1、糖组学glycomics的背景及研究意义课件.ppt
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- 糖组学 glycomics 背景 研究 意义 课件
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1、.1、糖组学、糖组学(glycomics) 的背景及研究意义的背景及研究意义 20 20 世纪末世纪末, ,继基因组学、蛋白质组学之后继基因组学、蛋白质组学之后, ,糖组学也日益受糖组学也日益受到人们关注。顾名思义到人们关注。顾名思义, ,糖组学是对糖链组成及其功能研究糖组学是对糖链组成及其功能研究的一门新学科的一门新学科, ,是基因组学的后续和延伸是基因组学的后续和延伸, ,具体内容具体内容包括研究包括研究糖与糖之间、糖与蛋白质之间、糖与核酸之间的联系和相互糖与糖之间、糖与蛋白质之间、糖与核酸之间的联系和相互作用作用, ,其主要研究对象为聚糖。丰富多样的聚糖覆盖了生物其主要研究对象为聚糖。丰
2、富多样的聚糖覆盖了生物有机体的所有细胞有机体的所有细胞, ,不仅体现细胞的类型和状态不仅体现细胞的类型和状态, ,也参与了许也参与了许多生物学行为多生物学行为, ,如细胞发育、分化、肿瘤转移、微生物感染、如细胞发育、分化、肿瘤转移、微生物感染、免疫反应等免疫反应等; ;聚糖还体现生物和分子的进化作用聚糖还体现生物和分子的进化作用, ,如糖酵解、如糖酵解、生物合成的保守性以及核糖的起源等。生物合成的保守性以及核糖的起源等。.示例:示例: 糖链的生物学功能糖链的生物学功能(1)糖链在糖蛋白新生肽链折叠和缔合中的作用糖链在糖蛋白新生肽链折叠和缔合中的作用 研究表明:糖蛋白研究表明:糖蛋白N-糖链在参
3、与新生肽的折叠,维持蛋白糖链在参与新生肽的折叠,维持蛋白质正确构象时起重要作用。质正确构象时起重要作用。红细胞血凝素,如红细胞血凝素,如N-糖链糖链缺乏缺乏,则不能折叠呈三聚体则不能折叠呈三聚体.(2)糖链影响糖蛋白的分泌和稳定性糖链影响糖蛋白的分泌和稳定性免疫球蛋白如缺乏免疫球蛋白如缺乏N-糖链则不糖链则不能分泌到胞外而留在内质网中能分泌到胞外而留在内质网中.(3)糖链参与分子识别和细胞识别糖链参与分子识别和细胞识别 血清中很多蛋白质式含有以唾液酸残基为末端的血清中很多蛋白质式含有以唾液酸残基为末端的N-N-糖链糖蛋糖链糖蛋白,称唾液酸糖蛋白,如免疫球蛋白、蛋白质激素,载体蛋白等。白,称唾液
4、酸糖蛋白,如免疫球蛋白、蛋白质激素,载体蛋白等。如被唾液如被唾液酸酶降解酸酶降解与肝细胞膜上的去唾液酸糖蛋白受体结合与肝细胞膜上的去唾液酸糖蛋白受体结合胞吞作用并降解胞吞作用并降解与血浆中老蛋白的清除有关与血浆中老蛋白的清除有关.与精卵识别有关与精卵识别有关 受精是精子与卵子的受精是精子与卵子的融合。哺乳动物的卵子外融合。哺乳动物的卵子外面有一层透明的糖蛋白外面有一层透明的糖蛋白外衣,称透明带(衣,称透明带(zone zone pelluci da,ZP)pelluci da,ZP)。透明带。透明带由由ZP-1ZP-1、ZP-2ZP-2和和ZP-3ZP-3三种三种糖蛋白组成糖蛋白组成, ,受精
5、中起主要受精中起主要作用的是作用的是ZP-3,ZP-3,连接在连接在ZP-3ZP-3上的上的O -GalNAcO -GalNAc糖链能被精糖链能被精子表面上的凝集素受体识子表面上的凝集素受体识别别( (有物种特异性有物种特异性) )。O -O -GalNAcGalNAc糖链的非还原端是糖链的非还原端是一个一个一连接的半乳糖残一连接的半乳糖残基基, ,它可能在精卵识别中起它可能在精卵识别中起关键作用。关键作用。.与细胞粘着有关与细胞粘着有关 细胞粘着细胞粘着(cell adhesion)(cell adhesion)是进化中随着多细胞生物出现的是进化中随着多细胞生物出现的必然现象。多细胞生物中细
