蛋白质纯化技术课件.ppt

1、蛋白质的分离纯化与鉴定蛋白质的分离纯化与鉴定Isolation, Purification and Identification of Isolation, Purification and Identification of ProteinProtein分子生物学圣经分子生物学圣经分子克隆实验指南分子克隆实验指南为什么要纯化蛋白质？为什么要纯化蛋白质？理论意义：理论意义：深入研究某种蛋白质的功能深入研究某种蛋白质的功能以及作用机制，如信号通路中的蛋白以及作用机制，如信号通路中的蛋白质质应用价值应用价值-蛋白质工程蛋白质工程 医药、工业、科研医药、工业、科研 作为药物靶点作为药物靶点蛋白质是生

2、命功能的执行者蛋白质是生命功能的执行者蛋白质工程中进行蛋白质纯化的必要性蛋白质工程中进行蛋白质纯化的必要性 首先，需要单一的蛋白质作为实验材料，首先，需要单一的蛋白质作为实验材料，研究其结构与功能研究其结构与功能； 其次，其次，对蛋白质进行修饰改造对蛋白质进行修饰改造时需要单时需要单一的蛋白质作为原材料；一的蛋白质作为原材料； 最后，为了生产性能更优良的蛋白质，最后，为了生产性能更优良的蛋白质，需要对设计改造过的蛋白质进行大量纯需要对设计改造过的蛋白质进行大量纯化，从而化，从而开发出相关产品开发出相关产品。本章概要本章概要蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法蛋白质纯化原则蛋白质纯化原则纯化步骤纯化步骤

3、蛋白质的鉴定蛋白质的鉴定一、蛋白纯化方法一、蛋白纯化方法蛋白质纯化的根据：蛋白质纯化的根据： 不同的蛋白质，理化性质不同。不同的蛋白质，理化性质不同。理化性质不同的原因：理化性质不同的原因： 氨基酸的数目和序列不同。氨基酸的数目和序列不同。1.1.与蛋白质分离纯化相关的理化特性与蛋白质分离纯化相关的理化特性分子大小分子大小分子形状分子形状带电特性带电特性溶解特性溶解特性与配体特异性结合不同与配体特异性结合不同吸附性质吸附性质变性和复性变性和复性1.11.1分子大小分子大小蛋白质分子大小主要取决于：蛋白质分子大小主要取决于： 蛋白质肽链的数目蛋白质肽链的数目 每条肽链的氨基酸残基数目。每条肽链的

4、氨基酸残基数目。几百几百 百万百万 DaDa常用方法常用方法 透析透析 超滤超滤 凝胶过滤凝胶过滤 离心离心 透析透析(dialysis)(dialysis)利用利用透析袋透析袋把大把大分子蛋白质与小分子蛋白质与小分子化合物分开分子化合物分开的方法。的方法。 超滤法超滤法 应用应用正压或离心力正压或离心力使蛋白质溶液透过使蛋白质溶液透过有一定截留分子量有一定截留分子量的超滤膜的超滤膜，达到浓，达到浓缩蛋白质溶液的目缩蛋白质溶液的目的。的。 超滤法超滤法 应用应用正压或离心力正压或离心力使蛋白质溶液透过使蛋白质溶液透过有一定截留分子量有一定截留分子量的超滤膜的超滤膜，达到浓，达到浓缩蛋白质溶液的

5、目缩蛋白质溶液的目的。的。凝胶过滤凝胶过滤 是按照天然蛋白质是按照天然蛋白质相对分子相对分子质量大小质量大小进行分离的技术，又称进行分离的技术，又称为为分子筛层析或排阻层析分子筛层析或排阻层析。 超速离心超速离心离心离心（centrifugationcentrifugation）：利用机械的快：利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同密度的速旋转所产生的离心力，将不同密度的物质分离开来的方法。物质分离开来的方法。 超速离心法超速离心法 (ultracentrifugation)(ultracentrifugation)：6060万万 g g ， 6 6万万88万万 r/minr/min。可用来

6、测定。可用来测定蛋白质分子量。蛋白质分子量。超速离心超速离心1.21.2分子形状分子形状形状形状 蛋白质在蛋白质在离心离心通过溶液时，或通过通过溶液时，或通过膜膜、凝凝胶过滤填料颗粒胶过滤填料颗粒或或电泳凝胶电泳凝胶中时，都会受中时，都会受到分子形状的影响。到分子形状的影响。方法方法 梯度离心梯度离心 电泳电泳1.31.3电荷电荷原理原理蛋白质的净电荷与蛋白质蛋白质的净电荷与蛋白质等电点等电点pIpI以以及及环境环境pHpH值值有关（有关（pHpIpHpI，），）方法方法电泳电泳离子交换层析离子交换层析1.41.4溶解度溶解度原理原理 蛋白质分子表面蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基团亲水性和

