第十四章 DNA的生物合成(复制)2013-12-1课件.ppt

1、1. 蛋白质蛋白质的结构与功能的结构与功能2. 核酸核酸的结构与功能的结构与功能3. 酶酶6. 糖糖代谢代谢7. 脂类脂类代谢代谢8. 生物氧化生物氧化9. 氨基酸氨基酸代谢代谢10.核苷酸代谢核苷酸代谢11.非营养物质代谢非营养物质代谢授课教师：李晓坤授课教师：李晓坤生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室 公共邮箱：公共邮箱：电话：电话：3831159 ；QQ：1687750297n第十四章第十四章 DNA的生物合成的生物合成n第十五章第十五章 DNA损伤与修复损伤与修复n第十六章第十六章 RNA的生物合成的生物合成n第十七章第十七章 蛋白质的生物合成蛋白质的生物合成n第十八章

2、第十八章 基因表达调控基因表达调控n第二十一章第二十一章 DNA重组及重组重组及重组DNA技术技术蛋白质的是生命活动的执行者蛋白质的是生命活动的执行者ProteinDNA核核 酸酸储存和传递遗传信息储存和传递遗传信息蛋白质蛋白质 构成生物体的基本组分构成生物体的基本组分 执行各种生理功能执行各种生理功能The Central Dogma复复 制制转录转录翻译翻译逆转录逆转录* * DNADNA通过基因表达，决定蛋白质的结构、功能通过基因表达，决定蛋白质的结构、功能 * * DNADNA通过复制，将基因信息代代相传通过复制，将基因信息代代相传 * * RNARNA参与参与DNADNA遗传信息的表

3、达遗传信息的表达 * * RNARNA也可作为某些病毒遗传信息的载体也可作为某些病毒遗传信息的载体本本 篇篇 主主 要要 内内 容容replication(control of gene expression)(genetic recombination and engineering)DNA的生物合成的生物合成 (复制复制)DNA Biosynthesis (Replication) 第第 十四十四 章章第一节：第一节：DNA复制的基本特征复制的基本特征第二节：第二节： DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化第三节：第三节： 原核生物原核生物DNA复制过程复制过程第四节：真核生物

4、第四节：真核生物DNA生物合成过程生物合成过程第五节：第五节： 逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式本章内容本章内容 复制复制 (replication) 的概念：的概念：是指遗传物质的传代，以母链是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链为模板合成子链DNA的过程。的过程。复复 制制亲代亲代 DNA子代子代 DNA复制的基本特征：复制的基本特征：(semi-conservative replication)(high fidelity) (bidirectional replication) (semi-discontinuous replication) 亲代亲代 DNA子代子代

5、DNAA AG GA AA AC CT TT TT TC CT TT TG GA AA A？T TC CT TT TG GA AA AA AG GA AA AC CT TT TT TC CT TT TG GA AA AA AG GA AA AC CT TT T一、半保留复制一、半保留复制A T C G C T A T C GA T C G C T A T C G3 3 5 5 回顾回顾DNA结构：结构：5 5 3 3 T A G C G A T A G CT A G C G A T A G CDNA晶体衍射图片“照片51号”设想：设想：WatsonWatson和和CrickCrick在提出在提

6、出DNADNA双螺旋结构模型时推测，双螺旋结构模型时推测， DNADNA在复制时首先两条链在复制时首先两条链间的氢键断裂两条链分开，间的氢键断裂两条链分开，然后以每一条链分别做模板然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的各自合成一条新的DNADNA链。链。这样新合成的子代这样新合成的子代DNADNA分分子中一条链来自亲代子中一条链来自亲代DNADNA，另，另一条链是新合成的，这种复一条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制制方式为半保留复制。 子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式半保留式半保留式混合式混合式 全保留式全保留式密度梯度实验：密度梯度实验： 含重氮含

7、重氮N15-DNA的细菌的细菌继续培养于普继续培养于普通通N14 培养液培养液梯梯度度离离心心结结果果 子二代子二代 子一代子一代培养于普通培养于普通N14 培养液培养液N15,N14-DNAN15,N14-DNAN14,N14-DNA20min20min半保留复制概念：半保留复制概念： DNA生物合成时，母链生物合成时，母链DNA解开为两股解开为两股单链，各自作为模板单链，各自作为模板 (template)，按碱基配对，按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完

