生化分析仪原理-比色法(朗伯-比尔定律课件.ppt
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1、美康生物技术支持部 广西 黄崇庭A=lg(I0/It)=bc1、前言ALT AST TBIL DBIL TP ALB ALP GGTCR UA BUN.TC TG HDL LDLCK CKMB HBDH LDH.ASO RF CRP CCP.生化分析仪:一个可以靠“灯泡”就能检测出人体血清、血浆中的各种成分的仪器?Why? Why? Why? 2、光分析基础知识2.12.1 光分析法的概念及分类光分析法的概念及分类光分析法:光分析法:基于电磁辐射能量与待测物质相互作用后所产生的辐射信号与物质组成及基于电磁辐射能量与待测物质相互作用后所产生的辐射信号与物质组成及结构关系所建立起来的分析方法;结构
2、关系所建立起来的分析方法;相互作用方式相互作用方式:发射、吸收、反射、折射、散射、干涉、衍射等:发射、吸收、反射、折射、散射、干涉、衍射等根据是否有能级跃迁根据是否有能级跃迁,可以分为,可以分为光分析法光谱分析法:发射、吸收(原子吸收、分子吸收)、散射吸收(原子吸收、分子吸收)、散射拉曼光谱法)拉曼光谱法)非光谱吸收:反射、折射、干涉、衍射等2.2 吸收光谱法定义:各种物质由于其结构不同,对电磁波的吸收也不同,每种物质都有其特征性的吸收光谱,据此可对物质进行定量和定性分析的方法。吸收光谱法紫外可见光光度法: 紫外可见分光光度法是利用被测物质对紫外可见光区辐射的吸收特征和吸收强度,对物质的组成进
3、行定性和定量分析的一种分析方法,属于分子吸收光谱法。原子吸收光谱法特点: 1.灵敏度较高 2.精密度和准确度较高 3.选择性较强 4.仪器设备较简单,操作易掌握。 5.应用范围广2.3 紫外可见光光度法基本理论光的基本性质:光的基本性质:光的基本性质光是一种电磁波,又表现为光子束流。光的波粒二象性: E=hv=hc/ E-光子能量;h-普朗克常数;c-光速;-波长 由上式公式可知,波长越大能量越小,波长越小,能量越大。 吸收光谱:当辐射能通过某些吸光物质时,物质的原子或分子吸收与其能级跃迁相应的能量由基态或低能态跃迁到较高能态,这种由物质对光辐射的选择性吸收而得到的原子或分子光谱称为吸收光谱。
4、物质对光是选择性吸收的吸收曲线: 为了精确表明溶液对不同波长光的吸收情况, 可将不同波长的单色光依次通过某一固定浓度的有色溶液, 测量该溶液对各单色光的吸 收程度, 即吸光度, 以波长为横坐标, 吸光度为纵坐标作图所得曲线, 即为 吸收曲线, 或称吸收光谱。物质对光的吸收物质对光的吸收关于物质吸收曲线的几点讨论:关于物质吸收曲线的几点讨论:1、不同物质的最佳吸收波长不一样。2、同一种物质在不同浓度下,吸收程度不一样,但是波长相同。3、根据吸收曲线的特点,可以提供物质的结构信息,是定性分析的依据之一。3、朗伯-比尔定律-吸光光度法定量分析的依据入射光强度透射光强度透光率 0tIT =I两边取负对
5、数我们将透射光与入射光的比值T称为透光率,T 越小,光吸收能力越强,T越大,物质光吸收能力越大。透光率T与吸光度A的定义公式 1为了表示物质吸收光的强度,我们用吸光度A来表示,将公式两边取负对数得A= -lg (T)=lg(1/T)=lg(I0/It) 公式 2是吸光度A的定义式,A值越大,表明物质对光的吸收越大朗伯定律:朗伯定律:当用一种适当波长的单色光照射一固定浓度的溶液时,其吸光度与光透过的液层厚度b成正比,即公式3 A=K1b比尔定律:比尔定律:当用一种适当波长的单色光照射一溶液时,若液层厚度一定,则吸光度与溶液浓度c成正比,即 公式4 A=K2c 公式 2 浓度C恒定时,吸光度A与厚
6、度b成正比溶液厚度b恒定,吸光度A与浓度C的关系成正比根据公式3和公式4可知,吸光度A与溶液浓度厚度、浓度均成正比例关系,即朗伯朗伯-比尔定律比尔定律A=KbcK是比例系数,也可称为吸光系数,与吸光物质的本性、入射光波长、溶剂及温度等因素有关。吸光系数的物理意义是吸光系数的物理意义是: 吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度。在一定条件下(单色光波长、溶剂、温度等),吸光系数是物质的特性常数,同两个能级的跃迁几率有关。不同物质在同一波长的单一色光照射下,具有不同的吸光系数,常作为定性分析的依据。当厚度一定时,吸光度与浓度呈线性关系,吸光系数就是斜率,这是定量分析的依据。吸光系数愈大,灵敏度愈高
7、。吸光系数的影响因素:吸光系数的影响因素:入射波长、温度、吸光物质性质、溶剂等吸光系数的讨论吸光系数常有三种表示方式吸光系数常有三种表示方式: (1)摩尔吸光系数:当溶液浓度以mol/L表示时,液层厚度的单位为cm时,吸光系数表示为摩尔吸光系数:。摩尔吸光系数。的意义是浓度为1 mol/L的溶液,厚度为I cm时的吸光度。:的单位是Lmol-1 cm-1 A=bc(2)吸光系数a:当溶液浓度以g/L表示时,液层厚度的单位为cm时,吸光系数k表示为吸光系数的单位是Lg-1 cm-1 A=abc 摩尔吸光系数与吸光系数a的关系有 =MaM一被测物质的摩尔质量。 (3)百分吸光系数或称比吸光系数到撬
8、:其意义是指浓度为1 % ( W/V)的溶液,厚度为lcm时的吸光度。一般吸光物质的吸光系数大于1X104,具有较高灵敏度,小于1X103 灵敏度较小 朗伯比尔定律的适用条件(1) 入射光为平行单色光且垂直照射.(2) 吸光物质为均匀非散射体系.(3) 吸光质点之间无相互作用(稀溶液).(4)辐射与物质之间的作用仅限于光吸收,无荧光和光化学现象发生.偏离朗伯比尔定律现象该定律在一个均匀的体系中,吸光物质的浓度不变时,吸光度A与液层厚度b之间的线性关系是普遍成立的。但在实际工作中,吸光度A和浓度c之间的线性关系有时会失效,出现偏离朗伯比尔定律的现象,是个有限的定律。引起偏离的因素(1)吸光物质浓
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