FDNB法测定氨基酸含量.课件.ppt

1、FDNB法测定氨基酸含量法测定氨基酸含量主讲教师: 王英武电 话:5619955电子信箱:JILIN UNIVERSITYRESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISM 实验目的实验目的1. 熟悉色谱仪器的组成及原理2. 了解色谱分离的原理.重点介绍反相色谱柱(以C18为例)3. 定量分析的方法(外标法)4. 梯度洗脱实验及氨基酸衍生化实验(FDNB法)JILIN UNIVERSITYRESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISM色谱仪器的组成及原理IHPLC组成 脱气系统(在线与离线)氦气脱气 真空脱气 超声脱气流动相传输系统(色谱泵)一元 二

2、元 三元 四元 多元评价指标:压力限制, 流速范围及精度 冲程大小等进样系统(手动与自动进样器)评价指标:精度 重现性 死体积 速度 可控性 (温度及各种其他功能)JILIN UNIVERSITYRESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISM柱温箱功能:维持流动相与固定相的温度恒定评价指标: 温度范围 升温或降温的速度 温度维持的精度 死体积大小检测系统紫外 视差检测 质谱检测 电化学检测 荧光检测 DAD检测 蒸发光色散检测等数据采集系统软件的可操作性, 采集速率, 文件存储能力色谱仪器的组成及原理IIJILIN UNIVERSITYRESEARCH CENTER F

3、OR DRUG METABOLISM色谱分离的原理色谱分离的原理色谱分离的基本原理是不同化合物在色谱柱上的差速迁移导致的色谱分离分离方式多种多样JILIN UNIVERSITYRESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISMmin00.511.522.53mAU 020406080 1.939 分流对紫外检测的影响分流对紫外检测的影响JILIN UNIVERSITYRESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISM黄色黄色 0.5 mL/min白色白色 1.0 mL/min红色红色 2.0 mL/minmin0123456789mAU -2002040

4、6080100120140 Area: 2028 High: 142 7.65 3.91 1.94 Area: 1021 High: 110Area: 544High: 85流速对保留时间及峰面积的影响流速对保留时间及峰面积的影响JILIN UNIVERSITYRESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISM05001000150020002500300035000123456time (min)peak height05001000150020002500300035000123456time (min)peak height有机相比例对出峰时间和峰面积的影响有机相比例

5、对出峰时间和峰面积的影响JILIN UNIVERSITYRESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISMHPLC条件的优化条件的优化 洗脱方式洗脱方式 一般采取等梯度洗脱，这样分析速度快 但有时也会采取梯度洗脱如分析多肽类化合物一般采取梯度洗脱，此时的信号会比等梯度洗脱时强很多，而且可以加大进样量。是提高灵敏度的一种措施，但是分析时间较长。需要有平衡的时间。JILIN UNIVERSITYRESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISM0500100015002000250030003500400045000123456time (min)peak

6、height梯度洗脱梯度洗脱JILIN UNIVERSITYRESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISMHPLC条件的优化条件的优化 柱温对色谱行为的影响 依那普利NHONHOOCCH3OOH3CNHONCH3OOH3CCOOHJILIN UNIVERSITYRESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISM色谱柱色谱柱的规格 填料 颗粒粒径孔径 厂商流动相组成 洗脱方式 柱温检测方式及具体条件流动相的组成对分离度的影响流速对色谱行为的影响柱温对色谱行为的影响溶剂对色谱的影响pH值 离子强度 缓冲液 离子对等其他因素的影响JILIN UNIVERS

7、ITYRESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISM123正正相相Normal Phase (NP)H2CCH2CH2CN132调节剂调节剂极性极性非极性非极性固定相极性较高固定相极性较高流动相方向流动相方向123正正相相Normal Phase (NP)H2CCH2CH2CN132调节剂调节剂极性极性非极性非极性固定相极性较高固定相极性较高流动相方向流动相方向H2CCH2CH2CNH2CCH2CH2CN132调节剂调节剂极性极性非极性非极性极性极性非极性非极性极性极性非极性非极性固定相极性较高固定相极性较高流动相方向流动相方向固定相极性较低固定相极性较低132H3CH