8、全从新合成。两个子细胞的股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都都和亲代和亲代 DNA 碱基序列一致。这种复制方式称碱基序列一致。这种复制方式称为为半保留复制。半保留复制。亲代亲代 DNA一股单链从亲代完整地接受过来一股单链从亲代完整地接受过来另一股单链则完全从新合成另一股单链则完全从新合成两个子代两个子代 DNA 和亲代和亲代 DNA 碱基序列一碱基序列一致致子代子代 DNA复复 制制遗传的保守性，是物种遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但稳定性的分子基础，但不是不是绝对的绝对的！半保留复制的意义：半保留复制的意义：按半保留复制方式，子按半保留复制方式，子代代DNA 与亲代与亲代 DN

9、A 的的碱基碱基序列一致序列一致，即子代保留了亲，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了代的全部遗传信息，体现了遗传的遗传的保守性保守性。专家谈确定曹操专家谈确定曹操DNA经过：曾花经过：曾花3月月时间研究古牙（图）时间研究古牙（图） 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但但不是绝对的不是绝对的！二、复制的方向性二、复制的方向性双向复制双向复制 原核或真核生物的原核或真核生物的基因组基因组复制时，复制时，DNA从从起始点起始点 (origin) 开始，同时向两个方向解链，形成两开始，同时向两个方向解链，形成两个延伸个延伸方向相反方向相反的的复制叉复制叉，

10、称为，称为双向双向复制复制 ( bidirectional replication)。3 3 模板链的方向：模板链的方向：5 5 新链合成方向：新链合成方向：5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 复制时复制时 DNA 双链解开分成二股单链，双链解开分成二股单链，新链沿着张开的二股单链生成，复制中形新链沿着张开的二股单链生成，复制中形成的这种成的这种 Y 字形的结构就称为字形的结构就称为复制叉复制叉。复制叉复制叉(replication fork)：3 5 5 3 新新链链3 5 3 5 亲代亲代DNADNA解链方向解链方向复制起始点（复制起始点（origin）复制时复制时 DNA 双

11、链解开分成二股单链双链解开分成二股单链。复制泡：复制泡：oriori复制示意图复制示意图ori原核生物：原核生物：单点双向复制单点双向复制放射自显影图象放射自显影图象“ ”形形38真核生物：真核生物：多点双向复制多点双向复制53oriorioriori535533复制子复制子是独立完成复制的功能单位。是独立完成复制的功能单位。 从一个从一个DNA复制起始点开始的复制起始点开始的DNA复制复制区。区。习惯上将两个相邻习惯上将两个相邻起始点起始点之间的距离定之间的距离定为一个为一个复制子复制子。复制子复制子(replicon)：真核生物真核生物每个染色体有多个起始点，是每个染色体有多个起始点，是多

12、复制子多复制子的复制。的复制。原核生物原核生物只有一个复制子，称为只有一个复制子，称为复制体复制体。oriori复制示意图复制示意图ori原核生物：原核生物：单点双向复制单点双向复制放射自显影图象放射自显影图象“ ”形形A. 环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter)oriterA B C原核生物：原核生物：真核生物：真核生物：多点双向复制多点双向复制概念：概念：指指 DNA 复制时，复制时，一条链连续一条链连续合成，另一条链合成，另一条链不连续分段不连续分段合成合成，最后连接成

13、完整子链的合成方式。最后连接成完整子链的合成方式。三、复制的半不连续性三、复制的半不连续性解链方向解链方向3 35 53 35 53 35 5前导链前导链(leading strand)： 顺着解链方向生成的顺着解链方向生成的子链，其复制是连续进行子链，其复制是连续进行的，得到一条连续的子链，的，得到一条连续的子链，这股链称为这股链称为前导链前导链，又称，又称领头链领头链。后随链后随链 (lagging strand)： 复制方向与解链方向相反，复制方向与解链方向相反，不能顺着解链方向不能顺着解链方向连续延长，连续延长，须等待解开足够长度的模板链后才能继须等待解开足够长度的模板链后才能继续复制

14、，即续复制，即不连续复制，不连续复制，得到一条由得到一条由 不连续片段不连续片段 组组成的子链，又称成的子链，又称随从链随从链。复制中的不连续片段复制中的不连续片段 称为称为冈崎片段冈崎片段 (Okazaki fragment ) 3 5 3 5 解链方向解链方向3 5 领头链领头链(leading strand)领头链连续复制领头链连续复制而而随从链不连续复制随从链不连续复制，这就是复制的这就是复制的半不连续性半不连续性。3 5 随从链随从链(lagging strand)3 5 DNA复制的特点：复制的特点： (semi-conservative replication) (bidirec