6、胞有相互识别而聚集成细胞群的能必然现象。多细胞生物中细胞有相互识别而聚集成细胞群的能力力细胞粘着。细胞群或组织细胞粘着。细胞群或组织(tissue)(tissue)中细胞与细胞之间充满中细胞与细胞之间充满着由糖蛋白着由糖蛋白( (胶原蛋白、纤连蛋白、层粘蛋白胶原蛋白、纤连蛋白、层粘蛋白) )、蛋白聚糖、透明、蛋白聚糖、透明质酸等组成的胞外基质质酸等组成的胞外基质(extracellular matrix,ECM)(extracellular matrix,ECM)。在整个生。在整个生物体中物体中,ECM,ECM形成一个连续的主体网络结构形成一个连续的主体网络结构, ,所有的细胞都交织或所有的细
7、胞都交织或浸泡在这一网状基质中浸泡在这一网状基质中, ,网络中细胞一细胞粘着网络中细胞一细胞粘着, ,细胞一细胞一ECMECM粘着粘着都是通过有关的膜内在蛋白质都是通过有关的膜内在蛋白质(integral membrane protein)(integral membrane protein)完完成的。这些膜蛋白称细胞粘着分子成的。这些膜蛋白称细胞粘着分子(cell adhesion molecule, (cell adhesion molecule, CAM)CAM)或粘着蛋白或粘着蛋白, ,包括包括整联蛋白整联蛋白(integrin),(integrin),钙粘着蛋白钙粘着蛋白(cadhe
8、r (cadher -in)-in)免疫球蛋白超家族免疫球蛋白超家族(Ig superfamily),(Ig superfamily),血管地址素血管地址素(vescular addressin) (vescular addressin) 选择蛋白选择蛋白(selectin)(selectin)等。等。CAM CAM 绝大多数绝大多数都是含都是含N N一糖链的糖蛋白一糖链的糖蛋白. .例如整联蛋白是由例如整联蛋白是由一和一和一亚基组成一亚基组成的异二聚体的异二聚体, ,两个亚基上有多个两个亚基上有多个N N一糖基化位点。去糖链的整联蛋一糖基化位点。去糖链的整联蛋白完全失去与纤连蛋白的粘着能力。
9、白完全失去与纤连蛋白的粘着能力。 .(4)糖链影响糖蛋白的生物学活性糖链影响糖蛋白的生物学活性糖链与酶活性糖链与酶活性 糖链在酶的新生肽链折叠、转运和保护等糖链在酶的新生肽链折叠、转运和保护等方面普遍起作用。但糖链与成熟酶活性的关方面普遍起作用。但糖链与成熟酶活性的关系因酶而异。有些酶除去糖链活性不受影响系因酶而异。有些酶除去糖链活性不受影响,如如UDP-葡糖醛酸酶葡糖醛酸酶、酵母羧肽酶等。有些酶、酵母羧肽酶等。有些酶的活力依赖其糖链的存在,的活力依赖其糖链的存在, 如如溶酶体溶酶体一葡一葡糖苷酶糖苷酶除去糖链后只有免疫活性而而完全没除去糖链后只有免疫活性而而完全没有酶活力。有酶活力。.糖链与
10、激素活性糖链与激素活性 糖蛋白激素主要有腺垂体促激素类包括糖蛋白激素主要有腺垂体促激素类包括FSH(促卵泡激促卵泡激素素),LH(促黄体生成激素促黄体生成激素)和和TSH(促甲状腺促甲状腺 激素激素)以及胎盘绒毛以及胎盘绒毛膜促性腺激素和肾脏红细胞生成素膜促性腺激素和肾脏红细胞生成素(erytlmpoietin,EPO)等。等。 FSH、LH和和TSH均由均由亚基和亚基和亚基组成亚基组成,两个亚基都有两个亚基都有N一糖一糖链。糖链呈高度不均一性链。糖链呈高度不均一性,例如例如LH和和TSH中精链的外链末端有中精链的外链末端有些为些为SO4-4GalNAc 1,有些为,有些为Sia 2 3Gal