8、2CH2CH2CCH2CH2CH2CH2调节剂调节剂极性极性非极性非极性流动相方向流动相方向123反反相相Reversed Phase(RP)固定相极性较低固定相极性较低132H3CH2CH2CH2CCH2CH2CH2CH2调节剂调节剂极性极性非极性非极性流动相方向流动相方向固定相极性较低固定相极性较低132H3CH2CH2CH2CCH2CH2CH2CH2调节剂调节剂极性极性非极性非极性固定相极性较低固定相极性较低132H3CH2CH2CH2CCH2CH2CH2CH2H3CH2CH2CH2CCH2CH2CH2CH2调节剂调节剂极性极性非极性非极性极性极性非极性非极性极性极性非极性非极性流动相方

9、向流动相方向123反反相相Reversed Phase(RP)JILIN UNIVERSITYRESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISMJILIN UNIVERSITYRESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISMJILIN UNIVERSITYRESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISM定量分析的方法(外标法)0.20.61.01.41.82.22.63.0Time, min0%50%100%Rel. Int. (%)JILIN UNIVERSITYRESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLI

10、SM定量分析的方法(内标法)0.20.61.01.41.82.22.63.0Time, min0%50%100%Rel. Int. (%)JILIN UNIVERSITYRESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISM氨基酸衍生化实验氨基酸衍生化实验(FDNB(FDNB法法) )FDNB法的原理2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB）也叫做Sanger试剂。DNFB在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸（dinitro phenyl amino acid, DNP氨基酸）JILIN UNIVERSITY

11、RESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISM1仪器： 四元泵 waters； 柱温箱 无； 紫外可变双波长检测器 2487; 手动进样器; Millennia 工作站色谱柱：Zorbax Exclipse XDB 1504.6 mm 5 mm一仪器与试剂一仪器与试剂JILIN UNIVERSITYRESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISM仪器与试剂仪器与试剂保护柱： XDB C18 4.6x12.5mm Guard fitting Kit 化学试剂：氨基酸标样 250，500，1000 pmol/mL 1% FDBN（大连化物所可购）磷酸二

12、氢钾，碳酸氢钠，氢氧化钾，乙腈，重蒸水辅助品：2 mL棕色小瓶，pH试纸，恒温水浴箱，溶剂过滤器，样品过滤器，可变量程微量移液器(10-00 mL)。JILIN UNIVERSITYRESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISM二二 实验步骤实验步骤 衍生化：衍生化：于于2 mL棕色瓶里精确加入棕色瓶里精确加入30 m mL 不同浓度的不同浓度的 AA标样标样 ，30 m mL 0.5 N NaHCO3 (pH=9)和和 1% FDBN 10 mL，于，于 60 C暗处加热暗处加热 60 min。放置。放置室温，加室温，加 1 mL （ 0.01 N, pH=7.0）

13、KH2PO4，摇匀，待，摇匀，待HPLC分析。分析。HPLC 条件：条件：流动相流动相 A ：0.04 N KH2PO4 pH=7.2 流动相流动相B ：乙腈：乙腈/水水=55/45 (v/v)梯度：梯度：B：14% 4 min-10 min/40%-20 min/80%-21 min,100%, 流速：流速：1 mL/min检测波长：检测波长：360 nm ； 柱温：柱温：40 C； 进样量：进样量：10 m mL JILIN UNIVERSITYRESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISM二二 实验步骤实验步骤根据得到的数据，求算未知样品浓度完成实验报告思考题思考题为什么要保持反应溶液的碱性环境为什么要对氨基酸进行衍生化处理保护柱的作用是什么反相色谱分离的原理是什么实验中有哪些注意事项JILIN UNIVERSITYRESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISMmin0510152025mAU 020406080 ASP GLU DNP-OH SER HIS ARG GLY THR PRO ALA VAL MET CYS-S IIE LEU PHE LYS TYR实验结果实验结果