茶叶生物技术-第二章茶树细胞工程-叶1[124页课件.ppt

1、 主要内容主要内容植物细胞工程的概念；茶树细胞工程的应用领域；细胞工程的基本理论依据及技术基础；组织与器官培养的概念；离体培养在植物育种中的应用；培养的步骤与方法；营养繁殖体的增殖；茶树细胞培养；茶树次生代谢产物的研究；细胞培养及其突变体筛选；农业上有用性状的突变体离体筛选；茶树原生质体培养和细胞融合；原生质体的分离；原生质体的培养；原生质体的融合；原生质融合体的生长发育；杂种细胞的筛选；体细胞杂种植株的鉴定。 植物细胞工程（plant cell engineering）是生物技术中的重要分支，是指在植物细胞水平上进行的遗传操作，是现代遗传学、植物细胞生物学和分子生物学的一个复杂集合体。它是以

2、生命科学为基础，利用生物体系和工程原理生产生物制品和创造新物种的综合性科学技术，是以植物组织培养和细胞的离体操作为基础的实验性很强的一门新兴学科。茶树细胞工程的应用主要有以下几个方面：（1）幼胚、胚珠和子房以及试管受精克服远缘杂交不育性（2）花药、花粉培养进行单倍体育种（3）原生质体融合产生体细胞杂种，扩大遗传变异范围（4）次生代谢产物生产（5）应用基因工程技术获得转基因植株，进行茶树品种改良（6）快速繁殖（7）种质资源保存植物植物组织和器官培养组织和器官培养 n 第一节第一节 植物组织培养的一般概念植物组织培养的一般概念n 第二节第二节 植物组织培养的发展植物组织培养的发展n 第三节第三节

3、植物组织培养的应用植物组织培养的应用2022-6-64第一节第一节 植物组织培养的一般概念植物组织培养的一般概念2022-6-65 一、植物细胞组织培养的概念一、植物细胞组织培养的概念 植物细胞组织培养植物细胞组织培养（Plant Cell and Tissue Culture）：是指是指在离体在离体（in vitro）条件下利用人工培养基条件下利用人工培养基（medium）对对植物器官、组织、细胞、原生质体等进行培养，使其植物器官、组织、细胞、原生质体等进行培养，使其长成完整的植株。长成完整的植株。 通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体explant）

4、，接种到培养基上，在人工控制的条件下（包），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。产生完整植株的过程。2022-6-66l主要有主要有:原生质体（原生质体（Protoplast）培养）培养悬浮细胞培养悬浮细胞培养组织（愈伤组织组织（愈伤组织Callus、茎尖分生组织）培、茎尖分生组织）培养养器官（胚，花药，子房，根和茎）培养器官（胚，花药，子房，根和茎）培养l其中最常见的是愈伤组织培养。其中最常见的是愈伤组织培养。2022-6-67（广义）又叫离体培养（广义）又叫离体培养：指从植物体

5、分离出指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。的其他产品的技术。 （狭义）组织培养（狭义）组织培养：指用植物各部分组织，指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生各器官上产生愈伤组织愈伤组织的培养，愈伤组织再的培养，愈伤组织再经过再

6、分化形成再生植物。经过再分化形成再生植物。 原指植物在受伤之后于伤原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指在离体培养过程在组培中则指在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在植物体切面不规则细胞，多在植物体切面上产生。上产生。愈伤组织愈伤组织（callus）2022-6-69外植体（外植体（explantexplant）：）：在植物细胞组织培养中，由活体（in vivo）植物体上取下来的，接种在培养基上无菌细胞、组织器官等用于离体培养的材料。胚轴胚轴花粉花粉胚乳胚乳胚胚种子种子果实果实叶叶芽芽茎茎根根组织组织

7、原生质体原生质体子叶子叶分生组织分生组织成熟组织成熟组织花器花器子房子房苞片苞片胚珠胚珠花药花药花梗花梗花托花托叶柄叶柄幼苗幼苗二、植物组织培养的分类二、植物组织培养的分类固体培养固体培养液体培养液体培养 1. 培养基培养基固体培养固体培养液体培养液体培养2022-6-611 培养基(Culture Medium) 培养基是植物组织培养的重要基质。培养基是植物组织培养的重要基质。 培养基的成分主要可以分水、无机培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、盐、有机物、天然复合物、培养体的支培养体的支持材料持材料等五大类。等五大类。2022-6-612l培养基培养基（1 1）植物细胞的生

