIEPCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点引物1引物2DNA引物72Ta

3、q酶Taq酶PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点第1轮结束95第2轮开始PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 重复30轮后230=1,073,741,8241.8530=103,550,417PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链

4、反应的发明PCR的完善n1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。n但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善n1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）n基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制n然而，采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发

5、明PCR的完善n1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。 n1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。n耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪（1）在0.5mlPCR管内配置20ul反应体系：CK(ul)1#(ul)模板01引物10.50.5引物20.50.510PCRBuffer22Taq酶0.20.2dNTPs0.50.5dd

6、H2O16.315.3Total2020（2）PCR反应程序PCR结果：1、对照(无模板)；26、PCR产物（5ul样品）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点n灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU4.细菌检测的最小检出率为3个细菌n简便、快速1.一次性加好反应液，14 小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析n对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNALambdaDNA，模板量分别为100pg,10pg,1pg,100fg,10fgn序列

7、的查找可在相关的网址，如http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed查找各种目的序列。n同源性比较可以在www.ncbi.nih/blast.cgi进行在线比较或通过OMIGA、ClustalX等软件进行两两或多序列的比较。引物序列同源性比对3引物设计常用软件主要有：nPrimerPremier5.0nOligo6nprimer3nThePrimerGeneratornNetPrimer1.将序列输入软件中（2）在表中粘贴序列（1）新序列两个方法选择序列文选择序列文件所在位置件所在位置（2）打开原有的序列文件 在对话框中输入待扩增序列 点击左上角的“Primer”按钮2.

8、设置相关参数3.得到的引物结果Hairpin: 引物自身是否会形成发夹结构引物自身是否会形成发夹结构Dimer: 同一种引物是否会形成二聚体同一种引物是否会形成二聚体False primiring: 引物在待扩增序列中其他位置是否有配对引物在待扩增序列中其他位置是否有配对Cross Dimer: 正向与反向引物间是否会形成二聚体正向与反向引物间是否会形成二聚体正向和正向和反向引反向引物的互物的互换换正向和反向正向和反向引物的评价引物的评价正向和反向正向和反向引物的信息引物的信息每点击左每点击左边红色的边红色的按钮，就按钮，就出现相应出现相应的内容的内容对正向和反向引物进行编辑对正向和反向引物进

9、行编辑可对引物进行增加或减少碱基用键盘输入5个碱基引物的信息引物的信息改动后引物的信息重新回到双引物的界面“Edit”“Copy”“Sense Primer”5 CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 34.输出引物序列n引物纯度：公司合成引物常用的纯化方式C18脱盐、OPC纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。普通PCR：OPC纯（95%）较长引物（大于50个碱基）：PAGE纯（95%）经过修饰或标记的引物：HPLC纯（99%,但价格昂贵）n引物浓度：0.1-0.5mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。 合成内容合成内容普通引物合成(12kb）的功能较强

10、。nPfuDNA聚合酶：具有35外切酶活性的校对功能，催化DNA合成的忠实性比Taq聚合酶高12倍，但不适于2kb的片断扩增。二、PCR的衍生技术 逆转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）反向PCR（inversePCR）巢氏PCR（nestingPCR）原位PCR（insituPCR）多重PCR（multiplexPCR）多重等位基因PCR（multiplexallelePCR）不对称PCR（asymmertricPCR）锚定PCR（anchoredPCR）长片段PCR（longfragmentPCR）荧光定量PCR（fluorescentquantita

11、tivePCR）逆转录酶DNA聚合酶活性mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增影响因素（1）模板对RT-PCR的影响对RNA制品的纯度和完整性要求都极为严格（2）逆转录酶对RT-PCR的影响MLV逆转录酶能合成大于2kb的较长cDNA，但对热的稳定性较AMV逆转录酶差。（3）逆转录引物对RT-PCR的影响随机引物：原核细胞多用oligo(dT)：真核细胞多用基因特异性的引物（GSP）：特异性强，广谱性低例子：S.pn的转化对PsaA基因mRNA表达的影响na、RNA的提取：野生型和转化缺陷型S.pn都诱导转化后，采用Qiagen试剂盒进行总RNA提取。nb、cDNA的制备：取RNA2l，随

