RNA甲基化研究现状与实验可行性课件.ppt
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1、1RNA甲基化与MeRIP-Seq测序技术 甲基化DNA免疫共沉淀技术(MeDIP)、RNA结合蛋白免疫共沉淀技术(RIP)和RNA测序技术(RNA-seq)*2目 录 (方法:使用关键词“MeRIP”在NCBI上检索到21篇相关文献,形成综述) 38页 (方法:找到并查看提供此类服务的三家公司,发布服务的思路与消息) 99页 (方法:综合学术界发展势态与技术服务发展势态) 1010页 (方法:综合NCBI上检索到21篇文献中的相关技术言论,着重解释了实验原理与Peak峰出现的原理) 1112页 (方法:深入浅出,用简单的流程描述本技术) 1313页 (方法:找出关键技术文献两篇,详细对比实验
2、方法和技术路线) 1414页 ,晶能生物在NCBI上有署名文献 1517页 (方法:综合MeDIP-Seq技术、RNA-Seq技术、m6A成熟抗体技术、mRNA成熟片段化技术提出“定量化”的执行方案) (方法:找出必要的24类试剂的采购供应情况,均有代理商!) 1818页 2021页 (方法:在CFNA官方网站上已经可以检索到一例甲基化诊断试剂盒(PCR荧光探针法)*3 探究与技术 MeRIP-Seq测序技术 甲基化转录组RNA免疫共沉淀高通量测序技术(Methylated RNA Immunoprecipitation Sequencing ) 研究历程 分析方法:以关键词“MeRIP”在N
3、CBI上检索文献,共检索到21篇文献,按照时间顺序查看文献研究流程。 1、 2012年,提出MeRIP-Seq测序技术,就是指全转录组m6A定位的方法,即结合m6A特异性甲基化RNA免疫沉淀技术与新一代测序技术的结合(MeRIP Seq)。 一、抗体的制备方法:anti-m6A抗体(来自文献1987/2011/1977) 二、建库样本类型:m6A在RNA定位于成熟的mRNA中,而不在Poly A尾部。 三、数据统计分析类型:Peak检测峰的分布、Peak(检测峰)统计分析与可视化、检测峰中motif基序统计分析与可视化等。 提示:大量的m6A存在于细胞0.10.4%的总RNA腺苷残基中,这表明
4、这种修饰在转录组可能普遍存在。虽然m6A发现于许多年前,但是在基于m6A修饰mRNA引发的病患研究进展缓慢。这在很大程度上是因为缺乏可用的检测m6A的方法。因为甲基腺苷不会改变其与胸腺嘧啶或尿嘧啶碱基结合的能力,m6A也不适用于标准的杂交或测序的检测技术。 *4 2、2013年,提出MeRIP-Seq改进测序数据分析方法,就是指有效识别m6A修饰区域,并且统计分析和可视化测序数据。 一、m6A峰在RNA不同区域分布的饼状图。 二、m6A峰在RNA三类区域分布的百分率。 三、m6A位点在特定转录本序列中的位置。 提示:文章中的分析方法MeRIPPF可以实现了m6A信号或检测峰的基因注释,结果可以
5、Excel和图形格式输出,有利于研究的进一步开展。MeRIPPF在Perl上完成,并且可从的http:/ 3、2014年,开发RNA甲基化差异分析软件包,就是指MeRIP-Seq测序数据分析软件、原序列比对、RNA甲基化位点检测、模体序列发现、RNA差异甲基化分析和功能分析。 2015年, 在中国生物化学与生物物理进展上发表名为高通量RNA甲基化测序数据处理与分析研究进展的综述文章。 提示:MeRIP-Seq测序技术还处于非常早期发展阶段。文章讨论了每个处理步骤背后的基本原理,以及具体实践方法和可能的替代策略,并且exomepeak R/Bioconductor包是免费提供,参见http:/w
6、ww.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/exomepeak.html 。 4、2014年,研究了模式植物水稻全转录组RNA甲基化(愈伤组织Vs叶片)特点,就是指甲基化位点的分布特点、甲基化与表达量的关系、组织表达差异统计分析、甲基化富集GO功能差异分析。 一、m6A峰在RNA三类区域分布的百分率。 二、m6A位点在特定转录本序列中的位置。 三、甲基化富集GO功能差异分析。*6(B) GO analysis of commonly methylated genes (CM) and selectively methylated genes i
