微生物的生长量的测定方法课件.ppt

1、主讲：李少凤主讲：李少凤.一个微生物细胞一个微生物细胞合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用如果同化作用的速度超过了异化作用 个体的生长个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加 如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就 会发生繁殖，引起个体数目的增加。会发生繁殖，引起个体数目的增加。群体内各个个体的进一步生长群体内各个个体的进一步生长群体的生长群体的生长.群体生长群体生长 = 个体生长个体生长 + 个体

2、繁殖个体繁殖个体生长个体生长 个体繁殖个体繁殖 群体生长群体生长微生物的生长量的测定方法很多，可以根据菌体细胞数量，微生物的生长量的测定方法很多，可以根据菌体细胞数量，菌体体积或质量作直接测定，也可以用某种细胞物菌体体积或质量作直接测定，也可以用某种细胞物 质的质的含量或某个代谢活性的强度作间接测定。含量或某个代谢活性的强度作间接测定。在微生物学中提到的在微生物学中提到的“生长生长”，一般均指群体生长，一般均指群体生长，这一点与研究大型生物时有所不同。这一点与研究大型生物时有所不同。.描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需选用不同的测定指标

3、。选用不同的测定指标。（一）微生物细胞数目的检测法（一）微生物细胞数目的检测法 直接法（血球计数板）直接法（血球计数板） 间接法（平板菌落计数法、间接法（平板菌落计数法、液体稀释法、滤膜过滤液体稀释法、滤膜过滤 法、比浊法法、比浊法）（二）微生物生长量和生理指标测定法（二）微生物生长量和生理指标测定法 细胞干重法；总氮量测定法；其它生理指标测定法细胞干重法；总氮量测定法；其它生理指标测定法二、微生物纯培养生长的测定方法二、微生物纯培养生长的测定方法.原理原理：将：将1cm20.1mm的薄层空间划分为的薄层空间划分为400小格，从小格，从中均匀分布地选取中均匀分布地选取80或或100小格，计数其

4、中的细胞数目，小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。换算成单位体积中的细胞数。适用范围适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。特点特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出率，或：快速，准确，对酵母菌可同时测定出率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。（一）微生物细胞数目的检测法（一

5、）微生物细胞数目的检测法1、血球计数板直接计数法、血球计数板直接计数法.血球计数板是一块特别的厚玻璃片，玻片上有四血球计数板是一块特别的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴。中央有一短横沟和两个平台，两条沟和两条嵴。中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表面比两个平台的表面高嵴的表面比两个平台的表面高0.1mm，每个平台，每个平台上刻有不同规格的格网，中央上刻有不同规格的格网，中央1mm2面积上刻有面积上刻有400个小方格个小方格(图图A)。盖玻片盖玻片计数室计数室.在血球计数板上，刻有一些符号和数字在血球计数板上，刻有一些符号和数字(图图A)，其，其含义是：含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，

6、表示为计数板的型号和规格，表示此计数板分此计数板分25大格；大格；0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高；为盖上盖玻片后计数室的高；1/400mm2表示将计数室面积表示将计数室面积1mm2分分400个小格，个小格，每小格面积是每小格面积是1/400 mm2。.血球计数板有两种规格，一种是将血球计数板有两种规格，一种是将1mm2面积分为面积分为25个个大格，每大格再分为大格，每大格再分为16个小格个小格(2516)；另一种是；另一种是16个个大格，每个大格再分为大格，每个大格再分为25个小格个小格(1625)。两者都是总。两者都是总共有共有400个小格。当专用盖玻片置于两条嵴上，从两个个小格。当专用