12、机引物1l，DEPC水9l，混匀后，70变性5min，立即置于冰上。然后顺序加入逆转录buffer5l，dNTP1.5l,RNasin0.5l,DEPC水5l,逆转录酶M-MLV1l。混匀后于37，1小时，得到cDNA。nc、PCR扩增:PsaA的引物3L，cDNA1L，Tagplus酶0.2L，共30L体系。循环参数：9430秒，5540秒，7245秒，循环30次。用16srRNA的PCR产物为标准物，2%琼脂糖电泳。 电泳结果用软件Quantity-one3.2进行半定量比较，结果进行配对t检验分析00.10.20.30.40.501020Time after CSP added(min)

13、EB density of PsaA/16S22d16S(463bp)PsaA(254bp)图2， 2号菌株及其转化缺陷菌株在加入CSP后的不同时间PsaA mRNA的表达。 1 2 3 4 5 6 7图1， 2号菌株及其转化缺陷菌株在加入CSP后的不同时间PsaA 的RT-PCR电泳图。line1: Marker2. line2-4: 0min, 10min, 20min after S.pneumoniae No.2 was added CSP. line5-7: 0min, 10min, 20min after S.pneumoniae No.2d was added CSP. *转化到

14、大肠杆菌后，提取质粒，采用质粒引物即可直接对X片断进行扩增后测序，得到X基因序列信息。（10/64）EGFPXdw序列序列Xdw序列序列质粒引物质粒引物质粒引物质粒引物质粒引物质粒引物例子：S.pn体内诱导基因序列的获得图1第1、2、3组引物多重PCR电泳图1：正常对照；2：DL2000marker；310：检出的缺失型患者杜氏/贝克型肌营养不良症 一种常见的致死性神经-肌肉系统的X连锁隐性遗传病，其基因突变中缺失最常见，约占55%65%，缺失分布的位点较多，随地域及民族的差异而有不同特点 （1）随机突变：应用：构建突变体文库，继而可从中筛选出具有特殊性质的突变个体策略：易错PCR（error

15、-pronePCR）。n利用TaqDNA聚合酶等耐热DNA聚合酶不具有35校对功能的特性，在PCR扩增反应中可能掺入错误的核苷酸，从而产生随机错误的扩增产物。n加入次黄嘌呤核苷酸并限制某一种核苷酸的用量，从而促进DNA聚合酶选择其它3种核苷酸或次黄嘌呤核苷酸，导致扩增产物发生突变。（2）定点突变（1）5端引入突变：通过修饰上游引物的5端，即可引入标记的碱基、限制性酶切位点、启动子序列等。（2）序列中的单位点突变：采用重叠延伸PCR(OverlapExtensionPCR，OEPCR)（A）为5端引入突变（B）为单碱基突变例子：S.pn的ply146aa缺失的突变序列构建S.Pn的ply为一细胞

16、毒性分子，其146位aa缺失后毒性大大减弱。构建突变体作为疫苗：首先设计4个引物：（M1和M2完全重叠）P1: 5-CGGGATCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3 BamH IP2: 5-CCGCTCGAGCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3 Xho IM1: 5-GGTCAATAATGTCCCA-AGAATGCAGTATG-3 M2: 5-CATACTGCATTCT-TGGGACATTATTGACC-3 突变位点M2M1P2P1555335为酶切位点序列1. 以基因组DNA 为模板，以P1和M1为引物扩增出ply上游片断，以P2和M2为引物扩增出ply下游片断2

