酶催化反应课件.ppt
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- 催化 反应 课件
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1、酶催化反应酶催化反应 酶是具有酶是具有高度选择性的催化剂高度选择性的催化剂,而一般情况下的酶反,而一般情况下的酶反应均是在温和条件下进行的(如常温、常压和中性溶液),应均是在温和条件下进行的(如常温、常压和中性溶液),酶的这些特性使酶能在酶的这些特性使酶能在食品、饮料和诊断工业食品、饮料和诊断工业中广泛应用。中广泛应用。 同样这些特性使酶能在各种同样这些特性使酶能在各种化合物的合成化合物的合成,尤其是在药,尤其是在药物、手性中间体、特殊的聚合物和生化物质合成中显示出了物、手性中间体、特殊的聚合物和生化物质合成中显示出了潜在的吸引力。潜在的吸引力。 酶作为一种特殊的催化剂正越来越受到人们的重视,
2、对酶作为一种特殊的催化剂正越来越受到人们的重视,对其应用研究也更趋广泛,从其应用研究也更趋广泛,从生物体系的酶生物体系的酶到到非生物体系的酶非生物体系的酶催化,从催化,从酶的固定化酶的固定化到到非水相酶反应非水相酶反应,酶的潜在能力正获得,酶的潜在能力正获得越来越多的开发和利用。越来越多的开发和利用。 7.1 酶和细胞的固定化酶和细胞的固定化7.1.1 酶和细胞的固定化方法酶和细胞的固定化方法固定化酶固定化酶:通过物理或化学的方法将溶液酶转变通过物理或化学的方法将溶液酶转变为在一定的空间内其运动受到为在一定的空间内其运动受到完全或局部约束完全或局部约束的一的一种种不溶于水不溶于水,但,但仍具活
3、性仍具活性的酶。它能以的酶。它能以固相状态固相状态作作用于底物进行催化反应。用于底物进行催化反应。固定化细胞固定化细胞:将完整的细胞将完整的细胞限定限定在一定空间内活在一定空间内活动的一种固定化生物催化剂。动的一种固定化生物催化剂。注意注意:由于是:由于是具有催化活性的蛋白质具有催化活性的蛋白质的固定化,所以必须严格的固定化,所以必须严格操作条件,尽可能操作条件,尽可能避免酶的高级结构受到损害避免酶的高级结构受到损害。7.1.1 酶和细胞的固定化方法酶和细胞的固定化方法常用方法常用方法:吸附法、包埋法、交联法、化学共价法、逆胶束包囊法等吸附法、包埋法、交联法、化学共价法、逆胶束包囊法等常用载体
4、常用载体:活性炭、多孔玻璃、纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙活性炭、多孔玻璃、纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、海藻酸盐、明胶、合成的高分子化合物等烯酰胺凝胶、海藻酸盐、明胶、合成的高分子化合物等1) 吸附法吸附法(最古老、最简便经济)特点:特点:蛋白质与载体之间的蛋白质与载体之间的结合力很弱结合力很弱在很多情况下,酶的非特异性吸附常会引起在很多情况下,酶的非特异性吸附常会引起部部分或全部失活分或全部失活,且高浓度的盐溶液或底物溶液又,且高浓度的盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质的将加速蛋白质的脱附脱附。吸附剂的种类(吸附剂的种类(1):):各种各种矿物质矿物质和其他和其他无机载体无机载