7、疏水性带电基团不同不同，因此在溶剂中的溶解度不同。，因此在溶剂中的溶解度不同。 通过通过改变改变pHpH、离子强度离子强度或或加入有机试剂加入有机试剂，促进蛋白质分子的凝聚进而形成沉淀。促进蛋白质分子的凝聚进而形成沉淀。方法：沉淀法方法：沉淀法 盐析法（盐析法（eg. eg. 硫酸铵）硫酸铵） 有机溶剂沉淀法（有机溶剂沉淀法（eg. eg. 丙酮）丙酮） 等电点沉淀法等电点沉淀法 蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出，蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出，称为称为盐析。盐析。 盐析原理：盐析原理： 高浓度盐离子破坏蛋白质高浓度盐离子破坏蛋白质分子表面的水化分子表面的水化膜膜，影响蛋白质，影响蛋

8、白质分子表面所带电荷分子表面所带电荷，从而，从而引起蛋白质沉淀，但通常不会引起蛋白质引起蛋白质沉淀，但通常不会引起蛋白质的变性。的变性。盐析法盐析法1.51.5配体特异性结合配体特异性结合 原理原理 生物大分子的某些特定结构区域能够生物大分子的某些特定结构区域能够特异性识特异性识别其他分子别其他分子并并可逆结合可逆结合，生物分子间的这种结，生物分子间的这种结合能力称为合能力称为亲和力亲和力。 方法方法 将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性对另一个分子进行分离纯化。性对另

9、一个分子进行分离纯化。 分类分类 免疫亲和层析免疫亲和层析 生物亲和层析生物亲和层析 金属螯合亲和层析金属螯合亲和层析1.61.6吸附性质吸附性质 原理原理 蛋白质可吸附在不同材料的表面，如金蛋白质可吸附在不同材料的表面，如金属、陶瓷、塑料等。属、陶瓷、塑料等。 方法方法 疏水层析疏水层析1.71.7变性和复性变性和复性 原理原理 变性：变性：蛋白质在一定的理化条件下会失去原有蛋白质在一定的理化条件下会失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化特性。的空间结构、生物学功能及部分理化特性。 复性：复性：当变性条件去除后恢复原有的空间结构当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物学功能。及生物学功能。

10、 方法方法 如，利用尿素的变性和复性方法，从包涵体中如，利用尿素的变性和复性方法，从包涵体中纯化原核表达蛋白纯化原核表达蛋白2. 2. 分离方法分离方法在实验操作上，分为：在实验操作上，分为：沉淀法沉淀法离心法离心法电泳法电泳法超滤法超滤法相分配法相分配法层析法层析法* *不可能有一套统一的方法适用于分离纯不可能有一套统一的方法适用于分离纯化所有的蛋白质，化所有的蛋白质，* *但每一种蛋白质但每一种蛋白质可能可能都有一套适合的分都有一套适合的分离纯化程序，离纯化程序，* *而且所用的主要技术手段都基本相同。而且所用的主要技术手段都基本相同。NoteNote二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤二、蛋

11、白质纯化的总原则和纯化步骤总原则总原则以合理的效率、速度、收率和纯度，以合理的效率、速度、收率和纯度，将目标蛋白从细胞的全部其他成分，将目标蛋白从细胞的全部其他成分，特别是从杂蛋白中分离出来，特别是从杂蛋白中分离出来，同时仍保留其生物学活性和化学完整同时仍保留其生物学活性和化学完整性。性。二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤步骤步骤选择实验材料，实验材料预处理选择实验材料，实验材料预处理蛋白质的提取蛋白质的提取蛋白质的粗分级蛋白质的粗分级蛋白质的细分级蛋白质的细分级蛋白质的鉴定蛋白质的鉴定 蛋白质纯化的前期准备蛋白质纯化的前期准备 关于蛋白质我们已知什么？关于蛋白质