8、长和代谢需要大量无机盐；）植物细胞的生长和代谢需要大量无机盐；（2 2）植物细胞需要多种维生素和植物生长激素；）植物细胞需要多种维生素和植物生长激素；（3 3）植物细胞需求的氮源一般为无机氮源；）植物细胞需求的氮源一般为无机氮源；（4 4）植物细胞一般以蔗糖为碳源、浓度为）植物细胞一般以蔗糖为碳源、浓度为2-5%2-5%。2022-6-6 国际上流行的培养基有几十种，常用的国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基有：培养基有： MSMS培养基培养基、B5培养基培养基、White培养基培养基、N6培养基培养基、KM-8PKM-8P培养基培养基2022-6-614常用培养基简介1）MS培养基 19

9、621962年由年由MurashigeMurashige和和SkoogSkoog为培养烟草细为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝硝酸盐酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。好。有些培养基是由它演变而来的。2022-6-615MS培养基配

10、制方法2022-6-616不同营养条件对植物组织培养的影响 生长良好的愈伤组织生长良好的愈伤组织无蔗糖无蔗糖蔗糖浓度只有蔗糖浓度只有1%蔗糖浓度有蔗糖浓度有5%T h e e x p l a n t i s completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus愈伤组织.Shoots developed on edges of upper sur

11、face, a n d s o m e r o o t development has occuredShoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control medium相关知识2022-6-617No MS saltsNo sign of regeneration from explant at all. MS salts reduced to 0.47 g. l-1 Som

12、e root growth but reduced development of shootsMS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus.不同营养条件对植物组织培养的影响 2022-6-62）B5培养基 是是19681968年由年由GalmborgGalmborg等为培养大豆根细胞等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特而设计的。其主要特点是含有较低的铵，点是含有较低的铵，这可能对不少培养物这可能对不少培养物的生长有抑制作用。的生长有抑制作用。从

13、实践得知有些植物从实践得知有些植物在在B5B5培养基上生长更培养基上生长更适宜，如双子叶植物适宜，如双子叶植物特别是木本植物。特别是木本植物。2022-6-6193）White培养基 是是19431943年由年由WhiteWhite为培养番茄根尖而设计的。为培养番茄根尖而设计的。19631963年又作了改良，称作年又作了改良，称作WhiteWhite改良培养基，提高了改良培养基，提高了MgSOMgSO4 4的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量较低，较低，适于生根培养适于生根培养。2022-6-6204）N6培养基 是是19741974年朱至清等为水稻

14、等禾谷类作物花药培年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，养而设计的。其特点是成分较简单，KNOKNO3 3和和（NHNH4 4）2 2SOSO4 4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。2022-6-621配置方法：先配母液，按比例稀释、混合配置方法：先配母液，按比例稀释、混合常见母液：常见母液：不同稀释倍数不同稀释倍数大量元素大量元素母液母液微量元素微量元素母液母液铁盐铁盐母液母液维生素维生素母液：母液：维生素和某些氨基酸维生素和某些氨基酸植物激素植物激素母液

15、：母液：吲哚乙酸、萘乙酸、苄基腺嘌呤吲哚乙酸、萘乙酸、苄基腺嘌呤植物细胞培养基的配制2022-6-622 三）三） 培养温度和培养温度和pHpH等条件等条件l温度：温度：适宜温度适宜温度20-25，酶合成温度因植物种类而异，酶合成温度因植物种类而异l pH: 植物细胞培养要求稳定植物细胞培养要求稳定pH，一般，一般pH5.8-6.1最好最好l 植物细胞培养过程中植物细胞培养过程中pH变化不大变化不大l溶氧、通气搅拌溶氧、通气搅拌: 细胞比较大，较脆弱，细胞比较大，较脆弱，对剪切力敏感对剪切力敏感，且耗氧速率较慢，所以通气和搅拌不要太强烈且耗氧速率较慢，所以通气和搅拌不要太强烈l光照光照：对一些

16、植物酶有诱导作用或抑制作用。：对一些植物酶有诱导作用或抑制作用。l 刺激物：在酶合成时期，适当添加。刺激物：在酶合成时期，适当添加。l前体的添加前体的添加：对一些植物酶有诱导作用。如苯丙氨酸：对一些植物酶有诱导作用。如苯丙氨酸l刺激物：刺激物：在酶合成时期，适当添加。在酶合成时期，适当添加。微生物细胞碎片微生物细胞碎片 细胞壁碎片、酵母葡聚糖、果胶酶、纤维素酶、细胞壁碎片、酵母葡聚糖、果胶酶、纤维素酶、2022-6-6 1. 外植体的获取外植体的获取 2. 植物细胞培养基的选择：植物细胞培养基的选择：MS、B5、White、N6 3. 培养时温度控制：培养时温度控制：25 左右，左右，20-3