5、体:高岭土、多孔玻璃、:高岭土、多孔玻璃、氧化铝、二氧化硅等氧化铝、二氧化硅等蛋白质结合量通常很低蛋白质结合量通常很低纤维素纤维素粉:糖苷水解酶在纤维素上有较强的吸附粉:糖苷水解酶在纤维素上有较强的吸附离子交换剂离子交换剂(目前最常用目前最常用):羧甲基纤维素、):羧甲基纤维素、DEAE-纤纤维素、维素、DEAE-葡聚糖以及合成的离子交换剂等葡聚糖以及合成的离子交换剂等作用原理:作用原理:静电吸引静电吸引缺点:当缺点:当离子强度离子强度增加或者增加或者介质的介质的pH、温度、温度改变时,这种改变时,这种结合发生分解。结合发生分解。如果通过化学方法增加酶蛋白上的电荷则如果通过化学方法增加酶蛋白上
6、的电荷则可使这些影响得到改善。可使这些影响得到改善。第一个用于工业生产第一个用于工业生产的固定化酶:的固定化酶:固定化氨基酰化酶固定化氨基酰化酶将氨基酰化酶吸附在将氨基酰化酶吸附在DEAE-纤维素或纤维素或DEAE-葡聚糖上制得葡聚糖上制得。吸附剂的种类(吸附剂的种类(2):):吸附剂的种类(吸附剂的种类(3):):蛋白质载体蛋白质载体:胶原蛋白胶原蛋白是最常用的是最常用的一般胶原蛋白载体预先制成膜状(胶原膜),胶原膜溶一般胶原蛋白载体预先制成膜状(胶原膜),胶原膜溶胀,然后浸入酶溶液,酶渗入膜内并被吸附,制成酶膜。胀,然后浸入酶溶液,酶渗入膜内并被吸附,制成酶膜。生物特异性吸附剂生物特异性吸
7、附剂:如,如,伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白A-琼脂糖琼脂糖,可有效地固定一些以可有效地固定一些以糖蛋白为结构的酶糖蛋白为结构的酶。伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白A具有凝集红血球细胞和肿瘤细胞的作用,这种作用主要具有凝集红血球细胞和肿瘤细胞的作用,这种作用主要是由于伴刀豆球蛋白是由于伴刀豆球蛋白A能够与细胞表面上的单糖和低聚糖能够与细胞表面上的单糖和低聚糖发生特异性结合。因此,当琼脂糖上结合有伴刀豆球蛋发生特异性结合。因此,当琼脂糖上结合有伴刀豆球蛋白白A 以后,它就能够与溶液中的多糖和糖蛋白发生特异以后,它就能够与溶液中的多糖和糖蛋白发生特异性结合。性结合。2) 包埋法包埋法(普适性)包埋法:将酶包裹于
8、包埋法:将酶包裹于凝胶格子凝胶格子或或聚合物半透聚合物半透膜微胶囊膜微胶囊中的方法中的方法特点:特点: 酶分子本身不直接参加反应酶分子本身不直接参加反应 条件较条件较温和温和 酶酶活力回收较高活力回收较高 对对底物分子底物分子和和产物分子产物分子的大小的大小有限制,有限制,当当底物底物和产物的相对分子质量小时,扩散阻力就小。和产物的相对分子质量小时,扩散阻力就小。载体(载体(1):格子型包埋法载体):格子型包埋法载体常用的:常用的: 海藻酸盐、海藻酸盐、K-角叉菜、琼脂、三醋酸纤维角叉菜、琼脂、三醋酸纤维素和聚丙烯酰胺凝胶等素和聚丙烯酰胺凝胶等海藻酸盐海藻酸盐:价格便宜、来源丰富,无毒性,:价
9、格便宜、来源丰富,无毒性,目前应用较广目前应用较广特点特点:操作简便、条件温和操作简便、条件温和在在高浓度的电介质高浓度的电介质(K+、Na+等)溶液中,固定化等)溶液中,固定化颗粒会不稳定;颗粒会不稳定;Ca 2+等多价离子在磷酸缓冲液中会沉淀,固定化颗等多价离子在磷酸缓冲液中会沉淀,固定化颗粒的机械强度将降低,最后重新溶解。因此用此法包埋粒的机械强度将降低,最后重新溶解。因此用此法包埋的固定化酶或细胞的固定化酶或细胞不能用于磷酸缓冲溶液中不能用于磷酸缓冲溶液中。一般操作方法一般操作方法:先将先将海藻酸盐溶于水中海藻酸盐溶于水中,使其具有一定粘度;,使其具有一定粘度;然后然后加入一定量的细胞