7、盖玻片置于两条嵴上，从两个平台侧面加入菌液后，平台侧面加入菌液后，400个小方格个小方格(1mm2面积面积)计数室计数室上形成上形成0.1mm3的体积。通过对一定大格内微生物数量的体积。通过对一定大格内微生物数量的统计，可计算出的统计，可计算出1mL菌液所含的菌体数（图菌液所含的菌体数（图B)。C C 两种不同刻度的计数板两种不同刻度的计数板.计数区的结构计数区的结构原液所含菌体数（原液所含菌体数（mL）=每小格平均菌体数每小格平均菌体数400104稀释倍数稀释倍数.平板菌落计数法平板菌落计数法2. 间接计数法间接计数法将待测样品进行适将待测样品进行适当稀释，取一定的当稀释，取一定的菌悬液涂布

8、平板，菌悬液涂布平板，让微生物的单细胞让微生物的单细胞一一分散在平板上一一分散在平板上，经适宜条件培养，经适宜条件培养，每个活细胞就会，每个活细胞就会形成单菌落，然形成单菌落，然后将形成的菌落数后将形成的菌落数乘以稀释倍数，就乘以稀释倍数，就可推算出样品的含可推算出样品的含菌数。菌数。.特点：特点：简单，灵敏，适用于细菌、酵母菌、芽孢与真菌孢简单，灵敏，适用于细菌、酵母菌、芽孢与真菌孢子等数量的测定。子等数量的测定。不适合测定样品中丝状体微生物，如放线菌、丝状不适合测定样品中丝状体微生物，如放线菌、丝状真菌及丝状蓝细菌的营养体。真菌及丝状蓝细菌的营养体。样品中的稀释度控制在每个平板上菌落数在样

9、品中的稀释度控制在每个平板上菌落数在30300个最好，过多难以计数，过少增大计数误差。个最好，过多难以计数，过少增大计数误差。平板菌落计数法平板菌落计数法.技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15152020min完成操作），严格无菌操作；完成操作），严格无菌操作；注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；混匀处理，倾注平板时的培养基温度；平板菌落计数法平板菌落计数法.液体稀释法液体稀释法 将待测样品作一系列稀释，一直稀释到取少量该稀释液将待测样品作一系列稀释，一直稀释到取少

10、量该稀释液(如如1mL)接种到新鲜培养基中没有出现生长繁殖为止。接种到新鲜培养基中没有出现生长繁殖为止。具体做法是取单细胞菌悬液在定量培养基中做系列稀释培具体做法是取单细胞菌悬液在定量培养基中做系列稀释培养，在一定稀释度以前的培养基中接上菌，出现生长，而养，在一定稀释度以前的培养基中接上菌，出现生长，而在这个稀释度以后的培养液中没有接上菌，不出现在这个稀释度以后的培养液中没有接上菌，不出现 菌的生菌的生长，这最后一级出现菌生长的稀释度称为临界级数，从长，这最后一级出现菌生长的稀释度称为临界级数，从35次重复的临界级数求最大概率数次重复的临界级数求最大概率数(MPN)，就可得到较，就可得到较可靠

11、的结果。可靠的结果。2. 间接计数法间接计数法.例如：某一细菌在稀释计数法中的生长情况如下：例如：某一细菌在稀释计数法中的生长情况如下： 稀释度稀释度10-310-410-510-610-710-8重复数重复数555555出现生出现生长的管长的管数数555410 根据上述结果，其数量指标为根据上述结果，其数量指标为“541”，查，查5次重复测数统计次重复测数统计表，得近似值为表，得近似值为17。乘以第一位数的稀释倍数（。乘以第一位数的稀释倍数（105 ），）， 则原液中的活菌数则原液中的活菌数=17100000=1.7106 . 5 5次次 重重 复复 测测 数数 统统 计计 表表 数 量 指