15、tional replication) (semi-discontinuous replication) 第二节第二节 DNA 复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化The Enzymology of DNA Replication参与参与DNA复制的物质：复制的物质： 引物引物 模板模板 ( DNA母链母链 ) 底物底物 ( dNTP ) 复制相关酶复制相关酶DNA聚合酶聚合酶解旋解链酶类解旋解链酶类引物酶引物酶和引发体和引发体DNA连接酶连接酶（A = T、GC）模模 板：板：四种脱氧单核苷酸四种脱氧单核苷酸: dNTP底底 物：物：碱基碱基复制的化学反应：复制的化学反应：聚合反应聚

16、合反应(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi NOONNNNH2CH2OPOOOHNOCH2ONNH2OP OOHOHNNHNNNH2OOHOCH2OP OOH355353dCMPdAMPdGMP5 端端3 端端dNTP dNMP + PPi3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键本质：本质：作用：作用： 引引 物：物：聚合反应的特点：聚合反应的特点：DNA 新链生成需新链生成需引物引物和和模板模板；新链的延长只可沿新链的延长只可沿 5 3 方向进行方向进行 。以以 为主，包括其为主，包括其他酶和蛋白质因子。他酶和蛋白质因子。复制的相关酶：复制的相关酶：全称：全称：依赖依赖DNA的的

17、DNA聚合酶聚合酶 ( DNA-dependent DNA polymerase)简写：简写：DNA-polDNA-pol 催化的反应：催化的反应： 5 3 的聚合活性的聚合活性 核酸外切酶活性核酸外切酶活性3 5 5 3 ppiA T G C A A T T G C | | | |T A C G355dTTP(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + ppi TDNA-pol 5 3 的聚合活性：的聚合活性：DNA-pol 催化聚合反应的特点：催化聚合反应的特点：1. 聚合反应具有方向性：聚合反应具有方向性： 5 3 2. DNA 聚合酶聚合酶不能催化两个游离的脱氧核苷酸不能催化两

18、个游离的脱氧核苷酸聚合聚合，只能在一段寡核苷酸的，只能在一段寡核苷酸的 3 - OH 端端逐个逐个添加脱氧核苷酸，使核苷酸链不断延长。添加脱氧核苷酸，使核苷酸链不断延长。35 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 ?能切除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解能辨认错配的碱基对，并将其水解(即时校读即时校读)。DNA-pol 的核酸外切酶活性：的核酸外切酶活性：3 5 外切酶活性：外切酶活性： 5 3 外切酶活性：外切酶活性：（一）（一）

19、原核生物的原核生物的 DNA 聚合酶：聚合酶：对复制中的错误对复制中的错误校读校读，对复制和，对复制和 修复中出现的修复中出现的空隙进行填补空隙进行填补。有。有5 和和 5 外切酶活性。外切酶活性。在缺乏在缺乏DNA-pol、 时起时起作用，作用，有有 5 外切酶活性。外切酶活性。复制中主要的酶复制中主要的酶，有，有 5 外切外切酶活性。酶活性。10 种亚基构成的不对称异源二聚体。种亚基构成的不对称异源二聚体。可能可能不可能不可能可能可能基因突变后的致死性基因突变后的致死性无无无无有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子数分子数/细胞细胞多亚基不对称多亚基不对称二聚体二聚体？单

20、肽链单肽链组成组成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I可能可能不可能不可能可能可能基因突变后的致死性基因突变后的致死性无无无无有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子数分子数/细胞细胞多亚基不对称多亚基不对称二聚体二聚体？单肽链单肽链组成组成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I 其二级结构以其二级结构以-螺旋为主，螺旋为主， 分分18 个螺旋区段。螺旋之个螺旋区段。螺旋之 间以无规卷曲相连，间以无规卷曲相连，H 和和 I 间无规结构最长间无规结构最长(50

21、个氨基个氨基 酸残基酸残基); 具有聚合作用，但只能延长具有聚合作用，但只能延长 20个核苷酸左右，故个核苷酸左右，故并非真并非真 正的复制酶正的复制酶！功能：功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。出现的空隙进行填补。Arthur Kornberg 1918-2007323 个氨基酸个氨基酸5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性604 个氨基酸个氨基酸DNA 聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶l Klenow 片段片段是实验室合成是实验室合成 DNA，进行，进行分子生物学研究中常用