17、0 4. 培养时培养时pH控制：控制：5-6，培养基，培养基pH为为5.5-5.8 5. 溶氧控制：溶氧控制：适当通风，但植物细胞需氧不多适当通风，但植物细胞需氧不多 6. 搅拌速度控制：搅拌速度控制：植物细胞体积大，较脆弱植物细胞体积大，较脆弱 7. 光照控制：光照控制：光照波长、强度、时间均有影响光照波长、强度、时间均有影响 8. 前体添加：前体添加：无机离子、真菌提取物无机离子、真菌提取物 9. 刺激剂的应用：刺激剂的应用：细胞壁碎片、果胶酶、纤维素酶细胞壁碎片、果胶酶、纤维素酶植物细胞培养工艺植物细胞培养工艺2022-6-6二、植物组织培养的分类二、植物组织培养的分类 植株培养植株培养

18、器官培养器官培养组织培养组织培养细胞培养细胞培养原生质体培养原生质体培养2、组织培养按培养对象可分为、组织培养按培养对象可分为 （外植体）（外植体）2022-6-625植株培养植株培养种子苗培养扦插苗培养 器官培养器官培养 根系培养根系培养 茎段培养茎段培养 花器培养花器培养 果实培养果实培养 种子培养种子培养 叶片培养叶片培养 根据作用和需要的不同，可以包括分离茎尖、茎根据作用和需要的不同，可以包括分离茎尖、茎段、根尖、叶片、叶原基、子叶、花瓣、雄蕊、雌蕊、段、根尖、叶片、叶原基、子叶、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果实等外植体的培养。胚珠、胚、子房、果实等外植体的培养。组织培养组织培养

19、分生组织培养分生组织培养薄壁组织培养薄壁组织培养输导组织培养输导组织培养4. 细胞培养细胞培养(cell culture)：是对由愈伤是对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得到的能保持较组织等进行液体振荡培养所得到的能保持较好分散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小好分散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养的细胞团的培养.细胞培养细胞培养看看护护培培养养平平板板培培养养悬悬浮浮培培养养微微室室培培养养5. 原生质体培养原生质体培养(proplast culture)：是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。原生质体培养原生质体培养非融合培养非融合培养融合培养融合培养三、植物组织培养的生理

20、依据三、植物组织培养的生理依据n细胞全能性细胞全能性(cell totipotency)：植物体的每一个：植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。成为完整植株的潜在能力。n植物细胞的再生性植物细胞的再生性是指在植物中很多是靠是指在植物中很多是靠种子生长来产生完整的植株，但也有不少可通种子生长来产生完整的植株，但也有不少可通过根、茎、叶等器官再生而成为完整的植株的过根、茎、叶等器官再生而成为完整的植株的特性。特性。 2022-6-631三、植物组织培养的生理依据三、植物组织培养的生理依据n植物生长调节物质植物生长调节物

21、质对于植物细胞组织的分化和决定具对于植物细胞组织的分化和决定具有关键性作用。它包括：生长素类、细胞分裂素类、有关键性作用。它包括：生长素类、细胞分裂素类、赤霉素、脱落酸、乙烯等赤霉素、脱落酸、乙烯等n生长素类主要用于愈伤组织的形成，体细胞胚的产生及试管生长素类主要用于愈伤组织的形成，体细胞胚的产生及试管苗的生根。常用的有苗的生根。常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAA等。其作用强等。其作用强弱为弱为2,4-DNAAIBAIAA。n细胞分裂素类则有促进细胞的分裂与分化，延迟组织的衰老，细胞分裂素类则有促进细胞的分裂与分化，延迟组织的衰老，促进芽的产生等作用。常用的有促进芽的产生等作用。常用的