12、 标 数 量 指 标 1 0 0 1 0 - 1 1 0 - 2 近 似 值 1 0 0 1 0 - 1 1 0 - 2 近 似 值 0 1 0 0 . 1 8 5 0 0 2 . 3 1 0 0 0 . 2 0 5 0 1 3 . 1 1 1 0 0 . 4 0 5 1 0 3 . 3 0 0 0 0 . 4 5 5 1 1 4 . 6 0 0 1 0 . 6 8 5 2 0 4 . 9 0 1 0 0 . 6 8 5 2 1 7 . 0 0 2 0 0 . 9 3 5 2 2 9 . 5 3 0 0 0 . 7 8 5 3 0 7 . 9 3 0 1 1 . 1 5 3 1 1 1 . 0

13、 3 1 0 1 . 1 5 3 2 1 4 . 0 3 2 0 1 . 4 5 4 0 1 3 . 0 4 0 0 1 . 3 5 4 1 1 7 . 0 4 0 1 1 . 7 5 4 2 2 2 . 0 4 1 0 1 . 7 5 4 3 2 8 . 0 4 1 1 2 . 1 5 5 0 2 4 . 0 4 2 0 2 . 2 5 5 1 3 5 . 0 4 2 1 2 . 6 5 5 2 5 4 . 0 4 3 0 2 . 7 5 5 3 9 2 . 0 .薄膜过滤计数法薄膜过滤计数法常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目物数目。将定量

14、的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。品中所含菌数。2. 间接计数法间接计数法.在科研及生产中，及时了解微生物的生长情况，测定培养在科研及生产中，及时了解微生物的生长情况，测定培养物中微生物的数量，便于适时控制培养条件，获得最佳培物中微生物的数量，便于适时控制培养条件，获得最佳培养物，比浊法是最常用的测定方法。养物，比浊法是最常用的测定方法。是在浊度计或比色计上进行测定培养液中微生物的数

15、量。是在浊度计或比色计上进行测定培养液中微生物的数量。某一波长的光线，通过浑浊的液体后，其光强度将被减弱。某一波长的光线，通过浑浊的液体后，其光强度将被减弱。入射光一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，入射光一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。反应出菌液的浓度。特点：快速、简便；但易受干扰。特点：快速、简便；但易受干扰。比浊法比浊法2. 间接计数法间接计数法.L

16、ogItIo Kcd=It：透过光的强度；：透过光的强度；Io：入射光的强度；：入射光的强度；K：吸光系数；：吸光系数；c：样品液的浊度；：样品液的浊度；d：液层厚度；：液层厚度；透光度透光度LogIt Io称消光系数，简称称消光系数，简称OD.当样品液厚度一定，则当样品液厚度一定，则OD值与样品的浊度值与样品的浊度C有有关，通过测定样品的关，通过测定样品的OD值来代表培养液中的浊值来代表培养液中的浊度即微生物量。度即微生物量。. 本法测定的是微生物的总量。本法测定的是微生物的总量。 适用于非丝状单细胞微生物，如细菌的测定。适用于非丝状单细胞微生物，如细菌的测定。 当待测菌液浓度太大时，要经过

17、适当稀释。使当待测菌液浓度太大时，要经过适当稀释。使 OD值的读数在一定范围内最好。值的读数在一定范围内最好。比浊法比浊法.将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤的方法分离出将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤的方法分离出来来,用清水反复洗涤菌体，直接称重，可得菌体湿重。再用清水反复洗涤菌体，直接称重，可得菌体湿重。再经常压或真空干燥，干燥温度可在经常压或真空干燥，干燥温度可在105、100或或80下至恒重，精确称重，即得微生物的干重。下至恒重，精确称重，即得微生物的干重。 丝状真菌用滤纸过滤丝状真菌用滤纸过滤 ，细菌用醋酸纤维膜等过滤。，细菌用醋酸纤维膜等过滤。 在琼脂平板上培养的放线菌或丝状

