第二章-生物材料的预处理和细胞破碎及固液分离课件.ppt

1、第二章第二章生物材料的预处理生物材料的预处理和细胞破碎及固液分离和细胞破碎及固液分离概概 述述 微生物或动植物细胞在合适的培养基，值，微生物或动植物细胞在合适的培养基，值，温度和通气搅拌（或厌气）等发酵条件下进行生长温度和通气搅拌（或厌气）等发酵条件下进行生长和合成生物活性物质，因为在其培养（发酵）液中和合成生物活性物质，因为在其培养（发酵）液中包含了菌（细胞）体，胞内外代谢产物，胞内的细包含了菌（细胞）体，胞内外代谢产物，胞内的细胞物质及剩余的培养基残分等。胞物质及剩余的培养基残分等。 不管人们所需要的产物是胞内的还是胞外的或不管人们所需要的产物是胞内的还是胞外的或是菌体本身，都首先要进行培

2、养液的预处理和菌体是菌体本身，都首先要进行培养液的预处理和菌体回收，只有将固，液分离开，才能从澄清的滤液中回收，只有将固，液分离开，才能从澄清的滤液中采用物理、化学的方法提取代谢产物，或从细胞出采用物理、化学的方法提取代谢产物，或从细胞出发进行破碎、碎片分离和提取胞内产物。发进行破碎、碎片分离和提取胞内产物。l发酵（培养）结束后，首先将菌体或细胞、固态培养基等固态悬发酵（培养）结束后，首先将菌体或细胞、固态培养基等固态悬浮颗粒与可溶性组分分离，即浮颗粒与可溶性组分分离，即固液分离固液分离。l如固态悬浮颗粒较粗大，可直接进行。如固态悬浮颗粒较粗大，可直接进行。l如固态悬浮颗粒较细小，应先进行预处

3、理。如固态悬浮颗粒较细小，应先进行预处理。l如产物在胞内，还应先进行细胞破碎。如产物在胞内，还应先进行细胞破碎。第一节确定预处理方法的基本条件 一、了解生物活性物质存在的部位一、了解生物活性物质存在的部位l胞外：细胞产生后，分泌到培养液中胞外：细胞产生后，分泌到培养液中l胞内：游离在胞浆中、结合在质膜上等胞内：游离在胞浆中、结合在质膜上等二、稳定性二、稳定性l分离提取时，生物活性物质处于不断变化之中，可被细胞本身的分离提取时，生物活性物质处于不断变化之中，可被细胞本身的酶所破坏，或为微生物所分解，还可能在制备时受到酶所破坏，或为微生物所分解，还可能在制备时受到pHpH值、酸、值、酸、碱、温度、

4、金属离子、盐、机械搅拌等的作用。碱、温度、金属离子、盐、机械搅拌等的作用。l如青霉素稳定性较差，发酵液酸化如青霉素稳定性较差，发酵液酸化pHpH需控制在需控制在4.84.85.25.2，并且低温。，并且低温。l多粘菌素多粘菌素E E稳定性较好，可在稳定性较好，可在pH2.0pH2.0、9595处理，可处理，可提高过滤速度。提高过滤速度。三、提取工艺对滤液质量的要求三、提取工艺对滤液质量的要求l不同工艺路线对滤液要求不同不同工艺路线对滤液要求不同l离子交换法：无机离子、灰分要求低离子交换法：无机离子、灰分要求低l溶剂萃取法：要求蛋白质含量较低，减轻乳化溶剂萃取法：要求蛋白质含量较低，减轻乳化l直

5、接沉淀法：对滤液质量要求高，需反复过滤，直接沉淀法：对滤液质量要求高，需反复过滤，结晶前还要脱色处理。如四环类抗生素。结晶前还要脱色处理。如四环类抗生素。第二节生物材料的预处理预处理的目的预处理的目的（1 1）改变发酵液的物理性质改变发酵液的物理性质，以利于固液分离。，以利于固液分离。主要方法：加热、凝聚和絮凝。主要方法：加热、凝聚和絮凝。（2 2）去除发酵液中部分杂质（）去除发酵液中部分杂质（可溶性胶状物质可溶性胶状物质和和无机盐无机盐等），以利于后等），以利于后续各步操作。续各步操作。可溶性胶状物质：杂蛋白、核酸、不溶性多糖等，可可溶性胶状物质：杂蛋白、核酸、不溶性多糖等，可使溶液黏度增加