22、有Zip(异戊烯腺嘌呤异戊烯腺嘌呤)、KT、6-BA、ZT等作用强弱顺序为。等作用强弱顺序为。ZipKT6-BAZT。n赤霉素则有促进已分化的芽伸长生长，打破种子休眠的作用。赤霉素则有促进已分化的芽伸长生长，打破种子休眠的作用。常用的为常用的为GA3。2022-6-6322022-6-633植物生长调节物质n生长素n细胞分裂素n赤霉素n乙烯生长素赤霉素细胞分裂素脱落酸乙烯 -植物激素“五兄弟” 向光性：向光性：在单侧光的照射下，植物朝向光源方向生长的现象。生长素（生长素（auxin）的发现）的发现胚芽鞘胚芽鞘1、19世纪末达尔文世纪末达尔文(C.R.Darwin)实验实验实验材料：实验材料：尖

23、尖 端端 尖端下面一段尖端下面一段 胚芽鞘胚芽鞘光光图图2 光光图图3图图1光光光光图图4总结上述实验总结上述实验, ,达尔文提出达尔文提出: : 胚芽鞘尖端受胚芽鞘尖端受单侧光单侧光刺激后刺激后, , 就向下面的就向下面的伸长区传递影响，造成伸长区伸长区传递影响，造成伸长区背光面比向光背光面比向光面生长快面生长快, ,因而使胚芽鞘出现向光弯曲。因而使胚芽鞘出现向光弯曲。琼脂片琼脂片云母片云母片2.19102.1910年詹森（年詹森（B.JensenB.Jensen）的实验）的实验结论：胚芽鞘的尖端产生的某种刺激可以透结论：胚芽鞘的尖端产生的某种刺激可以透过琼脂片传递给下面一段。过琼脂片传递给

24、下面一段。黑暗中黑暗中1 2 1 2 ba3.19143.1914年拜尔（年拜尔（PaalPaal）的实验）的实验 去尖端，去尖端， 把尖端放于胚芽鞘切面的把尖端放于胚芽鞘切面的左侧左侧， 胚芽鞘胚芽鞘向右侧向右侧弯曲生长。弯曲生长。 去尖端，去尖端， 把尖端放于胚芽鞘切面的把尖端放于胚芽鞘切面的右侧右侧， 胚芽鞘胚芽鞘向左侧向左侧弯曲生长。弯曲生长。结论：结论： 胚芽鞘的弯曲生长，是因为尖端产生的胚芽鞘的弯曲生长，是因为尖端产生的影响在其下部分布不均匀造成的。影响在其下部分布不均匀造成的。4 4、19281928年（年（F.W.WentF.W.Went）温特的实验）温特的实验朝对侧弯曲生长朝

25、对侧弯曲生长不生长也不弯曲不生长也不弯曲结论：胚芽鞘的弯曲生长确实是一种化结论：胚芽鞘的弯曲生长确实是一种化学物质引起的，并命名为生长素。学物质引起的，并命名为生长素。n1934年从人尿分离出具有生长素效应的年从人尿分离出具有生长素效应的物质物质吲哚乙酸吲哚乙酸。n1942年从高等植物中分离出生长素，并年从高等植物中分离出生长素，并确认是确认是IAA。n在植物体内，具有促进植物生长的功能，在植物体内，具有促进植物生长的功能，除了除了吲哚乙酸（吲哚乙酸（IAA）外，还有外，还有苯乙酸苯乙酸（PAA）和和吲哚丁酸（吲哚丁酸（IBA）。）。生长素生理作用的应用n顶端优势顶端优势n植物的向光性植物的向

26、光性n根的向重力性（向地性）根的向重力性（向地性）n茎的背重力性（背地性）茎的背重力性（背地性） 植物的顶芽优先生长，而侧芽生长植物的顶芽优先生长，而侧芽生长受抑制的现象。受抑制的现象。 顶芽产生的生长素向下运输，大量地顶芽产生的生长素向下运输，大量地积累在侧芽积累在侧芽部位，侧部位，侧芽对生长素浓度又比较敏感，使芽对生长素浓度又比较敏感，使侧芽的生长受到抑制侧芽的生长受到抑制。顶芽顶芽侧芽侧芽切除顶芽切除顶芽根根茎茎根根茎茎根根茎茎根根茎茎重重 力力促进慢抑制快快茎的背地性和根的向地性生长2 21 13 34 4根：浓度根：浓度2121，茎：浓度茎：浓度4343，1 1处生长快，处生长快，2