18、真菌经短时间高温在琼脂平板上培养的放线菌或丝状真菌经短时间高温待琼脂溶化后滤出菌丝，洗净、烘干后测干重。该法适待琼脂溶化后滤出菌丝，洗净、烘干后测干重。该法适合于含菌量，而且样品中不含非菌体的干物质。合于含菌量，而且样品中不含非菌体的干物质。1、细胞干重法、细胞干重法（二）（二） 细胞生物量的测定细胞生物量的测定.内容：内容： 将青霉菌接种于适宜的液体培养基中。将青霉菌接种于适宜的液体培养基中。2828震荡培震荡培养养5 57d7d，取定量滤纸一张，在分析天平上称重，取定量滤纸一张，在分析天平上称重a a，取，取出青霉菌培养物放在滤纸上过滤，沥干，然后置于出青霉菌培养物放在滤纸上过滤，沥干，然

19、后置于80 80 干燥箱中烘干至恒重干燥箱中烘干至恒重b b。 菌体的干重菌体的干重=b-a=b-a仪器：分析天平、定量滤纸、电热干燥箱仪器：分析天平、定量滤纸、电热干燥箱菌种：青霉菌的振荡培养物菌种：青霉菌的振荡培养物举例：测定培养液中青霉菌的重量举例：测定培养液中青霉菌的重量.2、总氮量测定法、总氮量测定法 蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。 一般细菌细胞干重的含氮量为一般细菌细胞干重的含氮量为12%15%，酵母菌，酵母菌为为7.5%，霉菌为

20、，霉菌为6.5%，因此只要用化学法分析法（凯，因此只要用化学法分析法（凯氏定氮法）测定出待测样品的含氮量，就能推算出细氏定氮法）测定出待测样品的含氮量，就能推算出细胞的生物量。胞的生物量。 本法适用于在固体或液体培养条件下微生物总生物本法适用于在固体或液体培养条件下微生物总生物量的测定，但需充分洗涤菌体以除去含氮杂质，操作量的测定，但需充分洗涤菌体以除去含氮杂质，操作程序较复杂，一般很少采用。程序较复杂，一般很少采用。. 微生物细胞中的微生物细胞中的DNA含量不高含量不高(如大肠杆如大肠杆菌约占菌约占3%4%)，比较稳定，有人估算，比较稳定，有人估算出每一个细菌细胞平均含出每一个细菌细胞平均含

21、DNA 8.410-5 ng，因而可以根据分离出样品中的，因而可以根据分离出样品中的DNA含量来计算微生物的生物量。含量来计算微生物的生物量。3、其他方法、其他方法DNA含量测定法含量测定法. 测定单位体积培养物在单位时间内消耗的营养物测定单位体积培养物在单位时间内消耗的营养物或或O2的数量，或者测定微生物代谢过程中的产酸的数量，或者测定微生物代谢过程中的产酸量或量或CO2量等，均可以在一定程度上反映微生物量等，均可以在一定程度上反映微生物的生物量。本法系间接法，影响因素较多，误差的生物量。本法系间接法，影响因素较多，误差也较大，仅在特定条件下作比较分析时使用。也较大，仅在特定条件下作比较分析

22、时使用。代谢活性法代谢活性法.Table 2. Some Methods used to measure bacterial growthMethodApplicationCommentsDirect microscopic countEnumeration of bacteria in milk or cellular vaccinesCannot distinguish living from nonliving cellsViable cell count (colony counts)Enumeration of bacteria in milk, foods, soil, water

23、, laboratory cultures, etc.Very sensitive if plating conditions are optimalTurbidity measurementEstimations of large numbers of bacteria in clear liquid media and brothsFast and nondestructive, but cannot detect cell densities less than 107 cells per mlMeasurement of total N or proteinMeasurement of

24、 total cell yield from cultures very dense only practical application is in the research laboratoryMeasurement of Biochemical activity e.g. O2 uptake CO2 production, ATP production, etc.Microbiological assaysRequires a fixed standard to relate chemical activity to cell mass and/or cell numbersMeasurement of dry weight or wet weight of cells or volume of cells after centrifugationMeasurement of total cell yield in cultures probably more sensitive than total N or total protein measurements.