10、菌体加入一定量的细胞菌体,并且充分搅拌,使之分,并且充分搅拌,使之分散均匀;散均匀;通过注射器或毛细管将此菌体悬浮液通过注射器或毛细管将此菌体悬浮液逐滴注入逐滴注入含有含有Ca 2+、Zn 2+、Al 3+等等多价离子的溶液多价离子的溶液中,由于离中,由于离子转移的胶凝作用,海藻酸盐液滴便形成珠状的固定子转移的胶凝作用,海藻酸盐液滴便形成珠状的固定化细胞颗粒。化细胞颗粒。待颗粒经过一定时间的待颗粒经过一定时间的硬化后洗净硬化后洗净,即可用于催化反,即可用于催化反应。应。聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶:蛋白质的固定量较高,:蛋白质的固定量较高,可达可达10100mg/g单体,目前常用的聚合单体,目
11、前常用的聚合物载体物载体特点特点:聚丙烯酰胺凝胶中聚丙烯酰胺凝胶中孔的大小分布很不均匀孔的大小分布很不均匀,因此,因此要要防止酶的漏失防止酶的漏失。调节单体和交联剂的用量可以调节单体和交联剂的用量可以改善聚丙烯酰胺凝改善聚丙烯酰胺凝胶的渗透性胶的渗透性。操作方法:操作方法:在含酶(或细胞)的水溶液中,加入一定比例的在含酶(或细胞)的水溶液中,加入一定比例的单单体体丙烯酰胺和丙烯酰胺和交联剂交联剂N,N-甲撑双丙烯酰胺;甲撑双丙烯酰胺;然后在然后在催化剂催化剂(二甲氨基丙腈)和(二甲氨基丙腈)和引发剂引发剂(过硫酸(过硫酸钾)的作用下低温(水浴)聚合;钾)的作用下低温(水浴)聚合;产生的聚合物凝
12、胶便是固定化酶,可通过产生的聚合物凝胶便是固定化酶,可通过机械方法机械方法分散分散成一定大小的粒子。成一定大小的粒子。载体(载体(2):微胶囊包埋材料):微胶囊包埋材料常用的:常用的: 火棉、尼龙、聚脲等火棉、尼龙、聚脲等半渗透的界面聚合物膜半渗透的界面聚合物膜如,将含有如,将含有1,6-二氨基己烷的二氨基己烷的酶水溶液分散酶水溶液分散到与水互不到与水互不相溶的含有己二酰二氯的相溶的含有己二酰二氯的有机溶剂有机溶剂中去,水相与有机相中去,水相与有机相界面上的二胺和二酰氯发生聚合,形成一个包围在水相界面上的二胺和二酰氯发生聚合,形成一个包围在水相酶溶液酶溶液珠滴珠滴外面的外面的聚酰胺薄膜聚酰胺薄
13、膜(即尼龙(即尼龙-6,6-薄膜)。薄膜)。 3) 交联法交联法交联法:利用:利用双功能基团试剂双功能基团试剂或或多功能基团试剂多功能基团试剂使酶使酶发生发生分子间交联分子间交联因而得到固定的方法。因而得到固定的方法。常用的试剂:戊二醛、常用的试剂:戊二醛、1,6-亚己基二异氰酸酯、双重亚己基二异氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯氮联苯胺和乙烯-马来酸酐共聚物等。马来酸酐共聚物等。双功能基团试剂与酶蛋白的交联作用,常引起双功能基团试剂与酶蛋白的交联作用,常引起蛋白蛋白质高级结构的改变质高级结构的改变,使,使酶失活酶失活。常在被交联的酶蛋白溶液中添加一定量的常在被交联的酶蛋白溶液中添加一定量的辅助蛋白辅
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