6、，影响固液分离速度及后续操作（如使溶液黏度增加，影响固液分离速度及后续操作（如堵塞层析柱头）。堵塞层析柱头）。一、菌丝体和蛋白质的处理一、菌丝体和蛋白质的处理 （一）等电点沉淀（一）等电点沉淀等电点时蛋白质溶解度最小（等电点时蛋白质溶解度最小（调调pHpH）（二）变性沉淀（二）变性沉淀变性蛋白质的溶解度较小，而产生沉淀变性蛋白质的溶解度较小，而产生沉淀加热加热：使蛋白质变性、凝聚，同时降低液体黏度，加快：使蛋白质变性、凝聚，同时降低液体黏度，加快过滤速度过滤速度l链霉素生产中，采用调链霉素生产中，采用调pHpH至酸性（至酸性（pH3.0pH3.0），加热至），加热至7070，维持半个小时的方法

7、来去除蛋白质，能使过滤速，维持半个小时的方法来去除蛋白质，能使过滤速度增大度增大10-10010-100倍，滤液粘度可降低倍，滤液粘度可降低1/61/6。l柠檬酸发酵液，采用加热至柠檬酸发酵液，采用加热至8080以上，使蛋白质变性凝以上，使蛋白质变性凝固和降低发酵液粘度，从而大大提高了过滤速度。固和降低发酵液粘度，从而大大提高了过滤速度。（三）加各种沉淀剂沉淀（三）加各种沉淀剂沉淀某些化学试剂能与蛋白质结合形成复合物沉淀，如三氯乙酸、水某些化学试剂能与蛋白质结合形成复合物沉淀，如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸等杨酸、苦味酸等（四）加入凝聚剂（四）加入凝聚剂（小分子）（小分子）可使细胞、细胞碎片及蛋白

8、质等胶体颗粒去除。可使细胞、细胞碎片及蛋白质等胶体颗粒去除。凝聚凝聚：在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层：在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。胶体粒子聚集的过程。胶体稳定的因素：电荷、水化层胶体稳定的因素：电荷、水化层电解质能中和电荷、破坏水化层电解质能中和电荷、破坏水化层与蛋白质盐析的机理相同。与蛋白质盐析的机理相同。发酵液的带电现象发酵液的带电现象l发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面，一般都带有电荷，带电的原因很多，

9、主表面，一般都带有电荷，带电的原因很多，主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。通要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力的作用使溶液中带相反电荷的粒于（即正引力的作用使溶液中带相反电荷的粒于（即正离子）被吸附在其周围，在界面上形成了离子）被吸附在其周围，在界面上形成了双电双电层层。l但是这些正离子还受到使它们均匀分布开去的但是这些正离子还受到使它们均匀分布开去的热运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，在热运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，在这两种相反作用的影响下，双电层就分裂成两这两种相反作用的影响下，双电层

10、就分裂成两部分，在相距胶核表面约一个离子半径的部分，在相距胶核表面约一个离子半径的sternstern平面以内，正离子被紧密束缚在胶核表面，称平面以内，正离子被紧密束缚在胶核表面，称为为吸附层吸附层或或sternstern层；在层；在sternstern平面以外，剩余平面以外，剩余的正离子则在溶液中扩散开去，距离越远，浓的正离子则在溶液中扩散开去，距离越远，浓度越小，最后达到主体溶液的平均浓度，称为度越小，最后达到主体溶液的平均浓度，称为扩散层扩散层。这样就形成了扩散双电层的结构模型。这样就形成了扩散双电层的结构模型。（五）加入絮凝剂（五）加入絮凝剂（高分子）（高分子）絮凝絮凝剂：天然或人工合

11、成的有机高分子化合物，具长链剂：天然或人工合成的有机高分子化合物，具长链线状结构，易溶于水，有大量的活性基团。线状结构，易溶于水，有大量的活性基团。吸附胶粒，产生吸附胶粒，产生架桥架桥连接，形成粗大的絮凝团，有助于连接，形成粗大的絮凝团，有助于过滤。过滤。可与凝聚剂配合使用，提高絮凝效果。可与凝聚剂配合使用，提高絮凝效果。影响因素：（影响因素：（1 1）分子量：链越长，吸附架桥效果越好，但自身在水）分子量：链越长，吸附架桥效果越好，但自身在水中溶解度也降低。中溶解度也降低。（2 2）用量：增加用量，有助于架桥，但过多会引起吸附饱和，降低）用量：增加用量，有助于架桥，但过多会引起吸附饱和，降低絮

12、凝效果。絮凝效果。（3 3）PHPH值：影响电离度，从而影响链的伸展形态。值：影响电离度，从而影响链的伸展形态。（4 4）搅拌速度和时间）搅拌速度和时间 ：适当搅拌，可使絮凝剂迅速分散，但过快会：适当搅拌，可使絮凝剂迅速分散，但过快会打碎絮凝团。打碎絮凝团。常用的絮凝剂常用的絮凝剂l聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（po1yacry1amidepo1yacry1amide）类和聚乙烯亚胺）类和聚乙烯亚胺（polyethyleneiminepolyethyleneimine）衍生物，根据活性基团在水中解离情况不同，）衍生物，根据活性基团在水中解离情况不同，可分为非离子型、阴离子型（含有羧基）和阳离子型（含