12、我们已知什么？最好的来源？最好的来源？蛋白质纯度要求？活性要求？蛋白质纯度要求？活性要求？纯化蛋白的量？纯化蛋白的量？如何进行鉴定？如何进行鉴定？纯化时间长短？纯化时间长短？最终花费？最终花费？纯化方案？纯化方案？1 1、选择实验材料及预处理、选择实验材料及预处理选择实验材料选择实验材料 物种的选择物种的选择 组织的选择组织的选择实验材料预处理实验材料预处理 液体材料液体材料过滤过滤离心离心 固体材料固体材料洗涤：自来水洗涤：自来水蒸馏水蒸馏水提取缓冲液提取缓冲液材料破碎：材料破碎：材料破碎材料破碎机械剪碎机械剪碎研磨研磨反复冻融法反复冻融法超声破碎法超声破碎法高压匀浆法高压匀浆法酶解法酶解法

13、2 2、蛋白质的提取、蛋白质的提取提取分离原则提取分离原则 尽可能多地提取目的蛋白，同时避免活性尽可能多地提取目的蛋白，同时避免活性丢失丢失（温度过高、（温度过高、 pHpH、有机试剂、金属、有机试剂、金属离子、蛋白酶等因素）离子、蛋白酶等因素） 选择合适的选择合适的pHpH、选择合适的离子强度、选择合适的离子强度2 2、蛋白质的提取、蛋白质的提取 提取液成分的确定提取液成分的确定 pH pH 缓冲液：缓冲液：Tris-HCl, Tris-Gly, Gly-HCl, Tris-HCl, Tris-Gly, Gly-HCl, 柠檬酸柠檬酸- -柠檬酸钠柠檬酸钠 离子：离子：动物动物 NaCl,

14、NaCl, 植物植物KClKCl 还原剂还原剂: :DTTDTT 蛋白酶抑制剂：蛋白酶抑制剂：EDTA, PMSFEDTA, PMSF 金属离子螯合剂金属离子螯合剂: : EDTA, EGTAEDTA, EGTA去污剂去污剂:SDS, CHAPS, Triton X-100, :SDS, CHAPS, Triton X-100, Tween-20Tween-20甘油甘油 温度温度 04043 3、蛋白质的粗分级（粗提）、蛋白质的粗分级（粗提） 使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低，蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低，采取

15、一些简单的方法采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩，使目标蛋白质浓缩，同时去除大量的杂质同时去除大量的杂质。 常用的实验技术：常用的实验技术：沉淀法（盐析、有机溶沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀）、超速离心、透析、剂沉淀、等电点沉淀）、超速离心、透析、超滤超滤4 4、蛋白质的细分级、蛋白质的细分级 粗分级只是使蛋白质得到浓缩和初步分离粗分级只是使蛋白质得到浓缩和初步分离纯化，多数情况下纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大还要根据蛋白质分子大小、分子形状、分子表面特征或分子带电小、分子形状、分子表面特征或分子带电状况进一步纯化状况进一步纯化。 常用的实验技术：常用的实验技术：层析层析4.1.

16、 4.1. 层析层析（ chromatography chromatography ）固定相：凝胶固定相：凝胶流动相：缓冲液流动相：缓冲液原理：原理：BioGelA agaroseBioGel P acrylamideSephadex glucose (dextrose)Sepharose agaroseSephacryl glucose + acrylamideSephacel cellulose 层析装置层析装置（Chromatographic equipmentChromatographic equipment）蠕动泵蠕动泵层析柱层析柱检测器检测器记录仪记录仪部分收集器部分收集器 4.1

17、. 4.1. 层析层析（ chromatography chromatography ） 分子筛层析分子筛层析（ Gel filtration Gel filtration ） 离子交换层析离子交换层析（ Ion exchange Ion exchange ） 疏水作用层析疏水作用层析（ Hydrophobic interaction Hydrophobic interaction ） 亲和层析亲和层析（ Affinity Affinity ）可编辑4.1.1 4.1.1 分子筛层析分子筛层析 （Gel filtrationGel filtration） 原理原理 也称为凝胶过滤、排阻层析。是

18、以也称为凝胶过滤、排阻层析。是以多孔凝胶多孔凝胶材材料为支持物，当蛋白质溶液流经此支持物时，料为支持物，当蛋白质溶液流经此支持物时，分子大小不同分子大小不同的蛋白质所受到的的蛋白质所受到的阻滞作用不同阻滞作用不同而而先后流出先后流出，从而达到分离纯化的目的。，从而达到分离纯化的目的。 凝胶介质凝胶介质 葡聚糖葡聚糖 （glucoseglucose） 琼脂糖琼脂糖 （agaroseagarose） 聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（acrylamideacrylamide） 纤维素（纤维素（cellulosecellulose）分子筛层析分子筛层析Gel filtration chromatography