27、 2处生长慢，向地生长处生长慢，向地生长 4 4处生长快，处生长快，3 3处生长慢，背地生长处生长慢，背地生长 根根茎茎1 12 23 34 4茎的背地性和根的向地性生长在单侧光线照射下，在单侧光线照射下， 背光背光侧侧向光侧向光侧，背光侧细胞生长快背光侧细胞生长快植物向光性植物向光性结果使茎朝向光源一侧弯曲结果使茎朝向光源一侧弯曲生长素类似物的应用生长素类似物的应用(1) 促进扦插的枝条生根促进扦插的枝条生根(2) 促进果实发育（培育无籽果实）促进果实发育（培育无籽果实）(3) 防止落花落果，疏花疏果防止落花落果，疏花疏果（4 4）用作除草剂）用作除草剂1、促进扦插枝条生根、促进扦插枝条生根

28、 用一定浓度的生长素类似物用一定浓度的生长素类似物溶液浸泡插枝的下端后栽插。溶液浸泡插枝的下端后栽插。 传粉受精后，胚珠发育成种子传粉受精后，胚珠发育成种子的过程中产生大量生长素，促进子的过程中产生大量生长素，促进子房发育成果实。房发育成果实。2、生长素促进果实发育（无籽果实）、生长素促进果实发育（无籽果实）如何培育无籽果实？如何培育无籽果实？ 在没有接受花粉的雌蕊柱头上涂上一定浓在没有接受花粉的雌蕊柱头上涂上一定浓度的生长素类似物，使度的生长素类似物，使子房正常发育为果实，子房正常发育为果实，因为因为没有受精没有受精，果实内，果实内没有种子没有种子。3、 防止落花落果防止落花落果 农业生产上

29、常用一定浓度的生长素类农业生产上常用一定浓度的生长素类似物溶液喷洒棉株，可以达到保蕾保铃的似物溶液喷洒棉株，可以达到保蕾保铃的效果。效果。4、杂草的除草剂、杂草的除草剂 如如(2 (2，4-D)4-D)，适用于麦田、稻田，适用于麦田、稻田，双子双子叶植物叶植物比单子叶植物对生长素更比单子叶植物对生长素更敏感敏感，用，用高浓度的除草剂能抑制高浓度的除草剂能抑制双子叶植物（杂草）双子叶植物（杂草）的生长。的生长。2022-6-655 生长素（auxin）n吲哚乙酸（IAA，天然），奈乙酸（NAA），二氯苯氧乙酸（2,4-D），吲哚丁酸（IBA），2,4,5-三氯苯氧乙酸（2,4,5-T）。n促进细

30、胞分裂与根分化n2,4-D有强烈的愈伤组织诱导能力，但抑制器官分化2022-6-656 细胞分裂素（cytokinin）n激动素 （KT），6-苄基腺嘌呤（6-BA），玉米素 （ZT），异戊烯氨基嘌呤（ 2IP）n刺激细胞分裂，诱导芽的分化、叶片扩大和茎长高，抑制根的生长。 n细胞分裂素常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。 细胞分裂素合成部位主要作用；促进细胞分裂愈伤组织2022-6-658细胞分裂素与生长素相互作用n生长素与细胞分裂素的比例被称为“激素杠杆”，决定着发育的方向。n当生长素含量高于细胞分裂素时，主要诱导植物组织脱分化和根原基的形成n当细胞分裂素的

31、效应高于生长素时，主要诱导植物组织再分化和芽原基的形成。2022-6-659生长素含量高于细胞分裂素2,4-D 1mgL +6-BA 0.1mgL 2022-6-660生长素含量低于细胞分裂素2022-6-661 赤霉素（gibberelin acid）nGA3n促进细胞生长n刺激不定胚发育成正常小植株 1926年，水稻感染了赤霉菌植物疯长 恶苗病 病苗细长，叶色淡绿，比健苗高，病株节间伸长，茎节上逆生不定根，茎杆逐渐变褐，腐烂，其内有白色蜘蛛丝状菌丝。1935年科学家从培养基滤液中分离出赤霉素（GA）将赤霉菌培养基的滤液喷洒到健康水稻幼苗上不感染赤霉菌，却有恶苗病的症状对照 GA3诱导甘蓝茎

32、的伸长 ，产生超长茎GA3 对矮生型豌豆的效应促进细胞伸长促进种子萌发主要作用果实发育2022-6-665 乙烯（ethylene）n对芽的诱导具有一定作用 n在生理环境的温度和压力下，是一种气体，比空气轻，实验中很难掌握用量，所以一般不使用n培养的植物组织也会产生乙烯，如果封口用的是不透气的塑料膜，容器内就会逐渐积累乙烯，严重时可引起培养物的死亡 幼根幼叶合成部位乙烯在常温下是气体。作为生长调节剂用的是乙烯利。植物细胞全能性植物细胞全能性（Cellular totipotency）： 任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植珠所必须的全部遗传

