双向琼脂扩散试验原理课件.ppt

1、n5切实遵守实验室规则。n 凝集反应(agglutination)是经典的血清学反应，它是指颗粒性抗原例如细菌、红细胞等与相应的抗体在适量的电解质存在的条件下，经一定时间后凝聚成肉眼可见的凝集物。参加反应的颗粒性抗原称为凝集原(agglutinogen)，抗体称为凝集素(agglutinin)。 n 根据凝集反应中抗原的性质，反应的方式又分为直接凝集反应(direct agglutination)和间接凝集反应(indirect Or agglutination)。n 直接凝集反应有玻片法和试管法之分，而间接凝集反应则分为间接凝集抑制试验、反向间接凝集试验和协同凝集反应。n 由于抗原、抗体结合

2、具有高度的特异性，所以常利用凝集反应协助传染病的诊断、流行病学调查以及微生物分类、遗传研究等诸多方面。凝集反应n细菌、螺旋体或红细胞等颗粒性抗原，在适当电解质存在的条件下，可直接与相应的特异性抗体结合，出现凝集的现象，称为直接凝集反应（direct agglutination）。 n有玻片法和试管法之分.+电解质实验目的： 1掌握玻片凝集试验的操作方法，了解其特点和用途。 2学习玻片凝集试验结果的观察方法。 实验原理 玻片凝集试验是一种快速简便的检测方法，即抗原抗体的反应在玻片上进行，是一种定性的试验。一般用已知抗体检测未知抗原，也可用已知抗原检测未知抗体。 本试验用已知的伤寒杆菌、痢疾杆菌标

3、准诊断血清鉴定未知细菌。玻片法-菌种鉴定1伤寒杆菌诊断血清、痢疾杆菌诊断血清。2.菌种：待检菌斜面培养物（伤寒/痢疾）。3.其他：载玻片、接种环、盛消毒水的容器、记号笔、酒精灯等。 实验材料n 1用记号笔在干净的载玻片上均分二格并标明1，2。n 2无菌操作，用接种环分别于一、二格内各加23环伤寒杆菌、痢疾杆菌诊断血清。n 3用灭菌接种环自待测菌琼脂斜面上挑取少许细菌置第一格内，搅匀。接种环灭菌后同法取待检菌置于第二格内，混匀。n 4轻轻摇动玻片，12分钟后观察玻片凝集现象，记录结果。n 观察完毕，将玻片置于盛有消毒液的容器中。n如出现肉眼可见的均匀一致的凝集块者为阳性，仍为均匀一致乳浊液者为阴

4、性。注意事项 接种环在细菌培养斜面取菌前后均需严格灭菌，以免出现假阳性。实验目的1学习试管凝集反应试验的操作与观察结果的方法。2掌握血清凝集效价的定义。n抗原与不同稀释度的抗体在试管内直接结合而出现的凝集现象称为试管凝集反应。此法是一种定量法，可采用已知抗原(或抗体)来测定人体内相应抗体（或抗原）及其含量(效价或滴度)。 n本试验用已知的伤寒杆菌、抗原测定患者血清中相应抗体，根据凝集现象判断血清凝集效价，协助诊断伤寒、副伤寒。1.取16支小试管于试管架上排两排，并用记号笔标明管号。 2.用吸管吸取生理盐水，于各管内各加入0.5ml。 3.用lml吸管吸取伤寒杆菌待测免疫血清，于第1号试管内加入

5、0.5ml，并用此吸管将管内的液体吸放三次，使混合均匀。此时第1号管总体积为lml，稀释度为1：20。n 4.从第1号管吸取0.5mL稀释的免疫血清注入第2管，依上法混匀；再从第2管吸取0.5mL注入第3管，依次操作直至第7管，混匀后自第7管吸出0.5mL弃去。第8管不加血清，作为阴性对照，至此，17号试管的血清稀释度依次为1 20，1:40，1 5.于第一排每管内加入伤寒杆菌O菌液0.5mL ，第二排每管内加入伤寒杆菌菌液0.5mL，分别用1支吸管从第8号试管加起，逐个向前加至第1号管。此时，每管总量为lml。第17管的血清最终稀释度分别为10，10，1 160， ，1 6.摇匀，将试管置3

6、7温箱24小时后取出观察结果。实验目的n 1学习间接乳胶凝集试验的操作方法及其结果观察方法。n 2，了解抗“O”试验的基本原理。n链球菌感染后23周，8590的患者出现抗“O”抗体。所以，检测患者血清中抗“O”抗体的含量可以帮助诊断链球菌感染引起的疾病。n将链球菌溶血素“O”(SO)与羧化聚苯乙烯胶乳化学交联，链球菌溶血素“O”(ASO)高滴度病人血清中和适量的SO后，多余的ASO抗体即与SO致敏的胶乳抗原出现凝集反应，以测定血清中ASO滴度，用于链球菌感染的实验室诊断。n1已知抗原：溶血素“O”溶液及溶血素“O”胶乳试剂。n2待测血清、阳性血清、阴性血清。n3生理盐水。n4毛细滴管、刻度吸管

