酶促反应进程定时法三课件.ppt

1、临床酶学检验临床酶学检验基本特点基本特点基本方法基本方法1 1、项目多，应用广、项目多，应用广2 2、含量少，难度大、含量少，难度大3 3、高灵敏度、高灵敏度4 4、高特异度、高特异度1、活性测定法、活性测定法2、质量测定法、质量测定法第一节第一节 酶活性测定的理论基础酶活性测定的理论基础一、酶促反应进程一、酶促反应进程二、定时法二、定时法三、连续检测法三、连续检测法 零级零级一级一级PSV dpdt时间时间延滞期延滞期线性期线性期非线性期非线性期酶促反应时间进程曲线酶促反应时间进程曲线（一）延滞期（一）延滞期延滞期延滞期（lag phase）是指反应初开始的一段时间，可以是指反应初开始的一段

2、时间，可以是几秒至几分钟。此时是几秒至几分钟。此时S不断下降，随之有相应不断下降，随之有相应P产生。产生。由于多种因素的影响，该其酶促反应速率比较慢。由于多种因素的影响，该其酶促反应速率比较慢。1 1、单一酶促反应的延滞期：是指酶促反应开始到达最大、单一酶促反应的延滞期：是指酶促反应开始到达最大 反应速率所需要的时间。反应速率所需要的时间。2 2、酶偶联反应的延滞期、酶偶联反应的延滞期（二）线性期（二）线性期 延滞期后，在过量底物存在的条件下，酶促反应延滞期后，在过量底物存在的条件下，酶促反应速率达到最大反应速率并保持相对恒定的一段时期，速率达到最大反应速率并保持相对恒定的一段时期，该期在时间

3、进程曲线中呈直线或接近直线状态，称为该期在时间进程曲线中呈直线或接近直线状态，称为线性期线性期( ( linear phase )。 因底物量足够，在线性期酶促反应速率不受底物因底物量足够，在线性期酶促反应速率不受底物浓度的影响，产物浓度的影响，产物P和底物和底物S变化与时间变化与时间t成直线关成直线关系，因此该期的酶促反应速率能反映酶活性的大小。系，因此该期的酶促反应速率能反映酶活性的大小。（三）非线性期（三）非线性期非线性期又称底物耗尽期，是指线性期后反应速度非线性期又称底物耗尽期，是指线性期后反应速度明显下降，酶促反应进程曲线偏离直线的一段时期。明显下降，酶促反应进程曲线偏离直线的一段时

4、期。根据酶促反应进程曲线中线性期的反应速度才能准根据酶促反应进程曲线中线性期的反应速度才能准确计算出酶活性浓度，因此，不论哪种酶活性浓度确计算出酶活性浓度，因此，不论哪种酶活性浓度测定方法，都应该尽量保证在酶促反应进程的线性测定方法，都应该尽量保证在酶促反应进程的线性期进行检测，否则将导致误差。在延滞期、非线性期进行检测，否则将导致误差。在延滞期、非线性反应期所测得的结果往往不准确。反应期所测得的结果往往不准确。二、定时法二、定时法 (2)(2)连续监测法（动力学法、速率法）连续监测法（动力学法、速率法）（一）定时法的特点（一）定时法的特点缺点：缺点：难以确定选定的反应时间是否处于线性期难以确

5、定选定的反应时间是否处于线性期反应反应1 1反应反应3 3反应反应2 2定时法中可能引起的误差定时法中可能引起的误差在实际工作中，延滞期很难确定，而且一般很短，对酶活在实际工作中，延滞期很难确定，而且一般很短，对酶活性测定产生的影响不大。但非线性期的影响不容忽视，随性测定产生的影响不大。但非线性期的影响不容忽视，随着保温时间的延续，酶变性失活加速，逆反应加强，对活着保温时间的延续，酶变性失活加速，逆反应加强，对活性测定产生的影响非常明显。性测定产生的影响非常明显。（二）酶活性的计算（二）酶活性的计算 根据测定方法的不同，可以利用根据测定方法的不同，可以利用标准比较法标准比较法、标准标准曲线法或

6、吸光系数法曲线法或吸光系数法计算出酶活性浓度单位。计算出酶活性浓度单位。酶活性国际单位定义为每升样品中每分钟生成酶活性国际单位定义为每升样品中每分钟生成1mol1mol为为1U/L1U/L三、连续监测法（动力学法、速率法）三、连续监测法（动力学法、速率法） （一）连续监测法的特点（一）连续监测法的特点缺点：缺点： 连续监测法在特定条件下进行，要求足够的底物浓度连续监测法在特定条件下进行，要求足够的底物浓度和精确控制温度、和精确控制温度、PHPH等反应条件，对仪器要求较高，等反应条件，对仪器要求较高，需要具有恒温装置和连续记录吸光度装置。需要具有恒温装置和连续记录吸光度装置。（二）酶活性的计算（

7、二）酶活性的计算用连续监测法进行酶活性测定时，根据摩尔吸收系数可以用连续监测法进行酶活性测定时，根据摩尔吸收系数可以进行酶活性浓度的计算。进行酶活性浓度的计算。目前实验室常用的计算方式目前实验室常用的计算方式（三）连续监测法的方法类型（三）连续监测法的方法类型根据检测物质是否为待测酶的底物或产物，可将连根据检测物质是否为待测酶的底物或产物，可将连续监测法分为：直接连续监测法和间接连续监测法。续监测法分为：直接连续监测法和间接连续监测法。 +检测方法设计检测方法设计连连续续监监测测法法色素原底物色素原底物NAD(P)H系统系统过氧化物酶系统过氧化物酶系统其它其它ALP、GGT、AMS、AFULDH、HBDH、ALTAST、CK、ADALPS、ADACHE、ACP根据连续监测法偶联体系和检测信号的不同，可以设计多种检测方法根据连续监测法偶联体系和检测信号的不同，可以设计多种检测方法定时法和连续监测法的区别定时法和连续监测法的区别定时法定时法连续监测法连续监测法测总变化量，平均速率测总变化量，平均速率测速率测速率含延滞期或非线性期含延滞期或非线性期只计算线性期速率只计算线性期速率终止酶促反应终止酶促反应酶促反应一直进行酶促反应一直进行多用酶偶联反应多用酶偶联反应多用化学方法检测多用化学方法检测