33、信息和发育成完一个完整植珠所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。整植株的能力。 （Haberlandt, 1902）四、植物组织培养的原理四、植物组织培养的原理2022-6-668离体的植物离体的植物器官、组织、器官、组织、细胞细胞脱分化脱分化愈愈伤伤组组织织再分化再分化根根芽芽植植物物体体2022-6-669 切开胡萝卜，在圆圈处取一块组织P-木质部、C-形成层、X-韧皮部操作步骤2022-6-6 形成层开始形成愈伤组织C1-愈伤组织、C2-形成层操作步骤2022-6-6 3-4周后完全形成愈伤组织状态（脱分化）组织块失去色素操作步骤2022-6-6 把脱分化后的愈伤组织转移到培养基上

34、操作步骤2022-6-6 两周左右开始再分化，长出幼苗操作步骤2022-6-6 将幼苗移植到外部条件下培养（顺化）操作步骤2022-6-6 顺化一个月后的胡萝卜植株五、操作步骤2022-6-6初代培养初代培养继代培养继代培养生根培养生根培养驯化移栽驯化移栽4.植物组织培养一般过程植物组织培养一般过程2022-6-6795.5.初代培养：初代培养： 芽、茎段、叶片、花、器官等芽、茎段、叶片、花、器官等外植体在离体培养条件下诱导愈伤外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体过程组织、侧芽或不定芽、胚状体过程 组织培养技术的蓬勃发展只是近五十年的事，但它的整个历史可以追溯至十九世纪末和

35、上世纪初。 第二节第二节 植物细胞组织培养发展简史植物细胞组织培养发展简史2022-6-684第二节第二节 植物组织培养发展简史植物组织培养发展简史n 植物组织培养与细胞培养开始于植物组织培养与细胞培养开始于1919世纪后世纪后半叶半叶，当时植物细胞全能性的概念还没有完全，当时植物细胞全能性的概念还没有完全确定，但基于对自然状态下某些植物可以通过确定，但基于对自然状态下某些植物可以通过无性繁殖产生后代的观察，人们便产生了这样无性繁殖产生后代的观察，人们便产生了这样一种想法即一种想法即能否将植物体的一部分在适当的条能否将植物体的一部分在适当的条件下培养成一个完整的植物体，件下培养成一个完整的植物

36、体，为此许多植物为此许多植物科学工作者开始了培养植物组织的尝试。科学工作者开始了培养植物组织的尝试。 2022-6-685 第二节第二节 植物组织培养发展简史植物组织培养发展简史 上世纪上世纪三十年代，德国植物学家三十年代，德国植物学家施莱登施莱登和德国动物学家和德国动物学家施旺施旺创立了细胞学说：创立了细胞学说： 细胞细胞是是有机体有机体， 一切动植物都是由单细胞发育而来，一切动植物都是由单细胞发育而来， 即生物是由细胞和细即生物是由细胞和细胞的产物所组成；胞的产物所组成； 所有细胞在结构和组成上基本相似；所有细胞在结构和组成上基本相似； 新细胞是由已存在的新细胞是由已存在的细胞分裂细胞分裂

37、而来；而来； 生物的疾病是因为其细胞机能失常。生物的疾病是因为其细胞机能失常。 根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。件，每个细胞都应该能够独立生活。 对组织培养技术的诞生起到了极大的推动作用。对组织培养技术的诞生起到了极大的推动作用。2022-6-686第二节第二节 植物组织培养发展简史植物组织培养发展简史n植物组织培养发展简史可划分为三个阶段：植物组织培养发展简史可划分为三个阶段：一、探索阶段一、探索阶段二、奠基阶段二、奠基阶段三、迅速发展阶段三、迅速发展阶段2022-6-687第二节第二节 植物组织培养

38、发展简史植物组织培养发展简史n一、探索阶段（上世纪初至上世纪一、探索阶段（上世纪初至上世纪30年代中）年代中） 19021902年德国著名的植物生理学家和植物学家年德国著名的植物生理学家和植物学家哈伯兰特（哈伯兰特（HaberlandtHaberlandt） 在在SchleidenSchleiden和和SchwannSchwann的细胞学说的推动下，提出了的细胞学说的推动下，提出了高等植物细胞全能高等植物细胞全能性理论性理论。它是植物组织培养的理论依据，对植物。它是植物组织培养的理论依据，对植物组织培养的发展起了先导作用。组织培养的发展起了先导作用。 植物细胞全能性的理论：植物细胞全能性的理论