7、、试管、牙签、黑色玻璃反应板。n5 注射器、酒精棉球、离心机等。 1无菌静脉采血2mL，离心取血清备用。 2 将待测血清用生理盐水作1：50；1：80稀释备用。 3在黑色方格反应板上取四个格，用毛细滴管各加两个稀释倍数的待测血清、阳性血清、阴性血清一滴，然后各格均加一滴溶血素“O”溶液混合，摇动2分钟，最后各格再加溶血素“O”胶乳试剂一滴混合。 4在黑色反应板上用牙签充分混匀后，连续摇动八分钟观察结果。n实验结果及判定 阳性对照应出现清晰凝集，阴性对照仍为均匀乳胶状，待测血清如出现清晰凝集者为阳性反应，即抗“O”阳性，反之亦然。实验目的n 1了解直接凝集与间接凝集的区别，间接凝集与间接凝集抑制

8、的区别。n 2学习间接凝集抑制试验的操作方法。n可溶性抗原与相应抗体充分作用后再加入已知抗原致敏的载体颗粒，此时因抗体已被可溶性抗原结合，不再出现载体凝集现象。n临床上常用此试验作早期妊娠检查，具有灵敏、快速之优点。 +免疫妊娠实验：免疫妊娠实验：HCG：人绒毛膜促性腺激素：人绒毛膜促性腺激素n1.妊娠诊断抗原，为聚苯乙烯乳胶吸附了人类绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，HCG）的乳胶颗粒。n2.妊娠诊断抗原，为HCG免疫动物后得到的抗血清。n3. 待检妊娠尿。n4.反应板、滴管、记号笔等。实验结果与判定实验结果与判定出现均匀一致的细小凝集颗粒者为阴性

9、反应，仍为乳状液体者为阳性反应。 n沉淀反应(precipitation reaction)是指可溶性抗原(如细菌、外毒素、血清蛋白等)与相应抗体特异性结合后，在一定条件(适量的电解质、合适的酸碱度和温度)下，经一定时间，于比例合适处形成肉眼可见的沉淀现象。n沉淀反应可分为液体内沉淀反应和凝胶沉淀反应两种类型。n液体内沉淀反应分为环状沉淀反应、絮状沉淀反应和免疫浊度测定等。凝胶沉淀反应又分为琼脂扩散试验、免疫电泳等。n琼脂扩散试验有双向琼脂扩散试验、单向琼脂扩单向琼脂扩散试验、对流免疫电泳试验散试验、对流免疫电泳试验琼脂扩散试验实验目的n 1掌握琼脂扩散试验的基本原理及方法。n 2熟悉琼脂扩散

10、试验的临床应用。单向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验原理原理: 可溶性抗原与相应抗体在含适量电可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂凝胶解质的琼脂凝胶板的对应孔中，各自板的对应孔中，各自向向四周扩散四周扩散,若两者分子比例适当若两者分子比例适当,则在扩散则在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生成白的一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线色沉淀线.应用应用: 检测检测 AFP HBsAg, 协助疾病诊断协助疾病诊断.实验方法实验方法1打孔：取琼脂板，放于模板上，用3mm打孔器打孔，孔间距为5mm(按模板进行)，孔的排列方式如图所示。2加样：用微量加样器往中央孔加抗AFP诊断血清，a

11、、d孔加阳性对照血清，b、f孔加待测病人血清1， c、e孔加待测病人血清2，每孔各加10l。3将琼脂板平放于湿盒内(内放浸有05石炭酸的纱布以保持相对湿度)，置37温箱中，分别于24小时观察结果。 (a) (f) (b) (A) (e) (c) (d) n 对流免疫电泳又叫反向免疫电泳或免疫电渗电泳。其原理：带电的胶体颗粒可在电场中移动，其移动方向与胶体颗粒所带电荷有关。在pH86的琼脂凝胶中，抗体球蛋白等电点较高，只带有微弱的负电荷，而且分子较大，所以泳动慢，受电渗作用影响大, 往往不能抵抗电渗作用，故在电泳时，反而向阴极倒退。而抗原通常带有较多的负电荷，分子又小，所以泳动快，虽然由于电渗作用泳动速度减慢，但仍然向阳极泳动。如将抗原置阴极，抗体置阳极，电泳时两种成分相对泳动，一定时间后二者相遇，并于比例合适还形成肉眼可见的沉淀线。此种在双向琼脂扩散基础上加电泳的方法，称为对流免疫电泳。本实验常用于检查血清中抗原如AFP、HbsAg等，也可用于检查抗体效价、抗DNA抗体等的测定。板1.打孔：取琼脂板，放于模板上，用3mm打孔器打孔 (按模板进行)，孔的排列方式如图所示。2.加样：用微量加样器加样：