13、有胺基）可分为非离子型、阴离子型（含有羧基）和阳离子型（含有胺基）三类。由于聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用量少，一般以三类。由于聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用量少，一般以ppmppm计量，絮凝计量，絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度快以及种类多等优点，所以适用范体粗大，分离效果好，絮凝速度快以及种类多等优点，所以适用范围广。围广。l聚丙烯酸类阴离子絮凝剂和聚苯乙烯类衍生物。聚丙烯酸类阴离子絮凝剂和聚苯乙烯类衍生物。l无机高分子聚合物也是较好的一类絮凝剂，如聚合铝盐和聚合铁盐无机高分子聚合物也是较好的一类絮凝剂，如聚合铝盐和聚合铁盐等。等。l天然有机高分子絮凝剂天然有机高分子絮凝剂，如壳聚糖和葡聚糖等聚糖类，

14、还有明胶、，如壳聚糖和葡聚糖等聚糖类，还有明胶、骨胶、海藻酸钠等。骨胶、海藻酸钠等。l微生物絮凝剂微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂，它是一类由微生是近年来研究和开发的新型絮凝剂，它是一类由微生物产生的具有絮凝细胞功能的物质。主要成分是糖蛋白、粘多糖、物产生的具有絮凝细胞功能的物质。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合纤维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。成的絮凝剂相比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。凝聚和絮凝凝聚和絮凝：均是破坏发酵液中胶体的稳定性，：均是破坏

15、发酵液中胶体的稳定性，增大颗粒尺寸，增大颗粒的沉降或浮选速率。增大颗粒尺寸，增大颗粒的沉降或浮选速率。（六）吸附（六）吸附加入反应剂，相互反应生成沉淀，能吸附蛋白质和加入反应剂，相互反应生成沉淀，能吸附蛋白质和菌体等胶粒，同时起助滤剂作用。菌体等胶粒，同时起助滤剂作用。如四环素发酵液中加入黄血盐和硫酸锌，生成亚铁氰化锌钾如四环素发酵液中加入黄血盐和硫酸锌，生成亚铁氰化锌钾K K2 2ZnZn3 3Fe(CN)Fe(CN)5 5 2 2的胶状沉淀，能将杂蛋白和菌体黏附而除的胶状沉淀，能将杂蛋白和菌体黏附而除去。去。 在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢二钠，这两者在枯草杆菌发酵液中，常加入氯

16、化钙和磷酸氢二钠，这两者本身生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其它不溶性粒子本身生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，从而加快了过滤速度。吸附并包裹在其中而除去，从而加快了过滤速度。（七）酶解法去除（七）酶解法去除不溶性多糖不溶性多糖 不溶性多糖会增大溶液黏度，使固液分离困难，可加入淀粉酶进行不溶性多糖会增大溶液黏度，使固液分离困难，可加入淀粉酶进行水解，将发酵液中多余淀粉水解。水解，将发酵液中多余淀粉水解。二、高价金属离子的去除二、高价金属离子的去除 对提取和成品质量影响较大。对提取和成品质量影响较大。（一）离子交换法（一）离子交换法通过阳离子树脂通过阳离子树脂

17、l如四环素发酵液通过如四环素发酵液通过122122型树脂，除去型树脂，除去FeFe3+3+ ，同时也吸附色素，同时也吸附色素，提高滤液质量。提高滤液质量。（二）沉淀法（二）沉淀法形成不溶性沉淀形成不溶性沉淀l去除去除CaCa2+2+，常用草酸钠或草酸，形成草酸钙沉淀，常用草酸钠或草酸，形成草酸钙沉淀l去除去除MgMg2+2+，可用草酸、磷酸盐、三聚磷酸钠等，可用草酸、磷酸盐、三聚磷酸钠等l去除去除FeFe3+3+，加入黄血盐，形成普鲁士蓝沉淀，加入黄血盐，形成普鲁士蓝沉淀问题问题1 1、改变发酵液过滤特性的主要方法有哪些？其简要机理如何？、改变发酵液过滤特性的主要方法有哪些？其简要机理如何？2