7、n callus (CS) and leaf (LS). 提示:可以说自此(2015年初)后,MeRIP-Seq测序技术发展模式基本确定,就是采用MeRIP-Seq测序技术研究模式物种,然后在整体水平上做mRNA中m6A位点的分布和特定位点做表达量、甲基化位点的确定,还有组织差异和条件差异的GO功能分析等。*7 5、2015年,继续讨论和研究RNA甲基化和去甲基化酶,收集数据进行荟萃分析,从系统水平寻找共同的甲基化调节方式。 6、2015年,继续讨论和研究开展RNA甲基化数据库的建设,提示RNA甲基化领域的发展潜力。 7、2015、2017年,从RNA交联和免疫共沉淀和MeRIP技术出发开展研
8、究m6A的分子开关作用,提示作者绘制了大量相关性和对比类的图形;2017研究识别m6A位点的蛋白。 8、2015年,继续讨论和研究开发了基于HMM隐马尔可夫模型的峰识别寻峰算法,意在寻找更好的寻峰算法。 9、2015、2016、2016、2017.8年,继续讨论和研究基于HMM隐马尔可夫模型的差异甲基化区域分辨、病例-对照差异甲基化问题、基因注释问题、精确预测mRNA甲基化位置;差异甲基化分析。 10、2017年,从另一个甲基化位点m5C角度研究RNA甲基化并且对比和m6A的关系。技术路线:按照重亚硫酸盐测序(BS-Seq)的思路进行,可以实现C到U的转变,进而实现全转录组测序分析。 11、2
9、017年,采用公司服务的方式研究了猪肌肉和脂肪组织m6A甲基化谱,完成了多种数据分析统计:整体水平上做mRNA中m6A位点的分布和特定位点做表达量、甲基化位点的确定,还有组织差异和条件差异的GO功能分析等。*8 12、2017年8月,发表综述论文鉴赏表观转录组epitranscriptome:新技术和新观点。 13、2017年9月,研究了斑马鱼造血干细胞和祖细胞m6A甲基化谱,又一次完成MeRIP-Seq技术的应用。 14、2018年1月,提出研究m6A甲基化RNA位点变异的重要意义。提出:最近,N6-甲基腺嘌呤(m6A)已成为研究的热点,在许多基出生物学过程和各类疾病中起到关键作用。 15、
10、2017年12月,使用转录组测序技术,m6A- Seq(MeRIP-Seq) 和MeRIP qRT-PCR的方法共同检测目标基因的m6A修饰;提出:近年来,RNA的多样性和可逆性化学修饰成为一种新的表观遗传调控。 1、2014年,发表综述文章由可逆m6A甲基化RNA介导基因表达调控机制,文中这种“RNA的化学标记”调剂机制中的相关蛋白被描述为“橡皮擦”、“阅读者”和“书写者”,以及mRNA的动态特征;提示:m6A甲基化RNA研究的重要意义。 2、2016年,研究了哺乳动物小鼠胚胎干细胞中m6A的DNA甲基化谱。提示:研究组研究的主题是m6A的DNA甲基化谱,对m6A的RNA甲基化的研究思路有指
11、导作用。*9 服务历程 三家企业20162017年相继推出RNA甲基化服务(MeRIP-Seq服务)广州表观生物(成立于2016年11月)、广州锐博生物(成立于2004年 “千人计划”专家张必良博士)和武汉生命之美(成立于2010年7月)。上海晶能生物合作过相关服务2017年4月。 1、广州表观生物 一、2017年9月,RNA甲基化(m6A)免疫共沉淀高通量测序(MeRIP-seq)服务方案。含基本分析内容: 原始数据处理及统计、过滤后数据质量QC 图、测序序列与参考基因组比对、基因组覆盖度分布。Peak Calling 分析、Peak 可视化、Peak 统计分析、m6A 的基本特征( pea
12、k 在基因元件的分布、reads 在基因元件的分布、Peak 关联基因的特征)、差异peak 分析、 motif分析。没有GO功能分析。 二、样本要求物种信息(仅限人、大小鼠物种,其他物种需评估);实验样本:细胞、组织、提取后的总 RNA(限定有参基因组物种) 三、方案思路:实验分组设置:细胞模型 实验组VS对照组,建议3:3;组织模型 正常组VS疾病组,建议5:5;组内对照:IP组VS input组(input组主要用于比较鉴定IP组的抗体特异性结合,是必备的组分)。 测序模式:PE100/150,测序数据:3-6G。 2、武汉生命之美 一、方案思路:meRIP建库流程meRIP分析流程(质