22、的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。 小片段小片段大片段大片段/Klenow 片段片段 u DNA-pol II 基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。u 具体作用具体作用尚不十分清楚。尚不十分清楚。u 参与参与DNA损伤的应急状态修复，控制复制的损伤的应急状态修复，控制复制的 保真性。保真性。功能：功能：是原核生物复制延长中是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶真正起催化作用的酶! ! 由至少由至少10 种亚基组成的不对种亚基组成的不对 称二聚体，一侧合成领头链，称二聚体，一侧合成领头链， 另一侧合成随从链。另一侧合成随从链。 、 、 、 亚基组成核心酶，亚基组成核

23、心酶， 具有聚合及具有聚合及3 -5 外切酶活性；外切酶活性； 2 个个亚基亚基夹住模板链并使酶夹住模板链并使酶 沿之滑动；沿之滑动； 其余亚基统称其余亚基统称。亚基亚基分子量分子量(kDa) 功功 能能 129.95 - 3 聚合聚合 27.53 - 5 外切外切, 碱基选择碱基选择, 校正校正 8.6加强加强活性活性, 维系二聚体维系二聚体 40.6钳于钳于DNA上并沿模板滑动的环状蛋白质上并沿模板滑动的环状蛋白质 71.1核心酶二聚化，核心酶二聚化，ATPase 38.7结合到结合到 47.5结合结合 ATP 36.9 15.2 16.6结合结合 SSB核心酶核心酶复合物复合物（装卡器）

24、（装卡器）原核生物原核生物 DNA-pol 的组成的组成起始引发，有起始引发，有引物酶活性引物酶活性。延长子链的主要酶延长子链的主要酶，有，有解螺旋酶解螺旋酶活性。活性。在在没有其他没有其他 DNA-pol 时时才发挥催化作用，才发挥催化作用，参与低保真度的复制。参与低保真度的复制。在复制过程中起在复制过程中起校读、修复和填补缺口校读、修复和填补缺口作用。作用。在在线粒体线粒体DNA复制复制中起催化作用。中起催化作用。DNA-pol ：DNA-pol ：DNA-pol ：DNA-pol ：DNA-pol ：DNA-pol分分 布布胞核胞核胞核胞核线粒体线粒体胞核胞核胞核胞核分分 子子 量（量（

25、kD）16.54.014.012.525.5聚合酶活性聚合酶活性 5 - 3 中中？高高高高高高外切酶活性外切酶活性 3 - 5 外切酶活性外切酶活性 5 - 3 功能功能起始引起始引发发, 引引物酶活物酶活性性低保真低保真度复制度复制,似原核似原核pol 线粒体线粒体DNA复复制制延长子延长子链，具链，具解旋酶解旋酶活性，活性，似原核似原核pol 切除修切除修复，填复，填补缺口补缺口，重组，重组似原核似原核pol DNA 复制的保真性至少要依赖三种机制：复制的保真性至少要依赖三种机制： 二、复制保真性的酶学依据二、复制保真性的酶学依据遵守遵守严格的碱基配对规律严格的碱基配对规律；复制延长时复

26、制延长时对碱基的严格选择功能对碱基的严格选择功能；复制出错时复制出错时 DNA-pol 的的核酸外切酶活性核酸外切酶活性和和即时校读即时校读功能。功能。复制的保真性依赖严格的碱基选择：复制的保真性依赖严格的碱基选择：l DNA-pol 通过对不同碱基构型的亲和力不同而通过对不同碱基构型的亲和力不同而 实现碱基选择作用。实现碱基选择作用。l 嘌呤能形成顺式和反式的化学构型，形成氢键嘌呤能形成顺式和反式的化学构型，形成氢键 时嘌呤应处于反式构型；时嘌呤应处于反式构型；l DNA-pol 靠其大分子结构协调非共价键靠其大分子结构协调非共价键(氢键氢键) 与共价键与共价键(磷酸二酯键磷酸二酯键)的有序