18、 2、除去发酵液中杂蛋白的常用方法有哪些？、除去发酵液中杂蛋白的常用方法有哪些？3 3、如何去除发酵液中的多糖、金属离子？、如何去除发酵液中的多糖、金属离子？4 4、凝聚和絮凝有哪些不同之处？、凝聚和絮凝有哪些不同之处？第三节第三节 细胞破碎细胞破碎 一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞之一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞之外的液相中（称胞外酶），这些产品主要为医药和外的液相中（称胞外酶），这些产品主要为医药和保健产品，如保健产品，如胰岛素、某些细胞因子和疫苗亚单位胰岛素、某些细胞因子和疫苗亚单位成分等成分等。 这些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培这些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌

19、到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可。其后续分离和纯化都相对简单。可。其后续分离和纯化都相对简单。细胞破碎细胞破碎 胞内产物：青毒素酰化酶、碱性磷脂酶等胞内产物：青毒素酰化酶、碱性磷脂酶等但由于一些重组但由于一些重组DNADNA（rDNArDNA）产品结构复杂，）产品结构复杂，必须必须在细胞内组装来获得生物活性在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有

20、所改变，此类此类rDNArDNA产品是细胞内产品（非分泌型），需要应产品是细胞内产品（非分泌型），需要应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。备工作。 几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物药物名称宿主用途胰岛素大肠杆菌治疗糖尿病人生长激素（HGH）大肠杆菌治疗侏儒病-干扰素大肠杆菌治疗毛状细胞白血病和卡波济肉瘤 细胞破碎（细胞破碎（cell rupturecell rupture）技术是指利用外力破坏细技术是指利用外力破坏

21、细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。出来的技术。l胞内的生物活性物质的稳定性差胞内的生物活性物质的稳定性差, ,条件不适极易失活。条件不适极易失活。特别是微生物细胞十分微小特别是微生物细胞十分微小, ,细胞壁结构比较紧密细胞壁结构比较紧密, ,一一般方法不易将细胞打破般方法不易将细胞打破, ,有些技术虽然可以有些技术虽然可以, ,但条件严但条件严苛苛, ,胞内生物活性物质在此条件下很易失活胞内生物活性物质在此条件下很易失活, ,限制了一限制了一些技术的应用。些技术的应用。l在一定程度上细胞破碎仍是生物技术产业化关键技术。在一

22、定程度上细胞破碎仍是生物技术产业化关键技术。 细胞破碎细胞破碎细胞破碎细胞破碎 l通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁细胞壁。l基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。不同，细胞破碎的难易程度也就不同。l此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中

23、应碎过程中应防止变性防止变性和被胞内的和被胞内的酶水解酶水解，因此，破，因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。细胞壁的成分细胞壁的成分l细菌细胞壁主要成分是细菌细胞壁主要成分是肽聚糖肽聚糖l革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖层组成（革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖层组成（202080nm)80nm)，较难，较难破碎。破碎。l革兰氏阴性菌的细胞壁的肽聚糖层较薄（革兰氏阴性菌的细胞壁的肽聚糖层较薄（2 23nm)3nm)，还有两层外，还有两层外壁层。壁层。肽聚糖（peptidoglycan） 肽聚糖肽聚糖是难溶性的是难溶性的聚糖链聚糖链（glyc

24、an chainglycan chain），借助），借助短肽交联而成的网状结构，短肽交联而成的网状结构，包围在细胞周围，使细胞包围在细胞周围，使细胞具有一定的形状和强度。具有一定的形状和强度。 短肽一般由四或五个氨短肽一般由四或五个氨基酸组成，如基酸组成，如L-L-丙氨酰丙氨酰-D-D-谷氨酰谷氨酰-L-L-赖氨酰赖氨酰-D-D-丙氨丙氨酸。而且短肽中常有酸。而且短肽中常有D-D-氨氨基酸与二氨基庚二酸存在。基酸与二氨基庚二酸存在。l破碎细菌的主要阻力是来自于破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存其网结构的致密程度和强度取决于聚糖

25、链上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。大，则网结构就致密。细胞壁的成分细胞壁的成分l霉菌细胞壁较厚，100205nm，多数由几丁质和葡聚糖构成。l酵母细胞壁主要成分是葡聚糖，还含有甘露糖、蛋白质和几丁质。幼时较薄，以后逐渐变硬。较革兰氏阳性菌的细胞壁更厚，更难破碎。l藻类的细胞壁非常复杂，主要结构是纤维状的多糖物质。其强度取决于聚合物网状结构的交联程度。细胞破碎方法细胞破碎方法液体裁切：超声波、搅拌、压力液体裁切：超声波、搅拌、压力机械法机械法固体裁切：研磨、压力固体裁切：研磨、压力细胞破碎细胞破碎 干燥：空气、真空、冷