17、. 以上下游片断为模板，以P1和P2为引物，扩出全长3. 酶切后克隆到质粒中保存（3）多位点突变n策略：多次重叠PCRn关键：重叠引物的设计（每对突变引物需要部分重叠，方向相反）。A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达三、实时荧光PCR技术Ct值的定义：PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。 实时荧光定量PCR方法利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。 C(t)值的重现性n相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图n终点处检测产物量不恒定；C(t)

18、值具重现性荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线循环数标准曲线10410310610510210C(t)与初始模板含量n初始模板量越多，初始模板量越多，C(t)C(t)值越小值越小nC(t)C(t)与初始与初始模板浓度的对数值模板浓度的对数值成线性关系成线性关系定量原理q初始 DNA量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少（Ct值）qLog浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量确定初始模板的浓度I5353SGExcitationSGSGSGSGEmission 5353SGSGSGSGSG

19、ExcitationEmission 优点n使用方便n - 不必设计复杂的引物 n没有序列特异性n - 可以用于不同的模板 n便宜 n灵敏例子：荧光定量PCR检测肺炎链球菌comE基因转录水平方法流程：1、标准品制备：普通PCR扩增出comE基因片断装入克隆质粒定量稀释为109拷贝作为标准品备用2、定量检测comE基因表达水平：提取RNA逆转录成cDNA与成10倍梯度稀释的标准品一起作为模板，同时进行荧光定量PCR根据实验数据分析结果得到其表达的绝对量。图图1 comE基因荧光定量基因荧光定量PCR扩增曲线扩增曲线图图2 comE基因荧光定量基因荧光定量PCR融解曲线融解曲线 表1 D39菌株

20、在CSP诱导后不同时间的comE基因mRNA表达批次comE/16SrRNA0min10min*20min10.03410.95200.040220.19741.20470.111230.01240.40730.0160*：p0.05，CSP诱导10min时comE的表达量较0min和20min时显著增高实验结果：Oligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640ExcitationEmissionTransfer荧光共振能量传递（荧光共振能量传递（FRET Probe）双标记探针双标记探针（Taqman Probe）优点n对目标序列有很高的特异性 -特别适合于SNP检测n与

21、Molecular Beacons 相比设计相对简单n是目前应用最广泛的一种技术TACCGGGGGTTACGAACG GTAATGATCCTACCGATCCCACCSNP检测RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信标分子信标（Molecular Beacon Probe）535353533RQ5RQRQ35QRRREmissionExcitationQR引物特异性探针（引物特异性探针（Amplifluor Probe）灵敏度高灵敏的荧光检测较电泳检测灵敏度高特异性高使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性定量准确全程监控，准确的算法进行

22、定量无需跑胶，自动化程度高4通道实时荧光定量通道实时荧光定量PCR仪仪3、荧光定量PCR仪PCR只是一个简单的不起眼玩艺凯利穆利斯（KaryMullis)PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。它最大的特点就是能不断推出新形式。摘自MakingPCR:AStoryofBiotechnologybyPaulRabinowPCR技术的应用 研究与生产基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断细菌、病毒、寄生虫检测，肿瘤诊断 法医犯罪现场标本分析 其他 + 我国已批准生产的部分生物技术药物名称 作 用 rhu EPOrhu EPO

23、 产生红细胞rhu IFN1b (外用) 病毒性角膜炎rhu IFN1brhu IFN1b 乙肝、丙肝rhu IFN2a 乙肝、丙肝、疱疹等rhu IFN2a (酵母) 乙肝、丙肝rhu IFN2brhu IFN2b 乙肝、丙肝白血病等rhu IFN2a (栓剂) 妇科病rhu IFN2b (凝胶剂) 疱疹等rhu IFN 类风湿人胰岛素 糖尿病rhu GCSF 刺激产生白细胞rhu GMCSF 刺激产生白细胞、骨髓移植rhu GH 矮小病乙肝疫苗 预防乙肝rhu EGF(外用) 烧伤、创伤EGF 衍生物 烧伤、创伤rhu IL2 癌症辅助治疗rhu IL2 125Ser 癌症辅助治疗bFGF