27、形成；的有序形成；A：DNA-pol 的外切酶活性切的外切酶活性切 除错配碱基；并用其聚合活除错配碱基；并用其聚合活 性掺入正确配对的底物。性掺入正确配对的底物。DNA-pol 的核酸外切酶活性和即时校读：的核酸外切酶活性和即时校读：B：碱基配对正确时，：碱基配对正确时， DNA-pol 不表现外切酶活性。不表现外切酶活性。三、复制中的分子解链及三、复制中的分子解链及 DNA 分子拓扑学变化分子拓扑学变化解链、解旋酶类解链、解旋酶类DNA 分子的碱基埋在双螺分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把旋内部，只有把 DNA 解成单链，解成单链，它才能发挥模板作用。它才能发挥模板作用。原核生物复制起始的相关

28、蛋白质原核生物复制起始的相关蛋白质蛋白质蛋白质 ( 基因基因 )通通 用用 名名功功 能能 DnaA (dnaA) 辨认复制起始点辨认复制起始点 DnaB (dnaB)解螺旋酶解螺旋酶解开解开DNA双链双链 DnaC (dnaC) 运送和协同运送和协同DnaB DnaG (dnaG)引物酶引物酶催化催化RNA引物生成引物生成 SSB单链单链DNA结合蛋白结合蛋白 稳定已解开的单链稳定已解开的单链拓扑异构酶拓扑异构酶(gyrA,B) 理顺理顺DNA链链 又称又称 DnaB 蛋白蛋白/ /复制蛋白复制蛋白/ /rep 蛋白蛋白解链方向解链方向（一）解螺旋酶（一）解螺旋酶 ( helicase )D

29、naCDna B利用利用 ATP 供能，作用于氢供能，作用于氢键，使键，使 DNA 双链解开成为两条双链解开成为两条单链。单链。 又称又称 螺旋反稳定蛋白螺旋反稳定蛋白（二）单链结合蛋白（二）单链结合蛋白 ( single stranded binding protein，SSB )在复制中维持模板处于单链状态并保护在复制中维持模板处于单链状态并保护模板单链的完整性。模板单链的完整性。解链方向解链方向DnaCDna BSSB单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白(SSB)/(SSB)/螺旋反稳定蛋白螺旋反稳定蛋白解螺旋酶解螺旋酶/DnaB/DnaB蛋白蛋白/rep/rep蛋白蛋白/ /复制蛋白复

30、制蛋白10 局部解链后局部解链后解链过程中，解链过程中，DNA 分子会过度拧紧，产生打分子会过度拧紧，产生打结、缠绕、连环等现象，必须改变结、缠绕、连环等现象，必须改变 DNA 分子的构分子的构象，理顺象，理顺 DNA 链，复制才能顺利进行。链，复制才能顺利进行。8（三）（三）DNA 拓扑异构酶拓扑异构酶 ( DNA topoisomerase ) 拓扑酶拓扑酶 “拓扑拓扑” 指物体或图像作弹性移位而指物体或图像作弹性移位而 保持其原有的性质。保持其原有的性质。u 作用特点：作用特点：u 分分 类：类：既能水解、又能连接磷酸二酯键既能水解、又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异

31、构酶（促旋酶）（促旋酶）（三）（三）DNA 拓扑异构酶拓扑异构酶 ( DNA topoisomerase ) 拓扑酶拓扑酶 u 拓朴酶的作用机制：拓朴酶的作用机制：切断切断 DNA 双链中双链中一股链一股链，使，使 DNA 解链、旋转不致打结；解链、旋转不致打结；适当时候封闭切口，适当时候封闭切口，DNA变为松弛变为松弛状态。反应状态。反应不需不需 ATP。拓朴异构酶拓朴异构酶无无ATP时：切断时：切断 DNA 分子分子两股两股链，链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。断端通过切口旋转使超螺旋松弛。有有ATP 时：使带断端的时：使带断端的DNA分子旋分子旋紧进入负超螺旋状态，再连接断端。紧进入负超

32、螺旋状态，再连接断端。拓朴异构酶拓朴异构酶（四）引物酶（四）引物酶 ( primase ) 即即 DnaG 蛋白蛋白 / 依赖依赖 DNA 的的 RNA 聚合酶聚合酶复制起始时催化生成复制起始时催化生成 RNA 引物的酶。引物的酶。在模板的复制起始部位催化在模板的复制起始部位催化 NTP 的聚合的聚合, 形成形成短片段的短片段的 RNA 。这一小段这一小段 RNA 作为复制的作为复制的引物引物 ( primer )，提提供供 3 -OH 末端末端，使，使 DNA-pol 能够催化能够催化 dNTP 聚合。聚合。* *引物酶引物酶(primase)与与RNA-pol异同异同依赖依赖DNA的的RN