26、冻、喷雾干燥：空气、真空、冷冻、喷雾非机械法非机械法溶胞：物理法、化学法、酶法溶胞：物理法、化学法、酶法高压匀浆器高压匀浆器操作原理操作原理它 由 可 产 生 高 压 的 正 向它 由 可 产 生 高 压 的 正 向 排 代 泵排 代 泵 （ p o s i t i v e p o s i t i v e displacenemt pumpdisplacenemt pump）和）和排出阀排出阀（discharge valvedischarge valve）组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在细胞浆

27、液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。碎。在操作方式上，可以采用在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环单次通过匀浆器或多次循环通过等方式通过等方式，也可连续操作。，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在使出口温度调节在2020左右。左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等

28、难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。作方法。高压匀浆法高压匀浆法l影响细胞破碎的主要因素：压力、循环次数、温度。影响细胞破碎的主要因素：压力、循环次数、温度。l操作压力：操作压力：505070MPa70MPa，一般为，一般为55MPa55MPal一次破碎率：一次破碎率：12%12%67%67%，达到，达到90%90%要多次要多次l提高操作压力，有利于破碎，减少循环次数提高操作压力，有利于破碎，减少循环次数l温度由温度由55提高到提高到3030，酵母破碎率提高，酵母破碎率提高1.51.5倍倍l适用于适用于酵母酵母和大多数

29、和大多数细菌细菌的破碎。的破碎。l不适用于不适用于高度分枝高度分枝的微生物，因为会堵塞阀。的微生物，因为会堵塞阀。高压匀浆法高压匀浆法l细胞种类、生长环境、生长速率和产物位置对操作条件的影响细胞种类、生长环境、生长速率和产物位置对操作条件的影响l大肠杆菌较酵母易破碎大肠杆菌较酵母易破碎l生长在复杂培养基的大肠杆菌比生长在合成培养基中的大肠杆菌难破生长在复杂培养基的大肠杆菌比生长在合成培养基中的大肠杆菌难破碎碎l非结合酶处理一次即可（压力非结合酶处理一次即可（压力54.5MPa54.5MPa，菌体浓度，菌体浓度10%10%20%20%），膜结合），膜结合酶则需酶则需3 3次破碎。次破碎。l大肠杆

30、菌的破碎效果随生长速率的减少而降低。大肠杆菌的破碎效果随生长速率的减少而降低。高压匀浆器的操作温度上升约高压匀浆器的操作温度上升约/10MPa/10MPa为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷却为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷却处理。处理。多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效防多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效防止温度上升，保护产物活性。止温度上升，保护产物活性。高压匀浆法使用时注意事项高压匀浆法使用时注意事项高速珠磨法高速珠磨法l利用细胞与玻璃小珠在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间以及珠利用细胞与玻璃小珠在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切、

31、碰撞，促使细胞壁破裂。子和细胞之间的互相剪切、碰撞，促使细胞壁破裂。高速珠磨机工作原理高速珠磨机工作原理l水平位置的磨室内放置玻离小珠，装在水平位置的磨室内放置玻离小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动，细胞的胞悬浮液和玻离小珠相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起。滚动而引起。l在料液出口处，旋转园盘和出口平板之在料液出口处，旋转园盘和出口平板之间的狭缝很小，可阻挡玻离小珠，使不间的狭缝很小，可阻挡玻离小珠，使不被料液带出。被料液带出。l由于操作过程中会产生热量，易造成某

32、由于操作过程中会产生热量，易造成某些生化物质破坏，故磨室还装有冷却夹些生化物质破坏，故磨室还装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻离小珠。套，以冷却细胞悬浮液和玻离小珠。高速珠磨法高速珠磨法l影响因素有：搅拌速度、料液循环速度、细胞浓度、珠粒大小和数量、影响因素有：搅拌速度、料液循环速度、细胞浓度、珠粒大小和数量、温度等。温度等。l提高搅拌速度、降低细胞浓度、增加小珠装量。提高搅拌速度、降低细胞浓度、增加小珠装量。l过大搅拌速度和过多的小珠会增大能耗，产热增加过大搅拌速度和过多的小珠会增大能耗，产热增加l磨珠越小、破碎速度越快，但磨珠太小易于漂浮。磨珠越小、破碎速度越快，但磨珠太小易于漂浮。l对对

33、真菌菌丝真菌菌丝和和藻类藻类的细胞破碎效果较好。的细胞破碎效果较好。超声波法超声波法（Ultrasonication)l超声波破碎法利用超声波振荡器发射的超声波破碎法利用超声波振荡器发射的15-25kHz15-25kHz的超的超声波探头处理细胞悬浮液。声波探头处理细胞悬浮液。l超声波振荡器有不同的类型，常用的为电声型，它是超声波振荡器有不同的类型，常用的为电声型，它是由发生器和换能器组成，发生器能产生高频电流，换由发生器和换能器组成，发生器能产生高频电流，换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。l超声波振荡器以可分为槽式和超声波振荡器以可分为槽式和探头直接