19、Gel filtration chromatographyHydrophilicNo spontaneous binding to proteins.Chemically and physically stableRigid to allow a high linear flow-rate亲水亲水对蛋白质亲和力低对蛋白质亲和力低物理化学性质稳定物理化学性质稳定流速稳定流速稳定分子筛层析分子筛层析Gel filtration chromatographyGel filtration chromatography分子筛层析分子筛层析Gel filtration chromatographyGel

20、filtration chromatography 分子筛层析分子筛层析Gel filtration chromatographyGel filtration chromatography 4.1.2 4.1.2 离子交换层析离子交换层析（ Ion exchange Ion exchange ）原理原理 在一定的在一定的pHpH条件下，不同的蛋白质带有的条件下，不同的蛋白质带有的电荷的种类和数量不同电荷的种类和数量不同，因此它们，因此它们与带电与带电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。 利用蛋白质和带电凝胶之间作用力的差别，利用蛋白质和带电凝胶之间作用力的差别，把蛋白

21、质分开的层析方法。把蛋白质分开的层析方法。4.1.2 4.1.2 离子交换层析离子交换层析（ Ion exchange Ion exchange ）种类种类 阳离子交换柱阳离子交换柱：凝胶带负电荷，蛋白质带：凝胶带负电荷，蛋白质带正电荷正电荷 阴离子交换柱阴离子交换柱：凝胶带正电荷，蛋白质带：凝胶带正电荷，蛋白质带负电荷负电荷介质介质 惰性支持物惰性支持物：琼脂糖，葡聚糖：琼脂糖，葡聚糖 带电基团带电基团：羧甲基：羧甲基带负电；二乙基氨带负电；二乙基氨基基带正电带正电 平衡离子平衡离子： 负电基团：负电基团：H H+ +或或NaNa+ + 正电基团：正电基团：OHOH- -或或ClCl- -离

22、子交换层析离子交换层析（ Ion exchange Ion exchange ）阳离子交换：阳离子交换：阴离子阴离子 先，先，阳离子阳离子 后后阴离子交换：阴离子交换：阳离子阳离子 先，先，阴离子阴离子 后后4.1.3 4.1.3 亲和层析亲和层析（Affinity Affinity chromatographychromatography）原理原理 利用利用蛋白质与配体专一性识别并结合蛋白质与配体专一性识别并结合的特的特性而分离蛋白质的一种层析方法。性而分离蛋白质的一种层析方法。 将配体固定于支持物上，当混合样品流过将配体固定于支持物上，当混合样品流过此支持物时，此支持物时，只有目标蛋白能与

23、配体专一只有目标蛋白能与配体专一性结合性结合。先用缓冲液洗脱杂蛋白，然后改。先用缓冲液洗脱杂蛋白，然后改变洗脱条件，将目标蛋白洗脱下来。变洗脱条件，将目标蛋白洗脱下来。亲和层析亲和层析（Affinity chromatography）His-His-亲合示意图（亲合示意图（金属螯合层析金属螯合层析） 镍柱（镍柱（Ni-NTANi-NTA）4.1.4 4.1.4 疏水作用层析疏水作用层析 原理原理 蛋白质表面疏水基团与介质疏蛋白质表面疏水基团与介质疏水配体的可逆相互作用水配体的可逆相互作用 方法方法 高离子强度下待分离的样品吸高离子强度下待分离的样品吸附在疏水介质上，然后降低离附在疏水介质上，然

24、后降低离子强度选择性将样品解吸，子强度选择性将样品解吸，疏疏水弱的物质先洗脱，疏水强的水弱的物质先洗脱，疏水强的物质后洗脱物质后洗脱。4.2.4.2.电泳电泳（ ElectrophoresisElectrophoresis ） 电泳就是带电颗粒在电场作用下，向着与其电泳就是带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动。电性相反的电极移动。蛋白质常用电泳技术蛋白质常用电泳技术 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE） SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGESDS-PAGE） 等电聚焦电泳等电聚焦电泳（ Isoelectric focusing-

25、 IEFIsoelectric focusing- IEF） 双向电泳双向电泳（ Two Dimensional ElectrophoresisTwo Dimensional Electrophoresis ）4.2.1 SDS4.2.1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDSSDS： 1、覆盖蛋白质表面电荷，消除电荷差异、覆盖蛋白质表面电荷，消除电荷差异 2、改变蛋白质分子构象，消除形状差异、改变蛋白质分子构象，消除形状差异电泳法测目标蛋白的分子量电泳法测目标蛋白的分子量4.2.24.2.2不连续不连续PAGEPAGE分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理 在不连续电泳系统中，所带电荷