33、A聚聚合酶合酶 E.coli引物酶引物酶RNA-pol 相同点相同点均可催化游离均可催化游离NTP聚合聚合均受到利福平（霉素）抑制均受到利福平（霉素）抑制不不同同点点编码基因编码基因 dnaGrpoBC、rpoA对利福平对利福平敏感性敏感性 低低 高高引物酶与其他和复制有关的蛋白质形成的复合物。引物酶与其他和复制有关的蛋白质形成的复合物。引发体引发体 ( primosome )：连接连接 DNA 链链 3 -OH 末端和相邻末端和相邻 DNA 链链 5 -P 末末端，使二者生成端，使二者生成 磷酸二酯键磷酸二酯键，从而把两段相邻的，从而把两段相邻的 DNA 链连接成一条完整的单链。反应需要链连

34、接成一条完整的单链。反应需要消耗消耗 ATP 。ATPOH POH PDNA 连接酶连接酶 ( DNA ligase )只能连接碱基互补双链中只能连接碱基互补双链中的单链缺口的单链缺口，不能连接单独存在的，不能连接单独存在的DNA单链。单链。5335POO-O-O5335HOPOO-O-OATPADPDNA连接酶连接酶DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。作用。在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。参参与与DNADNA复复制制的的酶酶与与蛋蛋白白因因子子总总

35、览览图图思 考: 提供核糖提供核糖 3 -OH提供提供5 -P结果结果拓朴异构酶拓朴异构酶 切断、整理后的两链切断、整理后的两链 改变拓扑状态改变拓扑状态DNA 聚合酶聚合酶引物或延长中引物或延长中的新链的新链游离游离 dNTP去去 PPi(dNMP)n+1DNA 连接酶连接酶复制中不连续的两条单链复制中不连续的两条单链不连续不连续连续链连续链DNA 拓扑异构酶拓扑异构酶DNA 聚合酶聚合酶DNA 连接酶连接酶本次课重点本次课重点1.掌握概念：掌握概念：半保留复制、半不连续复制、半保留复制、半不连续复制、 冈崎片段、冈崎片段、前导前导连、连、后随链、后随链、 复制子（叉）复制子（叉）2.掌握复

36、制的基本掌握复制的基本特征特征3.掌握真核与原核掌握真核与原核DNA聚合酶的分类和功能聚合酶的分类和功能参与参与DNA复制的物质：复制的物质： 引物引物 模板模板 ( DNA双链双链 ) 底物底物 ( dNTP ) 复制相关酶复制相关酶你还记得吗？复制的相关酶：复制的相关酶：你还记得吗？拓朴异构酶拓朴异构酶解螺旋酶解螺旋酶SSB 第第 三三 节节 DNA 的生物合成过程的生物合成过程 The Process of DNA ReplicationDNA 的生物合成：的生物合成：DNA 解开成单链，提供模板解开成单链，提供模板合成引物，提供合成引物，提供 3 -OH 末端末端RNA 酶水解引物酶水

37、解引物DNA-pol 催化填补空隙催化填补空隙DNA 连接酶连接相邻片段连接酶连接相邻片段磷酸二酯键的不断生成磷酸二酯键的不断生成需要解决两个问题：需要解决两个问题：1. DNA 解开成单链，提供模板；解开成单链，提供模板；2. 合成引物，提供合成引物，提供 3 -OH 末端。末端。一、原核生物的一、原核生物的 DNA 生物合成生物合成 ( E.coli ) （一）原核生物（一）原核生物 DNA复制的起始：复制的起始：识别区识别区富含富含 AT 区区DNA 模板链模板链oriC ( 245 bp )蛋白质因子蛋白质因子1. DNA解链，提供模板解链，提供模板参与的物质：参与的物质：3 组串联重

38、复序列组串联重复序列2 对反向重复序列对反向重复序列DnaA、B、C 及及 SSBE.Coli 复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 441 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 1. DNA解链，提供模板：解链，提供模板：原核生物原核生物D