34、插入介质探头直接插入介质两种两种型式，一般破碎效果后者比前者好。型式，一般破碎效果后者比前者好。超声波法超声波法（Ultrasonication)l超声波在流体中传播时，出现细小的空穴，又迅速闭超声波在流体中传播时，出现细小的空穴，又迅速闭合，产生强烈的冲击波压力，在悬浮细胞上造成剪切合，产生强烈的冲击波压力，在悬浮细胞上造成剪切力，使细胞破碎。力，使细胞破碎。l超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。的破碎。l超声波破碎的有效能量利用率极低，操作过程超声波破碎的有效能量利用率极低，操作过程产生大产生大量的热量的热，因此操作需在冰水或

35、外部冷却的容器中进行。，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，主要用由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，主要用于于实验室规模实验室规模的细胞破碎。的细胞破碎。化学法化学法l化学试剂溶解细胞或抽提某些细胞组分。化学试剂溶解细胞或抽提某些细胞组分。l碱处理：溶解除细胞壁外的大部分组分。碱处理：溶解除细胞壁外的大部分组分。l脂溶性有机溶剂：溶解细胞膜上脂类化合物。如丁醇、丙酮、氯脂溶性有机溶剂：溶解细胞膜上脂类化合物。如丁醇、丙酮、氯仿等。仿等。l表面活性剂（两性化合物）：细胞溶解或使某些组分从细胞中渗表面活性剂（两性化合物）：细胞溶解或使某些组分从细胞

36、中渗透出来。如透出来。如SDSSDS等。等。l化学法对产物的释出选择性好，细胞外形较完整，碎化学法对产物的释出选择性好，细胞外形较完整，碎片少，核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离等优点，片少，核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离等优点，故使用较多。故使用较多。l但但该法容易引起活性物质失活破坏该法容易引起活性物质失活破坏，因此，根据生化，因此，根据生化物质的稳定性来选择合适的化学试剂和操作条件是非物质的稳定性来选择合适的化学试剂和操作条件是非常重要的。常重要的。l另外，化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来另外，化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难困难，并影响最终产物纯度。如表面活性剂

37、存在常会，并影响最终产物纯度。如表面活性剂存在常会影响盐析中蛋白质的沉淀和疏水层析，因此必须注意影响盐析中蛋白质的沉淀和疏水层析，因此必须注意除去。除去。化学法化学法酶解法酶解法l酶促反应破坏细胞壁上的特殊化学键，以达到破酶促反应破坏细胞壁上的特殊化学键，以达到破壁的目的。壁的目的。l加入酶或自溶。加入酶或自溶。l优点：（优点：（1 1）产品释放的选择性高）产品释放的选择性高（2 2）抽提的速率和收率高）抽提的速率和收率高（3 3）产品的破坏最少）产品的破坏最少（4 4）反应条件温和）反应条件温和（5 5）不残留细胞碎片）不残留细胞碎片, ,细胞外形较完整细胞外形较完整l缺点：缺点：成本高成本

38、高，可用固定化酶反应使用。，可用固定化酶反应使用。酶解法酶解法l选择适宜的酶和酶系统，控制特定的反应条件，特定选择适宜的酶和酶系统，控制特定的反应条件，特定的生长阶段。的生长阶段。l微生物细胞，常用微生物细胞，常用溶菌酶。溶菌酶。专一分解细胞壁上的专一分解细胞壁上的1,41,4糖苷键。糖苷键。l自溶：自溶：利用生物体利用生物体自身产生的酶自身产生的酶来溶胞，而不需外加来溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代谢过程中，大多数都能产生一其他的酶。在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。可是，改变其生长环境，可

39、以诱发产生过剩的这去。可是，改变其生长环境，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。可可采用采用加热法加热法或或干燥法干燥法。l采用采用抑制细胞壁合成抑制细胞壁合成的方法。的方法。( (如生物素的营养缺陷型如生物素的营养缺陷型) )物理法（渗透压冲击法）物理法（渗透压冲击法）l先把细胞放在高渗溶解中，使水分外渗，再转入水或缓冲液中，先把细胞放在高渗溶解中，使水分外渗，再转入水或缓冲液中，使水分迅速渗入，细胞快速膨胀而破裂。使水分迅速渗入，细胞快速膨胀而破裂。l蛋白质释放量仅为菌体蛋白总量的蛋白质释放量仅为菌体蛋白总量的4%4%