39、：即植物的体细胞，在适当的条件即植物的体细胞，在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖，发育成完整植株的潜在能力下，具有不断分裂和繁殖，发育成完整植株的潜在能力。2022-6-688第二节第二节 植物组织培养发展简史植物组织培养发展简史二、奠基阶段（二、奠基阶段（3030年代中至年代中至5050年代末）年代末）n 19341934年美国的怀特（年美国的怀特（WhiteWhite）由番茄根建立了第一个活跃生长的无性）由番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，繁殖系，并反复转移到新鲜培养基中继代培养，使根的离体培养实验获并反复转移到新鲜培养基中继代培养，使根的离体培养实验获得了真正的成功，并在以后得了真

40、正的成功，并在以后2828年间培养了年间培养了16001600代。代。n 之后，之后，WhiteWhite又以小麦根尖为材料，研究了光、温度、通气、又以小麦根尖为材料，研究了光、温度、通气、pHpH值、值、培养基组成等各种培养条件对生长的影响，并于培养基组成等各种培养条件对生长的影响，并于19371937年建立了第一个组年建立了第一个组织培养的综合培养基织培养的综合培养基，其成分均为已知化合物，包括其成分均为已知化合物，包括3 3种种B B族维生素，即族维生素，即吡哆醇、硫胺素和烟酸，吡哆醇、硫胺素和烟酸，该培养基后来被定名为该培养基后来被定名为WhiteWhite培养基培养基。 2022-6

41、-689第二节第二节 植物组织培养发展简史植物组织培养发展简史n与此同时，与此同时，高特里特高特里特（GautheretGautheret） (1934)(1934)在研究山毛柳在研究山毛柳和黑杨等形成层的组织培养实验中，和黑杨等形成层的组织培养实验中，提出了提出了B B族维生素和生族维生素和生长素对组织培养的重要意义长素对组织培养的重要意义，并于，并于19391939年年连续培养胡萝卜根连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。形成层获得首次成功。n同年，同年，WhiteWhite由烟草种间杂种的瘤组织，由烟草种间杂种的瘤组织， 诺比考特诺比考特（NobecourtNobecourt）由胡萝卜均建

42、立了与上述类似的连续生长的由胡萝卜均建立了与上述类似的连续生长的组织培养物。组织培养物。2022-6-690n因此，因此，GautheretGautheret，WhiteWhite和和NobecourtNobecourt一起被誉为组织培一起被誉为组织培养学科的奠基人。养学科的奠基人。我们现在所用的培养方法和培养基，基我们现在所用的培养方法和培养基，基本上都是由这三位科学家建立的。他们三人的贡献在于：本上都是由这三位科学家建立的。他们三人的贡献在于：一是认识了一是认识了B B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素是一种天然的生长调节物质。了生长素是一

43、种天然的生长调节物质。n后来，后来，WhiteWhite于于19431943年发表了年发表了植物组织培养手册植物组织培养手册专著，专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。第二节第二节 植物组织培养发展简史植物组织培养发展简史2022-6-691第二节第二节 植物组织培养发展简史植物组织培养发展简史 4040年代斯库克（年代斯库克（SkoogSkoog）和崔澂崔澂在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中发现，腺嘌呤或腺苷可以解除培养基中生长素(IAA)对芽形成的抑制作用，而能诱导形成芽，从而明确了腺嘌呤腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之与生

44、长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一一。即细胞分裂素与生长素比例高时，产生芽；这一比例细胞分裂素与生长素比例高时，产生芽；这一比例低时，则形成根；相等则不分化，形成愈伤组织。低时，则形成根；相等则不分化，形成愈伤组织。 器官分化的植物激素控制理论器官分化的植物激素控制理论2022-6-692第二节第二节 植物组织培养发展简史植物组织培养发展简史 50年代开始以后，组织培养研究日趋繁荣，年代开始以后，组织培养研究日趋繁荣，10年当中引人注目的进展主要有年当中引人注目的进展主要有7项：项： 1952年，莫雷尔（年，莫雷尔（Morel）和马丁（）和马丁（Martin）通过茎尖分生组织的离体培养，