39、NA解链过程：解链过程：Dna A 四聚体结合重复序列四聚体结合重复序列Dna C 协助协助Dna B 结合结合 oriC ( 解螺旋解螺旋)DNA 链弯曲，链弯曲，AT 区局部解链区局部解链Dna A 离开，形成复制叉离开，形成复制叉问题：问题：无无 3 -OH 末端末端 ？SSB3 5 3 5 引物引物是由是由引物酶引物酶催化合成的催化合成的短链短链 RNA 分子分子。 引物引物3 HO5引物引物酶酶2. 引物和引发体：引物和引发体：3 5 3 5 Dna ADNA 拓扑异构酶拓扑异构酶Dna B Dna C引物引物酶酶SSB含有含有解螺旋酶解螺旋酶、DnaC 蛋白蛋白、引物酶引物酶和和

40、DNA 复制起始区域的复合结构称为复制起始区域的复合结构称为引发体引发体。 引发体：引发体：原核生物的复制起始：原核生物的复制起始：原核生物复制起始的相关酶和蛋白质原核生物复制起始的相关酶和蛋白质蛋白质蛋白质 ( 基因基因 ) 通通 用用 名名 功功 能能 DnaA (dnaA) 辨认起始点辨认起始点 DnaB (dnaB)解螺旋酶解螺旋酶解开解开 DNA 双链双链 DnaC (dnaC) 运送和协同运送和协同 DnaB DnaG (dnaG)引物酶引物酶催化催化 RNA 引物生成引物生成 SSB单链单链 DNA 结合蛋白结合蛋白 稳定已解开的单链稳定已解开的单链拓扑异构酶拓扑异构酶(gyrA

41、,B) 理顺理顺 DNA 链链复制的延长指在复制的延长指在DNA-pol 催化下，催化下，dNTP 以以 dNMP 的方式逐个加入引物或延长的方式逐个加入引物或延长中的子链中的子链 3 末端上，使其不断延长。末端上，使其不断延长。其其化学本质化学本质是是磷酸二酯键的不断生成磷酸二酯键的不断生成。 （二）原核生物（二）原核生物 DNA 复制的延长复制的延长DNA-pol 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 3 33 3原核生物原核生物 DNA 复制的延长：复制的延长：3 5 3 5 解链方向解链方向3 5 领头链领头链(leading str

42、and)3 5 随从链随从链(lagging strand)3 5 领头链的合成领头链的合成随从链的合成随从链的合成原核生物基因是环状原核生物基因是环状 DNA，双向复制的复，双向复制的复制片段在复制的终止点制片段在复制的终止点 ( ter ) 处汇合。处汇合。 E.coliori82ter32（三）原核生物（三）原核生物 DNA 复制的终止复制的终止需要解决的问题：需要解决的问题：RNA 酶酶DNA 连接酶连接酶DNA-pol催化催化SV40 ter50 ori0RNA酶酶 ( 水解引物水解引物 )5 OHP5 DNA-pol ( 填补空隙填补空隙 )dNTP5 5 P5 5 ATP ADP

43、+PiDNA连接酶连接酶 ( 连接片断连接片断 )原核生物原核生物 DNA 复制的终止：复制的终止：5 5 空隙（空隙（gap）缺口（缺口（nick）RNA酶酶复复制制的的终终止止S期：期：DNA合成期合成期G2期：期：DNA合成后期合成后期G1期：期：DNA合成前期合成前期M期：有丝分裂期期：有丝分裂期二、真核生物的二、真核生物的 DNA 生物合成生物合成哺乳动物的哺乳动物的细胞周期细胞周期DNA 合成期合成期G2G1MS（一）真核生物（一）真核生物 DNA 复制的起始：复制的起始： 真核生物复制起始的基本过程类似原核真核生物复制起始的基本过程类似原核生物，亦需生物，亦需打开复制叉、形成引发

44、体和合成打开复制叉、形成引发体和合成RNA 引物。引物。真核生物每个染色体有真核生物每个染色体有多个起始点多个起始点，且较原核，且较原核为短，是为短，是多复制子复制多复制子复制。复制具。复制具有时序性有时序性，即，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。复制子以分组方式激活而不是同步起动。 复制的起始复制的起始需要需要 DNA-pol( 引物酶活性引物酶活性 ) 和和DNA-pol( 解螺旋酶活性解螺旋酶活性 ) 参与。此外还需参与。此外还需拓拓扑酶和复制因子扑酶和复制因子 ( replication factor，RF ) 参与。参与。 增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原 ( proliferati