11、 1,而而FSH中中的糖链都是以的糖链都是以 Sia 2 3Gal 1为末端的。已经证明,带为末端的。已经证明,带有有SO4-4GalNAc 1末端结构的激素对受体的亲和力比带有末端结构的激素对受体的亲和力比带有Sia 2 3Gal 1末端的激素高,但在体内的半寿期前者比末端的激素高,但在体内的半寿期前者比后者短后者短,因为在肝脏网状细胞表面有特异结合因为在肝脏网状细胞表面有特异结合SO4-4GalNAc 1为末端的糖链的受体为末端的糖链的受体,而而Sia为末端的糖链则必须经唾液酸为末端的糖链则必须经唾液酸酶水解除去酶水解除去Sia从而暴露从而暴露Gal后才能被半乳糖结合受体识别并后才能被半乳
12、糖结合受体识别并清除。清除。 .糖链与糖链与IgG 活性活性 每分子每分子IgG IgG 均含糖链约三条,几乎全部均含糖链约三条,几乎全部N N一糖链都是复杂型一糖链都是复杂型, ,非还原末端残基为非还原末端残基为SiaSia或或Gal(Gal(去去Sia),Sia),少数为少数为GlcNAc(GlcNAc(去去Sia-Gal), Sia-Gal), IgGIgG的的N-N-糖链多达糖链多达3030余种余种, ,呈高呈高 度不均一性。如度不均一性。如IgGIgG的的N N一糖链缺一糖链缺失外链失外链Gal (Gal (这种糖链称这种糖链称G G0 0 糖链糖链)后)后, ,可成为一种自身抗原可
13、成为一种自身抗原, ,被免被免疫系统识别而产生自身抗体。后者能与带有疫系统识别而产生自身抗体。后者能与带有GoGo糖链的糖链的Ig GIg G生成生成免免疫复合体疫复合体,沉积于关节腔内,沉积于关节腔内, ,引起炎症。这种免疫复合体是引起炎症。这种免疫复合体是由带由带GoGo糖链的糖链的IgGFcIgGFc段段( (作为抗原作为抗原) )和带末端和带末端SiaSia的的IgG(IgG(作为抗体作为抗体)Fab)Fab段结合而成段结合而成, ,实际上是实际上是IgGIgG的自身聚合物。类风湿性关节炎、红斑的自身聚合物。类风湿性关节炎、红斑狼疮狼疮等都是一种与等都是一种与IgGIgG的糖链结构改变
14、有关的自身免疫病的糖链结构改变有关的自身免疫病(autoimmune disease)(autoimmune disease)。.类风湿关节炎类风湿关节炎. 总总 之之 毫无疑问毫无疑问, ,如果试图深入了解生命的复杂规如果试图深入了解生命的复杂规律律, ,就必须有就必须有“基因组蛋白质组糖组基因组蛋白质组糖组”的整体观念的整体观念, ,这样才有可能揭示自身全部基这样才有可能揭示自身全部基因功能因功能, ,从而进一步深入研究疾病的发病机从而进一步深入研究疾病的发病机制制, ,有效控制疾病的发生、发展及预后有效控制疾病的发生、发展及预后, ,以以及筛选疾病、预测诊断标记物和开发新的及筛选疾病、预
15、测诊断标记物和开发新的药物靶标。药物靶标。.2、糖组学的研究策略糖组学的研究策略 糖组学的研究远较基因组学、蛋白质组学复杂。糖组学的研究远较基因组学、蛋白质组学复杂。 目前糖组学关注的焦点是糖蛋白目前糖组学关注的焦点是糖蛋白, ,为了更好地与蛋白质组学相为了更好地与蛋白质组学相关联关联, ,将研究对象锁定为糖肽。研究核心策略为将研究对象锁定为糖肽。研究核心策略为: : (1) (1) 分析单物种生物所产生的所有聚糖分析单物种生物所产生的所有聚糖; ; (2) (2) 以糖肽为研究对象确认编码糖蛋白的基因以糖肽为研究对象确认编码糖蛋白的基因; ; (3) (3) 结合有效的理化和生化性质结合有效