24、(外用) 创伤、烧伤RSK 溶血栓(心梗) 抗IL28 单 抗乳膏剂 银屑病痢疾疫苗 预防痢疾Sequencing by synthesis (Illumina/Solexa)： read length 80-150bp, 1G/run. dioldiol1st cycle denaturation1st cycle annealingdioldioln=35total1st cycle extensiondioldioldioldiol2nd cycle denaturation2nd cycle annealingdioldioldioldioldioldiol2nd cycle exte

25、nsionA正常人A病 人外源性基因正常人 (-)病 人 (+)-地中海贫血症地中海贫血症 扩增阻滞突变系统（ amplification refractory mutation system，ARMS）进行检测300bp1000bp800bp图1，珠蛋白ARMS检测结果11、2分别为正常样本的N产物和M产物，3、5、7为检测样本的N产物,4、6、8为相应M产物。图2，珠蛋白ARMS检测结果21为N产物，2为M产物对照产物861bp囊性纤维化病囊性纤维化病(CF)(CF) 镰刀型细胞贫血症镰刀型细胞贫血症 HBV感染的传统诊断主要采用免疫测定法检测血清标本中的HBSAg，HbeAg，抗-Hbs

26、，抗-HBc和抗-Hbe（两对半），免疫学方法虽然比较简单，但只能提供血清中的HBV间接证据，无法证明是否具有传染性，且敏感性较低。目前的荧光定量PCR方法多采用TaqMan探针，一般根据HBV基因中的高度保守序列来设计，能够检测少至10拷贝/mL的HBVDNA。检测限范围宽为2502.5109拷贝/mL，是传统方法的良好补充。乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBV）的）的PCR检测检测 普遍认为HBeAg阳性者具有较强的传染性，而HBeAb的出现说明病情好转或稳定，其传染性弱。这113例HBeAg阴性患者检出42例HBV-DNA阳性，阳性率37.2%，具有传染性。A组(HBsAg、抗-HBe、抗

27、-HBc均阳性)，B组(HBsAg、抗-HBc均阳性)，C组（抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc均阳性），D组（抗-HBc阳性），E组（抗-HBe、抗HBc阳性）血清学模式 例数阳性数阳性率A组622845.2B组16637.2C组12433.2D组15212.5E组8117.2合计1134237.2表1不同模式HBeAg阴性乙肝患者HBV-DNA阳性率（%）采用聚乙二醇干扰素-2a（PEG-IFN）、拉米夫定（LAM）、阿德福韦（ADV）、恩替卡韦（ETV）、替比夫定（LDT）和替诺福韦（TDF）治疗1年。上图为HBeAg阳性慢性乙肝患者，下图为HBeAg阴性慢性乙肝患者。n目前结核病确诊主

28、要依靠痰片染色，抗酸杆菌和结核杆菌的培养法鉴定。但涂片阳性率不高，且不能确诊；培养法需较长时间。nELISA和RIA法敏感性低，尚不能直接检测临床标本。结核分枝杆菌感染的分子诊断结核分枝杆菌感染的分子诊断北京胸科医院、北京市结核病胸部肿瘤研究所、上海肺科医院三家医院的考核情况。医院结核组351例对照组160例例数涂阳培阳北京胸科143364260北京结研所151403150上海肺科57572950结核分枝杆菌(TB)FQ-PCR检测与常规检测比较FQ-PCR法与涂片法、培养法的检出率比较组别涂片法培养法 FQ-PCR法例数阳性检出率阳性检出率阳性检出率结核病组35113337.9%10229.1%22062.7%对照组16000%00%00%DNA 指纹图谱鉴定返思考题1.一次特异性很好的PCR后，所得产物的长度都是一样的吗？2.PCR技术的核心思路是什么，还可以有哪些变化，以实现不同的研究目的？