26、、分子大小在不连续电泳系统中，所带电荷、分子大小和形状不同的蛋白质在凝胶中能够被分离。和形状不同的蛋白质在凝胶中能够被分离。 原理原理 电荷效应电荷效应 浓缩效应浓缩效应快慢离子效应快慢离子效应凝胶浓度差效应凝胶浓度差效应 分子筛效应分子筛效应4.2.3 4.2.3 等电聚焦电泳等电聚焦电泳（Isoelectric focusingIsoelectric focusingIEFIEF）等电聚焦等电聚焦（Isoelectric focusing）4.2.4 4.2.4 双向电泳双向电泳 第一向：等电聚焦第一向：等电聚焦 （pIpI） 第二向：第二向：SDS-PAGE (MW)SDS-PAGE (

27、MW) 双向电泳技术是双向电泳技术是蛋白质组学蛋白质组学研究中蛋白质多研究中蛋白质多肽链分离纯化和鉴定的主要实验技术之一。肽链分离纯化和鉴定的主要实验技术之一。Isoelectric Isoelectric focusingfocusingSDS gel SDS gel electrophoresiselectrophoresisTwo Dimensional Electrophoresis of E. coli Two Dimensional Electrophoresis of E. coli ProteinsProteins - more than 2,000 proteins were

28、 visualized- more than 2,000 proteins were visualized蛋白质纯化策略蛋白质纯化策略方案设计篇方案设计篇 Protein purification strategyProtein purification strategy三、纯化方案设计原则三、纯化方案设计原则确定纯化目标确定纯化目标purity, activity and quantitypurity, activity and quantity充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性to simplify technique selection and to

29、 simplify technique selection and optimisationoptimisation确定活性测定方法确定活性测定方法fast detection of protein activity/recovery fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants and critical contaminants 尽量减少纯化步骤尽量减少纯化步骤extra steps reduce yield and increase time, extra steps reduce yield a

30、nd increase time, combine steps logicallycombine steps logically确定纯化目标确定纯化目标三、纯化方案设计原则三、纯化方案设计原则确定目标确定目标purity, activity and quantitypurity, activity and quantity充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性to simplify technique selection and to simplify technique selection and optimisationoptimisation确定活性测定

31、方法确定活性测定方法fast detection of protein activity/recovery fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants and critical contaminants 尽量减少纯化步骤尽量减少纯化步骤extra steps reduce yield and increase time, extra steps reduce yield and increase time, combine steps logicallycombine steps logically

32、三、纯化方案设计原则三、纯化方案设计原则确定目标确定目标purity, activity and quantitypurity, activity and quantity充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性to simplify technique selection and to simplify technique selection and optimisationoptimisation确定活性测定方法确定活性测定方法fast detection of protein activity/recovery fast detection of prot

33、ein activity/recovery and critical contaminants and critical contaminants 尽量减少纯化步骤尽量减少纯化步骤extra steps reduce yield and increase time, extra steps reduce yield and increase time, combine steps logicallycombine steps logically 严格依据目标蛋白质的严格依据目标蛋白质的特殊生物学性质特殊生物学性质，来，来设计活性检测方案设计活性检测方案 常见检测方法常见检测方法: : 酶学检测

34、酶学检测 enzymatic assays.enzymatic assays. 配体检测配体检测 ligand-binding assaysligand-binding assays 免疫检测免疫检测 immunological assaysimmunological assays活性测定方法的要求：快速、简便、特异和定量活性测定方法的要求：快速、简便、特异和定量确定活性检测方法确定活性检测方法三、纯化方案设计原则三、纯化方案设计原则确定目标确定目标purity, activity and quantitypurity, activity and quantity充分了解目的蛋白及主要杂质的理

35、化特性充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性to simplify technique selection and to simplify technique selection and optimisationoptimisation确定活性测定方法确定活性测定方法fast detection of protein activity/recovery fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants and critical contaminants 尽量减少纯化步骤尽量减少纯化步骤extra steps

36、 reduce yield and increase time, extra steps reduce yield and increase time, combine steps logicallycombine steps logically尽量减少纯化步骤尽量减少纯化步骤 纯化步骤越多，样品损失越大（产量、活性）纯化步骤越多，样品损失越大（产量、活性） 减少每步操作时间减少每步操作时间 to avoid lengthy procedures which risk losing activity/reducing recovery 减少添加物减少添加物 additives may need