16、的理化和生化性质, ,研究糖蛋白糖链的性质。研究糖蛋白糖链的性质。 研究的重点在于研究的重点在于: : (1) (1) 编码糖蛋白的基因编码糖蛋白的基因; ; (2) (2) 实际糖基化的位点实际糖基化的位点; ; (3) (3) 聚糖结构聚糖结构; ; (4) (4) 糖基化的作用。糖基化的作用。 主要分为三大部分主要分为三大部分: : 结构糖组学、功能糖组学以及生物信息结构糖组学、功能糖组学以及生物信息学学; ;其中结构糖组学主要包括其中结构糖组学主要包括“糖捕获糖捕获”技术、前沿亲和层析技术、前沿亲和层析技术等技术等, ,功能糖组学主要包括微阵列技术等。功能糖组学主要包括微阵列技术等。.
17、3、糖组学研究技术进展、糖组学研究技术进展1 1)结构糖组学)结构糖组学 根据与糖链连接方式不同根据与糖链连接方式不同, ,蛋白质主要有蛋白质主要有N N连接连接和和O O连接连接两种糖基化形式两种糖基化形式: : 前者是糖链与蛋白前者是糖链与蛋白AsnAsnXXXXXXSer/ThrSer/Thr 序列子序列子(XXX (XXX 为除脯氨酸以为除脯氨酸以外的氨基酸外的氨基酸) ) 中中Asn Asn 残基上的残基上的 NH2 NH2 相连相连; ;后者后者则是糖链与蛋白则是糖链与蛋白Ser/Thr Ser/Thr 残基上的残基上的OHOH 相连。相连。N N连接和连接和O O连接糖蛋白主要定
18、位于细胞膜表面连接糖蛋白主要定位于细胞膜表面, ,也可以分泌型蛋白的形式存在。此外也可以分泌型蛋白的形式存在。此外, ,糖蛋白还糖蛋白还有有GPIGPI锚定蛋白和近年来在细胞核和细胞质发现锚定蛋白和近年来在细胞核和细胞质发现的的O OGlcNAcGlcNAc(N-N-乙酰氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖 )修饰蛋白两)修饰蛋白两种存在形式。种存在形式。.A、 N糖链糖链N-糖链的共同结构花式:核心五糖糖链的共同结构花式:核心五糖Glc-葡萄糖;葡萄糖;Gal-半乳糖;半乳糖;Man-甘露糖甘露糖 ;Fru-果糖果糖Rib-核糖;核糖;Fuc-岩藻糖;岩藻糖;Sia-唾液酸;唾液酸;GlcA-葡糖酸葡糖
19、酸GlcUA-糖醛酸;糖醛酸;GlcNAc N-乙酰葡萄糖胺;乙酰葡萄糖胺;GalNAc N-乙酰半乳糖胺;乙酰半乳糖胺;NeuNAc N-乙酰神经氨酸乙酰神经氨酸.N-糖链的分类糖链的分类.复杂型复杂型N-糖链的分支糖链的分支.B、 O糖链糖链特点:与特点:与N-糖链相比结构简单,但连接形式多。糖链相比结构简单,但连接形式多。几种糖蛋白的寡糖链几种糖蛋白的寡糖链.小小 结结 糖链结构信息包括糖链的糖链结构信息包括糖链的单糖组成、异头单糖组成、异头碳构型、糖苷键的连接位置和糖残基的序碳构型、糖苷键的连接位置和糖残基的序列分析列分析等内容。糖蛋白糖链的结构分析包等内容。糖蛋白糖链的结构分析包括糖
20、蛋白的提取分离、糖链释放和糖链结括糖蛋白的提取分离、糖链释放和糖链结构鉴定等多个步骤。构鉴定等多个步骤。.(1)糖蛋白的提取和分离纯化)糖蛋白的提取和分离纯化 糖蛋白多定位于细胞表面糖蛋白多定位于细胞表面, ,属于膜蛋白属于膜蛋白, ,水溶性不水溶性不好好, ,其有效提取是糖组学糖链结构研究的瓶颈之其有效提取是糖组学糖链结构研究的瓶颈之一。目前常采用先制备质膜一。目前常采用先制备质膜, ,然后用然后用CHAPS CHAPS 等去等去污剂释放或污剂释放或Triton XTriton X114 114 相分离、有机溶剂萃相分离、有机溶剂萃取等方法提取糖蛋白。获得的糖蛋白主要采用取等方法提取糖蛋白。
