均相时间分辨荧光技术课件.pptx
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1、均相时间分辨荧光技术 张迎春 Y217190001 翁德英 Y217190032闫利英 Y217190031戎微波 背景简介背景简介原理原理应用应用展望展望 目目 录录CONCENTSCONCENTSPART 01简简 介介 均相时间分辨荧光( HTRF ,Homogeneous Time-Resolved Fluorescence )是用来检测纯液相体系中待测物的一种常用方法,主要用于高通量药物筛选,是研究药物靶标的理想平台。HTRF技术使用了镧系元素(铕和铽),从而具有非常长的半衰期 ;同时,镧系元素与络合的穴相结合,这种结合的穴状物与其它所有使用的螯合物的产品相比,显著增加了稳定性(可耐
2、受低pH值、金属离子、 DMSO、EDTA 等) 利用长发射半衰期的稀土镧系元素作为供体荧光团,HTRF技术结合了荧光共振能量转移(FRET,Fluorescence Resonance Energy Transfer)和时间分辨荧光(TRF, Time-Resolved Fluorescence)两种技术。这种结合将TRF 的低背景特点和FRET 的均相实验方式融合在一起,使得 HTRF 技术拥有如下优势:实验方式灵活、可靠,并且具有更高的灵敏度、 稳定,实验结果的假阳性率较低背景简介镧的发现镧于1839年1月,由在斯德哥尔摩的卡罗林斯卡研究所的卡尔古斯塔法莫桑德尔(CarlGustafMo
3、sander)发现。他从在1803已经发现的铈中提取了它。莫桑德尔注意到他的大多数氧化铈样本不可溶,而有些是可溶的,他推断这是一种新元素的氧化物。他从铈中提取出了第二种元素,他称之为didymium(镨钕混合物)。然而他没有意识到didymium也是混合物,在1885年它被分离成了镨和钕。卡尔古斯塔法莫桑德尔(CarlGustafMosander)镧系元素:lanthanide element 镧以及接着发现的铒、铽打开了发现稀土元素的第二道大门,是发现稀土元素的第二阶段。他们的发现是继铈和钇两个元素后又找到稀土元素中的三个。镧以及接着发现的铒、铽打开了发现稀土元素的第二道大门,是发现稀土元素
4、的第二阶段。他们的发现是继铈和钇两个元素后又找到稀土元素中的三个。 镧系元素是5771的15种化学元素的统称。包括镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥,它们都是稀土元素的成员。背景简介镧 Cisbio Bioassays最初在体外诊断方面的成就提供了丰富的免疫化验的经验,通过与Jean-Marie Lehn 教授在稀土荧光特性方面研究合作,造就了如今的HTRF技术。如今,全球各大制药企业、药物研究所和新药筛选中心都将HTRF作为重要的化合物筛选方法进行药物研发。 让-马里莱恩(Jean-Marie Lehn,1939年9月30日出生)是法国化学家。他于1987年与Dona
5、ld Cram和Charles Pedersen因为他的穴状配合物的合成,一起获得了诺贝尔化学奖让-马里莱恩(Jean-Marie Lehn)背景简介穴状配合物 穴状化合物的形成是将一个阳离子纳入到一个立体笼中。笼能收集光然后将能量转移到核心的镧系元素。大环的性质有利于跟镧系元素紧密相连,这种不可破的连接会形成异常稳固的复合体。穴结构能耐受一些特殊的实验条件如大量存在的阳离子( Mg2+和 Mn2+等)、螯合物( EDTA)、溶剂或者温度。 从 HTRF 能应用到临床诊断就能看出它也适用于浓度高的血清在读板前或者孵育时加入氟离子能增强实验对大量化合物的抗干扰性,对实验没有干扰而给实验提供了很大
6、的灵活性。 穴没有光漂白性,多次读数后信号没有损失,因此能按照需要的次数去读,这就给许多动力学检测提供了可能。专利号: US Patent US 5,527,684由于在该结构上的贡献,让-马里莱恩在 1987 年获得了诺贝尔奖。背景简介穴状配合物PART 02HTRFHTRF技术原理技术原理时间分辨荧光荧光共振能量转移HTRF 技术HTRF技术特点HTRF 技术的主要实验方法HTRF技术原理 在生物溶液或血清中的很多化合物和蛋白质是自发荧光的,利用传统的快速荧光基团进行检测极大限制了实验灵敏度。使用长寿命的荧光基团结合时间分辨的检测方式(在荧光激发和发射检测之间有一个时间延迟)可将快速荧光的
7、干扰降到最低。 时间分辨荧光( TRF)利用稀土元素中镧系元素的独特性质。在 TRF 中常用的镧系元素是钐( Sm)、铕( Eu)、 铽( Tb)和镝( Dy)。与传统荧光基团相比,它们具有大的Stokes shifts 和非常长的发射半衰期(从微秒到毫秒),这使它们在生物学荧光应用领域中日益重要。一、时间分辨荧光 通过直接激发使镧系元素离子产生荧光是不容易的,因为这些离子很难吸收光子。镧系元素必须首先与有机分子形成复合物,有机分子收集光子并通过分子内非放射过程转移到镧系元素上。稀土元素螯合物和穴状配合物是能量收集装置的典型代表,它们收集能量并转移到镧系元素离子上,后者则发出其特征性的长寿命的
8、荧光。 为了能够成功应用于生物学检测中,稀土元素复合物应该具有特定的性质,包括稳定性、较高的发射光产率,并且能够与生物分子连接。除此之外,当直接在生物溶液中反应时,能够耐受荧光淬灭就显得尤为重要。稀土元素螯合物稳定性较差,而且有的化合物可竞争螯合物活性基团,当与 FRET 技术结合在一起时其灵敏度也受到限制。如果稀土元素与穴状配合物结合,许多限制因素都可去除。一、时间分辨荧光 荧光共振能量转移利用两种荧光基团的能量转移,这两种荧光基团分别称为能量供体(Donor)和能量受体(Acceptor)。能量供体被外来光源激发(例如氙灯或激光),如果它与能量受体比较接近,可以将能量共振转移到在能量受体上
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