40、7%7%。l是较温和的一种破碎方法，是较温和的一种破碎方法，此法对革兰氏阳性菌不适用此法对革兰氏阳性菌不适用。物理法（冻结融化法）物理法（冻结融化法）l将细胞放在低温下冷冻（将细胞放在低温下冷冻（-15-15），在室温中融化，反复多次，），在室温中融化，反复多次，使细胞壁破裂。使细胞壁破裂。l一方面，冷冻过程会促使细胞膜的疏水键结构破裂。一方面，冷冻过程会促使细胞膜的疏水键结构破裂。l另一方面，冷冻时胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破另一方面，冷冻时胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。裂。l蛋白质释放率仅蛋白质释放率仅10%10%左右。左右。干燥法干燥法l菌体干燥后，细胞膜的渗透

41、性发生变化，部分菌体自溶，再用丙菌体干燥后，细胞膜的渗透性发生变化，部分菌体自溶，再用丙酮、丁醇或缓冲液等抽提。酮、丁醇或缓冲液等抽提。l空气干燥：空气干燥：25253030热空气吹干。常用于酵母菌。热空气吹干。常用于酵母菌。l真空干燥：常用于细菌。真空干燥：常用于细菌。l冷冻干燥：不稳定的活性物质。冷冻干燥：不稳定的活性物质。细胞破碎率的评价细胞破碎率的评价细胞破碎率：被破碎细胞占原始细胞数量的百分数。（N0N）Y（%） 100%N0Y：破碎率N0:原始细胞数量N：经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量。直接计数法直接计数法l直接对稀释后的样品计数。直接对稀释后的样品计数。l采用平板计数

42、或血球计数板，通过显微镜观察染色细胞的数量。采用平板计数或血球计数板，通过显微镜观察染色细胞的数量。l平板计数所需时间长，只有活细胞才能计数。死亡的完整细胞虽量大但平板计数所需时间长，只有活细胞才能计数。死亡的完整细胞虽量大但未能计数。未能计数。l显微镜计数：快速而简单，但难区分未损害细胞和稍有损害细胞。显微镜计数：快速而简单，但难区分未损害细胞和稍有损害细胞。l可用涂片法染色。革兰氏试剂染色后，完整细胞呈红色或无色，细胞碎可用涂片法染色。革兰氏试剂染色后，完整细胞呈红色或无色，细胞碎片呈绿色。片呈绿色。间接计数法间接计数法l细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（如可溶细胞破碎后，

43、测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（如可溶性蛋白、酶等）。性蛋白、酶等）。l将破碎后的细胞悬浮液离心分离，去掉固体（完整细胞和碎片），将破碎后的细胞悬浮液离心分离，去掉固体（完整细胞和碎片），对清液进行含量或活性分析。对清液进行含量或活性分析。l最常用是蛋白质含量，或某种酶的活性等。最常用是蛋白质含量，或某种酶的活性等。常用细胞破碎方法比较表常用细胞破碎方法比较表方方法法技术技术原理原理效果效果成本成本举例举例非非机机械械法法渗透冲击渗透冲击渗透压破坏细胞壁渗透压破坏细胞壁温和温和便宜便宜血红细胞的破坏血红细胞的破坏酶解法酶解法细胞壁被酶消化细胞壁被酶消化温和温和昂贵昂贵增溶法增溶法表面活性

44、剂溶解细表面活性剂溶解细胞壁胞壁温和温和适中适中胆盐作用于大肠杆胆盐作用于大肠杆菌菌脂溶法脂溶法有机溶剂溶解细胞有机溶剂溶解细胞壁壁适中适中便宜便宜甲苯破碎酵母细胞甲苯破碎酵母细胞碱处理法碱处理法碱的皂化作用使细碱的皂化作用使细胞壁溶解胞壁溶解温和温和便宜便宜机机械械法法高压匀浆高压匀浆使细胞通过小孔使细胞通过小孔激烈激烈适中适中大规模处理大规模处理高速珠磨高速珠磨细胞被珠子研磨细胞被珠子研磨激烈激烈便宜便宜大规模处理大规模处理超声波超声波超声波的空穴作用超声波的空穴作用激烈激烈昂贵昂贵小规模处理小规模处理细胞破碎方法比较细胞破碎方法比较l机械法：大规模处理，产热大机械法：大规模处理，产热大l

45、化学法：所用溶剂不得对活性物质产生损害化学法：所用溶剂不得对活性物质产生损害l酶法：条件温和，成本高酶法：条件温和，成本高l渗透压冲击和冻融法：破碎作用较弱渗透压冲击和冻融法：破碎作用较弱l干燥法：较剧烈，易变性失活干燥法：较剧烈，易变性失活选择破碎方法原则选择破碎方法原则l破碎细胞的目的、提取产物的类型、产物在细胞中的位置、细胞破碎细胞的目的、提取产物的类型、产物在细胞中的位置、细胞的数量和细胞壁的强度、产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶的数量和细胞壁的强度、产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等）的敏感性、要达到的破碎率、破碎的速度、规模应用、后期等）的敏感性、要达到的破碎率、破碎的速度、规