13、量分析、peak分析、 motif分析、GO功能分析、KEGG通路分析) 3、广州锐博生物 一、服务特点:1.甲基化筛选范围广,全转录组范围筛查,通量高;2.丰富的项目经验,已与多家单位合作;3.项目周期快:30 工作日完成;4.分析内容全面,更有定制化与其他组学数据的关联分析。 二、推荐测序模式:HiSeq2500 、SE 50 20 M clean reads 三、方案思路:meRIP建库流程meRIP分析流程(质量分析、peak分析、 motif分析、GO功能分析、KEGG通路分析) *10研究与服务意义1、表达水平甲基化与测序检测技术的一次结合。2、但凡相关文章的发表,都是有高水平期刊
14、杂志收录和承当;样本处理与数据分析合理,发在Nature和Cell上都不困难,2018年仍然会延续这种情况。3、投入本领域和技术研究与服务的知名高校和单位,逐步缓慢增加,他们的评价也是积极的。4、在我国的期刊杂志上,尚未出现相关技术的文献;提示技术有观望者,但能够执行的机构和单位尚未涌现。5、在上海尚无一家机构公开提供RNA甲基化相关服务,学术研究也处于无从展开的阶段。5、预测未来五年,甲基化研究可能迎来充足的研究动力和广阔应用潜力;学者们的相关文献也会从国内逐步转向国内。近两年,会有大量相关学术研究成果发表在外文高水平期刊上。*11实验原理与本质(intrinsic quality)MeRI
15、P-Seq测序文库的制备差异点一、去除rRNA 首先从样本细胞或组织中分离出RNA,考虑到总RNA中含有大量的rRNA序列,需要结合不同的方法除去其中的rRNA。含有Poly A尾的可以利用这一特点分离mRNA。不含的可以用相应试剂盒提取。二、平行测序内对照Control样本 提取的mRNA随机打断后,需要分成两组。一组对甲基化修饰片段(IP片段,免疫沉淀片段)进行测序,一组对转录本片段(Control片段/背景片段,表达量片段)进行测序。 不同与免疫芯片方法的原因是,任何样本的mRNA表达量和表达谱都存在差异(差异表达)。总之,RNA甲基化不仅可以引起甲基化的发生,也可以引起RNA总表达量的
16、改变。*12Peak峰出现的原理与本质(intrinsic quality)一、检测的差异性IP片段样本 实现了对甲基化reads 和甲基化位点(打断的随机性和广泛性)的富集与测序。Control片段样本 实现了对正常当前表达的所有reads和位点的一般性检测与测序(非富集状态)。二、归一化比较与峰产生1、归一化 由于手动上样不可能实现,IP样本和Control样本各自所上样本量一致,但是通过内部内参基因的归一化处理,所有数据变得可以比较。 或者说,可以化作单个细胞某基因的表达数量(Control归一化数据)和单个细胞某基因的甲基化数量(IP归一化数据)。2、富集峰 总之,用图示的方法,可以看
17、到该基因的此位点出现Peak峰(本质上一种“归一化后的”甲基化位点“富集峰”)*13 MeRIP-Seq测序实验简易流程: 1、差异处理的样本一对或一组 2、RNA提取 3、mRNA纯化 4、mRNA片段化与纯化 5、mRNA-IP(RNA免疫共沉淀) 6、mRNA-IP和mRNA-Control共同做mRNA-seq测序。 注:mRNA-seq技术原理: 首先从细胞或组织样本中提取总RNA, 其次将mRNA反转录成cDNA双链文库: 1)先用poly(T)寡聚核苷酸结合带有poly(A)尾巴的mRNA分子,将其从样品总RNA中分离出来; 2)将mRNA分子随机打断成更小长度的RNA片段,用逆
18、转录酶和随机引物合成得到cDNA片段; 3)对cDNA片段进行末端修复,在将其两端分别接上测序接头,构成用于测序的cDNA。再将cDNA测序文库加入测序仪的各通道中,对cDNA进行桥式PCR扩增。 mRNA-seq 样本要求,RNA:浓度大于等于400ng/ul,总量大于等于20ug;OD260/280在1.82.2, 28S/18S大于1.8,RIN大于7。*14北京基因组研究所流程与上海晶能生物流程1、组织收集与制备 水稻愈伤组织Vs叶片(2014.9)、猪背部肌肉Vs皮下脂肪(2017.4)2、RNA的制备(RNA分离和片段化) 步骤一:样品保存切取两类组织,保存收集和存储在80C以下或
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