药敏试验方法及耐药菌株的检测课件.ppt

1、1药敏试验的方法及耐药菌株检测药敏试验的方法及耐药菌株检测昆明市延安医院检验科昆明市延安医院检验科 黄云昆黄云昆2主要内容主要内容n抗菌药物敏感性试验的目的和方法抗菌药物敏感性试验的目的和方法n纸片扩散法药敏试验的标准化操作程序纸片扩散法药敏试验的标准化操作程序n临床上重要的耐药细菌及检测方法临床上重要的耐药细菌及检测方法3什么是抗菌药物的敏感性试验？什么是抗菌药物的敏感性试验？n测定抗菌药物在体外抑制病原微生物生长的测定抗菌药物在体外抑制病原微生物生长的效力，称抗菌药物对细菌的抑菌试验，或称效力，称抗菌药物对细菌的抑菌试验，或称细菌对药物的敏感性试验。细菌对药物的敏感性试验。4药敏试验的适应

2、征药敏试验的适应征n当某种细菌被认为是感染性疾病病原，需抗当某种细菌被认为是感染性疾病病原，需抗生素治疗而该细菌的药敏谱不能从其种属推生素治疗而该细菌的药敏谱不能从其种属推知时，即须做药敏试验知时，即须做药敏试验n正常菌群或已知目前对基本药物尚未出现耐正常菌群或已知目前对基本药物尚未出现耐药株的细菌不需做药敏试验药株的细菌不需做药敏试验.5药敏试验的目的和意义药敏试验的目的和意义n供临床医师选用抗菌药物时的参考供临床医师选用抗菌药物时的参考n细菌耐药性监测和耐药性变迁细菌耐药性监测和耐药性变迁n评价新抗菌药物的药效学特征评价新抗菌药物的药效学特征n对细菌耐药谱分析和分型有助于某些菌种的对细菌耐

3、药谱分析和分型有助于某些菌种的鉴定鉴定n作为医院内感染流行病学调查的手段之一作为医院内感染流行病学调查的手段之一6药敏试验的方法药敏试验的方法n稀释法稀释法n试管稀释法（肉汤稀释法）试管稀释法（肉汤稀释法）n平板稀释法（琼脂稀释法）平板稀释法（琼脂稀释法）n扩散法（纸片法）扩散法（纸片法）nKirby-Bauer(K-B)法法nStockes法法nE-Test(Epsilometer test) 7药敏试验的方法药敏试验的方法n自动微生物鉴定药敏系统：结果为自动微生物鉴定药敏系统：结果为MIC,ml。n耐药筛选试验和折点敏感试验耐药筛选试验和折点敏感试验 n联合药敏试验联合药敏试验:两种药物的

4、协同两种药物的协同,无关无关,拮抗关拮抗关系系.8稀释法稀释法原理：以一定浓度的抗菌药物与含原理：以一定浓度的抗菌药物与含有被测菌株的培养基进行一系列的有被测菌株的培养基进行一系列的对倍稀释经培养后，肉眼观察细菌对倍稀释经培养后，肉眼观察细菌生长的情况生长的情况最低抑菌浓度（最低抑菌浓度（MIC）：肉眼观察）：肉眼观察能抑制细菌生长的最低一管药物浓能抑制细菌生长的最低一管药物浓度（度（Minimal inhibitory concentration，MIC）琼脂稀释法琼脂稀释法试管稀释法试管稀释法肉汤微量法肉汤微量法9纸片扩散法（纸片扩散法（Kirby-Bauer，K-B法）法） 10E-试验

5、（试验（E-Test）原理：基本同扩散法，即浓度呈连续梯度的抗菌药物从塑原理：基本同扩散法，即浓度呈连续梯度的抗菌药物从塑料纸条中向药敏琼脂中扩散，在试条周围浓度范围内检测料纸条中向药敏琼脂中扩散，在试条周围浓度范围内检测菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。 E-test综合了稀释法和扩散法的原理和特点，直接定综合了稀释法和扩散法的原理和特点，直接定量测出药物对测试菌的最低抑菌浓度（量测出药物对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）。）。 菌液，药敏平板要求同菌液，药敏平板要求同K-B法法 E-Test条宽条宽5mm，长，长60mm 150mm平皿贴平皿贴6条、