45、从已受病毒侵染的大丽花中首次获得无病毒植株；2022-6-693第二节第二节 植物组织培养发展简史植物组织培养发展简史 五十年代五十年代缪尔缪尔把单细胞放在一张铺在愈伤组织上面的滤纸上培养，使细胞发生了分裂，即实施了看护接种技术，使单细胞培养获得初步成功。米勒米勒等人发现了激动素。不久即知道激动素可以代替腺嘌呤促进发芽，并且效果可增加三万倍。2022-6-694第二节第二节 植物组织培养发展简史植物组织培养发展简史n1957年，年，Skoog和和Miller提出植物激素控制器官形成的概念；上述控制器官分化的激素模式变为激动素与生长素的比例关系。n这方面的成功发现，有力地推动了植物组织培养的发展

46、。2022-6-695第二节第二节 植物组织培养发展简史植物组织培养发展简史n19581958年年，美国植物学家，美国植物学家斯图尔德（斯图尔德（StewardSteward）等人，用等人，用胡萝卜根韧皮部的细胞进行培养，胡萝卜根韧皮部的细胞进行培养，得到了完整植株得到了完整植株，并，并且这一植株能够开花结实，首次证实了且这一植株能够开花结实，首次证实了HaberlandtHaberlandt在五在五十多年前关于细胞全能性的预言；十多年前关于细胞全能性的预言；n19581958年年，WicksonWickson和和ThimannThimann指出，应用外源细胞分裂素指出，应用外源细胞分裂素CT

47、KCTK可促成在顶芽存在的情况下可促成在顶芽存在的情况下打破腋芽的休眠打破腋芽的休眠后后来，来，MurashigeMurashige利用这一方法发展了快繁技术，广泛的利用这一方法发展了快繁技术，广泛的应用于植物的快速繁殖。应用于植物的快速繁殖。2022-6-696第二节第二节 植物组织培养发展简史植物组织培养发展简史综上所述，综上所述，在这一发展阶段中，通过对在这一发展阶段中，通过对培养条件培养条件和和培培养基成分养基成分的广泛研究，特别是对的广泛研究，特别是对B B族维生素族维生素、生长素生长素和和细胞分裂素细胞分裂素在组织培养中作用的研究，已经实现了在组织培养中作用的研究，已经实现了对离体

48、细胞生长和分化的控制对离体细胞生长和分化的控制，从而，从而初步确立了组织初步确立了组织培养的技术体系培养的技术体系，为以后的发展奠定了基础。，为以后的发展奠定了基础。2022-6-697第二节第二节 植物组织培养发展简史植物组织培养发展简史 三、迅速发展阶段三、迅速发展阶段科金科金开创植物原生质体培养和体细胞开创植物原生质体培养和体细胞杂交研究工作。（用真菌纤维素酶从番茄幼杂交研究工作。（用真菌纤维素酶从番茄幼根分离得到活性原生质体）根分离得到活性原生质体）；同年同年植物试管受精首次成功。博尔提出了一个茎尖离体无性繁殖兰花的博尔提出了一个茎尖离体无性繁殖兰花的方法方法迅速建立起迅速建立起兰花工

49、业；名贵兰花兰花春日飘香2022-6-698第二节第二节 植物组织培养发展简史植物组织培养发展简史n19621962年，年，MurashigeMurashige和和SkoogSkoog发表了促进烟草组织快速生发表了促进烟草组织快速生长的培养基组成长的培养基组成MSMS培养基培养基；n19641964年印度固哈（年印度固哈（GuhaGuha）和马海舒瓦瑞（）和马海舒瓦瑞（MaheshwariMaheshwari）成功地在毛叶曼陀罗花药培养中，由花粉诱导得到单倍成功地在毛叶曼陀罗花药培养中，由花粉诱导得到单倍体植株，从而促进了体植株，从而促进了花药和花粉培养花药和花粉培养的研究；的研究；n以后相继

50、在以后相继在烟草、水稻、小麦、玉米、番茄、辣椒、草烟草、水稻、小麦、玉米、番茄、辣椒、草莓、苹果莓、苹果等多种植物培养中获得成功，其数目达到等多种植物培养中获得成功，其数目达到160160多种，其中烟草、水稻和小麦等的花药育种培养在中国多种，其中烟草、水稻和小麦等的花药育种培养在中国取得了引入注目的成就。取得了引入注目的成就。2022-6-699第二节第二节 植物组织培养发展简史植物组织培养发展简史 19711971年，年，TakebeTakebe等等在烟草上首次由原生质体获得了再原生质体获得了再生植株生植株，这不仅在理论上证明了无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上为外源基因的导入提供了