45、on cell nuclear antigen，PCNA ) 作为作为 DNA - pol 的辅助因子的辅助因子使使DNA - pol 获得持续合成的能力获得持续合成的能力。（二）真核生物（二）真核生物 DNA 复制的延长：复制的延长：原核生物原核生物真核生物真核生物引物引物数十个数十个nt十数个十数个nt冈崎片段冈崎片段1 kbp 2 kbp100 bp 200 bp由由 DNA - pol 催化引物催化引物合成。合成。在在 PCNA 协同下，由协同下，由 DNA - pol 催化领头催化领头链和随从链的合成链和随从链的合成。引物和冈崎片段引物和冈崎片段比原核生物的比原核生物的短短。（三）真

46、核生物（三）真核生物 DNA 复制的终止：复制的终止： 包括包括水解引物、填补空隙、连接缺口水解引物、填补空隙、连接缺口等基本过程。等基本过程。 真核生物的引物含有真核生物的引物含有 RNA 和和 DNA 两两种成分种成分，其水解除了需要核内的，其水解除了需要核内的 RNA 酶酶外，外，还需要还需要核酸外切酶核酸外切酶。真真 核核 生生 物物 DNA 复复 制制 过过 程程 总总 图图 真核生物真核生物 DNA的复制的复制与核小体的装配与核小体的装配同步进行。同步进行。 真核生物的染色体由真核生物的染色体由 DNA和蛋白质构成。和蛋白质构成。染染色色体体核小体核小体核心颗粒：核心颗粒： (H2

47、A H2B H3 H4) DNA：约约 200 bp （缠绕（缠绕1又又4/5圈）圈）染色体染色体串珠样结构串珠样结构H1 DNA真核生物真核生物 DNA 复制的终止：复制的终止：染色体染色体 DNA 呈线状，复制在呈线状，复制在末端末端停止。停止。复制中冈崎片段的连接，复制中冈崎片段的连接，复制子之间复制子之间的连接。的连接。染色体两端染色体两端 DNA 子链上最后复制的子链上最后复制的 RNA 引物引物，去除后去除后留下空隙留下空隙。5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 3 3 5 5 5 3 3 5 3 3 5 5 水解、填补、连接水解、填补、连接真核生物真核生物 DNA 复制

48、的终止：复制的终止：DNA 是线性结构，是线性结构，复制在复制在末端末端停止停止。末端复制需末端复制需端粒酶端粒酶的参与。的参与。 端端 粒粒 酶酶 ？ 端端 粒粒 ？（四）（四） 端粒和端粒酶端粒和端粒酶指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性 DNA 分子末端的结构。分子末端的结构。端粒端粒 ( telomere )：从希腊字的末端从希腊字的末端 (telos) 和和部分部分 (meros) 创造了一个创造了一个全新的单词全新的单词 telomere ! 端粒的发现：端粒的发现：TTTTGGGGTTTTGGGG结构特点：结构特点：1. 由末端单链由末端单链 DNA 序列和蛋白质构成；序列和

49、蛋白质构成；2. 末端末端 DNA 序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含 G、T 碱基的短序列。碱基的短序列。功功 能：能：维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性维持维持DNA复制的完整性复制的完整性端粒端粒 ( telomere )：端粒长短与细胞生命历程密切相关：细胞分裂细胞分裂细胞分裂细胞分裂Hayflick 点点染色体染色体端粒端粒端粒端粒年龄增长年龄增长组成：组成：人端粒酶人端粒酶 RNA (human telomerase RNA, hTR)人端粒酶协同蛋白人端粒酶协同蛋白 (human telomerase associated protein 1, hTP1)人端粒酶逆转录酶

50、人端粒酶逆转录酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTRT)端粒酶端粒酶 ( telomerase )：结合位置：结合位置：母链单链母链单链 DNA 3 - OH 末端末端端粒端粒端粒酶端粒酶5 1. 复制终止时，染色体线性复制终止时，染色体线性DNA末端有可能末端有可能 缩短，但通过端粒酶的作用，可以缩短，但通过端粒酶的作用，可以补偿这补偿这 种由除去引物引起的末端缩短。种由除去引物引起的末端缩短。2. 端粒酶活性下降，端粒长度会变短或消失，端粒酶活性下降，端粒长度会变短或消失， 染色体稳定性下降，细胞衰老；反之，端染色体稳定性下降，细胞衰老