46、模应用、后期提取。提取。l细胞碎片的大小细胞碎片的大小l产物释放率、低的能耗、便于后步提取产物释放率、低的能耗、便于后步提取问题问题（1 1）常用细胞破碎方法的原理、特点及适用性。）常用细胞破碎方法的原理、特点及适用性。（2 2）简述破碎方法的选择依据。）简述破碎方法的选择依据。第四节第四节发酵液的固液分离发酵液的固液分离l固液分离：指将发酵液（培养液）中的悬浮固体，如细胞、菌体、固液分离：指将发酵液（培养液）中的悬浮固体，如细胞、菌体、细胞碎片以及蛋白质等的沉淀物或它们的絮凝体分离除去。细胞碎片以及蛋白质等的沉淀物或它们的絮凝体分离除去。过滤过滤沉降沉降离心离心过滤过滤l利用多孔性介质（如滤

47、布）截留固液悬浮液中的固体粒子。利用多孔性介质（如滤布）截留固液悬浮液中的固体粒子。 常规过滤常规过滤 错流过滤错流过滤常规过滤常规过滤l料液流动方向与过滤介质垂直。料液流动方向与过滤介质垂直。常规过滤常规过滤l阻力：过滤介质和滤饼，后者为主要因素。阻力：过滤介质和滤饼，后者为主要因素。l提高速度过滤和过滤质量。提高速度过滤和过滤质量。l预处理：絮凝、凝聚等预处理：絮凝、凝聚等l使用助滤剂使用助滤剂助滤剂助滤剂（1 1）无毒，惰性物质）无毒，惰性物质（2 2）颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的固体颗粒。）颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的固体颗粒。l可使滤饼具格子结构，不可压缩，滤孔不会被全部堵可使滤

48、饼具格子结构，不可压缩，滤孔不会被全部堵塞，保持良好渗透性。既能使发酵液中的细小颗粒截塞，保持良好渗透性。既能使发酵液中的细小颗粒截留在格子骨架上，又能使清液有流畅的沟道。留在格子骨架上，又能使清液有流畅的沟道。（3 3）来源方便，成本低廉。）来源方便，成本低廉。l常用的有硅藻土、珍珠岩、纤维素、石棉等。常用的有硅藻土、珍珠岩、纤维素、石棉等。错流过滤错流过滤l料流流动的方向与过滤介质平行，能清除过滤介质表面的滞留物，料流流动的方向与过滤介质平行，能清除过滤介质表面的滞留物，使滤饼不易形成，保持较高的滤速。使滤饼不易形成，保持较高的滤速。l过滤介质通常为微孔膜或超滤膜。过滤介质通常为微孔膜或超

49、滤膜。l优点：优点：（1 1）收率高）收率高（97-98%97-98%）（2 2）滤液质量好）滤液质量好（3 3）减少处理步骤）减少处理步骤（4 4）容易进行扩大生产）容易进行扩大生产板框压滤机板框压滤机板框压滤机板框压滤机l优点：过滤面积大，能耐受较高压力差，适应性强（对不同性质的料优点：过滤面积大，能耐受较高压力差，适应性强（对不同性质的料液），结构简单，造价较低，动力消耗少液），结构简单，造价较低，动力消耗少l缺点：不能连续操作，设备笨重，占地面积大，非生产的辅助时间长缺点：不能连续操作，设备笨重，占地面积大，非生产的辅助时间长（解框、卸饼、洗滤布、重新压紧板框等）、劳动强度大，生产能力

50、（解框、卸饼、洗滤布、重新压紧板框等）、劳动强度大，生产能力低。低。l自动板框压滤机：能自动清除滤饼，缩短非生产时间，减轻了劳动强自动板框压滤机：能自动清除滤饼，缩短非生产时间，减轻了劳动强度度真空鼓式过滤机真空鼓式过滤机真空鼓式过滤机真空鼓式过滤机l优点：优点：连续操作，可自动控制连续操作，可自动控制l基本原理：基本原理：真空吸滤真空吸滤l分四个阶段：分四个阶段：吸滤、洗涤、吸干、卸渣吸滤、洗涤、吸干、卸渣l压力差较小，主要适用于菌丝较粗的真菌，对菌丝较细或黏稠的压力差较小，主要适用于菌丝较粗的真菌，对菌丝较细或黏稠的发酵液，需预铺助滤剂。发酵液，需预铺助滤剂。centrigugal sep