37、 to be removed in an extra purification step or may interfere with activity assays 早期除去降解物（如蛋白酶）早期除去降解物（如蛋白酶） for example, proteases 每步使用不同的纯化方法每步使用不同的纯化方法 to take advantage of sample characteristics which can be used for separation (size, charge, hydrophobicity, ligand specificity)KEEP IT SIMPLE!KE

38、EP IT SIMPLE!尽量减少纯化步骤尽量减少纯化步骤四、蛋白质的鉴定四、蛋白质的鉴定 1. 1. 浓度测定：浓度测定：凯氏定氮法、紫外吸收法凯氏定氮法、紫外吸收法 2. 2. 纯度测定：纯度测定：电泳法电泳法 3. 3. 特性测定：特性测定： 蛋白质分子质量与等电点的测定蛋白质分子质量与等电点的测定 氨基酸组成及顺序分析氨基酸组成及顺序分析 蛋白质结晶与结构分析蛋白质结晶与结构分析 蛋白质活性及功能测定蛋白质活性及功能测定1 1 浓度测定浓度测定凯氏定氮法凯氏定氮法紫外吸收法紫外吸收法分光光度法分光光度法考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法1 1 浓度测定浓度测定凯氏定氮法：凯氏定氮法： 蛋白质平均

39、含氮量为蛋白质平均含氮量为1616，首先测定氮的，首先测定氮的含量，进而估算蛋白质的含量。含量，进而估算蛋白质的含量。紫外吸收法紫外吸收法 芳香族氨基酸在芳香族氨基酸在280nm280nm附近有最大光吸收。附近有最大光吸收。1 1 浓度测定浓度测定分光光度法分光光度法 蛋白质样品与特定的蛋白质样品与特定的显色剂反应显色剂反应，反应产物在反应产物在特定波长的光吸收特定波长的光吸收与蛋白质含量与蛋白质含量成正比，利用成正比，利用标准曲线标准曲线即可查得样品的蛋白即可查得样品的蛋白质含量。质含量。考马斯亮兰法等考马斯亮兰法等2. 2. 纯度鉴定纯度鉴定鉴定方法鉴定方法 色谱纯色谱纯：在层析图谱中只有

40、一个洗脱峰在层析图谱中只有一个洗脱峰 电泳纯电泳纯：在电泳图谱中只有一条电泳条带在电泳图谱中只有一条电泳条带 结晶纯：结晶纯：能够获得蛋白质晶体能够获得蛋白质晶体 相互验证：在某一种鉴定方法下表现为均相互验证：在某一种鉴定方法下表现为均一的蛋白质在另一种方法可能表现为不均一的蛋白质在另一种方法可能表现为不均一，因此需要一，因此需要互相验证互相验证。色谱纯色谱纯电泳纯电泳纯结晶纯结晶纯纯度实验反面例子：纯度实验反面例子：杂峰杂峰杂带杂带层析层析电泳电泳3.3.蛋白质的特性测定蛋白质的特性测定分子质量及等电点测定分子质量及等电点测定氨基酸组成及顺序分析氨基酸组成及顺序分析结晶及结构分析结晶及结构分

41、析免疫印迹（免疫印迹（western-blottingwestern-blotting）鉴定）鉴定3.13.1蛋白质分子质量及等电点的测定蛋白质分子质量及等电点的测定分子质量分子质量 SDS-PAGESDS-PAGE PAGEPAGE等电点等电点 等电聚焦（等电聚焦（IEFIEF）3.23.2氨基酸组成及序列分析氨基酸组成及序列分析 氨基酸组成氨基酸组成 水解蛋白质为氨基酸水解蛋白质为氨基酸 全自动氨基酸分析仪或高效液相色谱进行测定全自动氨基酸分析仪或高效液相色谱进行测定 序列分析序列分析 质谱法质谱法 推定法：从已知基因序列推断蛋白质氨基酸序列推定法：从已知基因序列推断蛋白质氨基酸序列 化学法化学法 水解法：水解法： Sanger Sanger法、法、EdmanEdman降解法、氨肽酶法降解法、氨肽酶法 肼解法、羧肽酶法肼解法、羧肽酶法3.4 3.4 免疫印迹鉴定免疫印迹鉴定 免疫印迹包括三个步骤免疫印迹包括三个步骤 凝胶电泳凝胶电泳 转膜转膜 抗原抗体显色反应抗原抗体显色反应可编辑