21、获得的糖蛋白主要采用透透析、超滤、电泳和层析等析、超滤、电泳和层析等方法来分离纯化方法来分离纯化, ,其中其中由由几种不同类型凝集素亲合柱组成的序列凝集素几种不同类型凝集素亲合柱组成的序列凝集素亲合层析亲合层析(serial lectin affinity (serial lectin affinity chromatography, SLAC)chromatography, SLAC) 法是较好的方法。法是较好的方法。.SLACSLAC 研究发现,植物凝集素是一类能选择性地结合糖链的糖结合研究发现,植物凝集素是一类能选择性地结合糖链的糖结合蛋白。利用这种特性可以特异性地富集某种糖蛋白蛋白。利
22、用这种特性可以特异性地富集某种糖蛋白/ /糖链。糖链。用于纯化糖蛋白用于纯化糖蛋白/ /糖链的植物凝集素主要有糖链的植物凝集素主要有刀豆凝集素刀豆凝集素(concanavalin A, Con A)(concanavalin A, Con A)、麦胚凝集素、麦胚凝集素(wheat germ (wheat germ agglutinin, WGA)agglutinin, WGA)、豌豆外源凝集素、豌豆外源凝集素(pea lectin)(pea lectin)、植物血、植物血凝素凝素(phytohaemagglutinin-E4 ,E4-PHA) (phytohaemagglutinin-E4 ,
23、E4-PHA) 和网孢盘菌凝集和网孢盘菌凝集素素( (Aleuria aurantia Aleuria aurantia lectin,AAL)lectin,AAL)等。单一一种凝集素并等。单一一种凝集素并不能够富集细胞中所有的糖蛋白不能够富集细胞中所有的糖蛋白/ /糖链,因此科学家们在上糖链,因此科学家们在上世纪世纪8080年代发明了一种被称作连续凝集素亲和色谱年代发明了一种被称作连续凝集素亲和色谱(serial (serial lectin affinitychromatography, SLAC)lectin affinitychromatography, SLAC)的方法来分离同一的方
24、法来分离同一细胞中的各种糖蛋白细胞中的各种糖蛋白/ /糖链。这种方法是将不同的凝集素亲糖链。这种方法是将不同的凝集素亲和柱串联排列,样品混合物依次经过这些亲和柱,这样就可和柱串联排列,样品混合物依次经过这些亲和柱,这样就可将不同的糖蛋白将不同的糖蛋白/ /糖链富集在不同的柱中,提高了糖蛋白糖链富集在不同的柱中,提高了糖蛋白/ /糖糖链的回收效率和混合糖蛋白链的回收效率和混合糖蛋白/ /糖链的分离效果。糖链的分离效果。.The lectins tested recognize the following residues: -D-galactosyl Ricinus communis agglu
25、tinin 120, (RCA-1) and peanut agglutinin, (PNA); -D-galactosyl Griffonia simplicifolia agglutinin (GSA); -D-mannosyl-D- glucosyl concanavalin A (ConA) and Lens culinaris agglutinin (LcH); N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acid Limax flavus agglutinin (LFA) andLimulus polyphemus agglutinin (LPA); N-
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