6、条、 90mm平皿贴平皿贴1条条11CLSI的简单介绍的简单介绍n NCCLS （The National Committee for clinical laboratory Standards） 美国临床实验室标准委员会美国临床实验室标准委员会 已经被我国卫生部指定为部颁标准已经被我国卫生部指定为部颁标准 每年有新版每年有新版nCLSI （Clinical and Laboratory StandardsInstitute） 美国临床实验室标准化研究所美国临床实验室标准化研究所 2005年年12纸片扩散法药敏试验（纸片扩散法药敏试验（KB法）法）n原理：将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有细菌的琼脂

7、原理：将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，因此敏感平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，因此敏感细菌在纸片周围一定距离内的生长受到抑制，形成细菌在纸片周围一定距离内的生长受到抑制，形成相应的抑菌圈，其大小与该药物的最低抑菌浓度相应的抑菌圈，其大小与该药物的最低抑菌浓度（MIC）呈负关，根据抑菌圈的大小即可推知该药）呈负关，根据抑菌圈的大小即可推知该药物的物的MIC，可将药敏结果判断为敏感、中介和耐药。，可将药敏结果判断为敏感、中介和耐药。13KB法药敏法药敏培养基培养基n肠杆菌科，铜绿假单胞菌、不动杆菌属、嗜麦芽窄肠杆菌科，铜绿假单胞菌、不动杆菌属、嗜麦芽窄

8、食单胞菌、洋葱假单胞菌等非发酵菌食单胞菌、洋葱假单胞菌等非发酵菌nMueller-Hinton （MH）琼脂，）琼脂，pH7.27.4，厚度，厚度4mmn葡萄球菌属、肠球菌属葡萄球菌属、肠球菌属nMueller-Hinton（MH）琼脂）琼脂n肺炎链球菌、肺炎链球菌、溶血链球菌、草绿链球菌、脑膜炎溶血链球菌、草绿链球菌、脑膜炎奈瑟菌奈瑟菌n5%脱纤维羊血脱纤维羊血MH琼脂琼脂14KB法药敏法药敏培养基培养基n嗜血杆菌属嗜血杆菌属nHaemophilus Test Medium（HTM），添加），添加SR158或或1%血红蛋白和血红蛋白和1%X、V因子复合物因子复合物MHn淋病奈瑟球菌淋病奈瑟球

9、菌n1%血红蛋白和血红蛋白和1%X、V因子复合物的因子复合物的GC琼脂琼脂15操作程序操作程序n测试菌准备：所测菌种必须是纯的、测试菌准备：所测菌种必须是纯的、1624小时（对数生长期）培养物，不纯菌种需首小时（对数生长期）培养物，不纯菌种需首先分纯，否则不得进行药敏试验。先分纯，否则不得进行药敏试验。 16操作程序操作程序n菌液浓度制备菌液浓度制备n直接菌悬液法：挑取平皿上直接菌悬液法：挑取平皿上至少至少3个个已分纯菌落于无菌生已分纯菌落于无菌生理盐水中，制备成理盐水中，制备成0.5麦氏单位麦氏单位(McFarland)标准的菌悬标准的菌悬液液（1.5108CFU/ml），用，用0.5麦氏单

10、位标准比浊管或麦氏单位标准比浊管或比浊仪校正，制备好的菌悬液需比浊仪校正，制备好的菌悬液需15分钟内接种完毕分钟内接种完毕n生长法生长法 ：肉汤培养基增菌、校正浓度：肉汤培养基增菌、校正浓度17操作程序操作程序n0.5M标准比浊管的制作：标准比浊管的制作：0.5mL0.048mol/L的的Bacl2（1.175%w/v Bacl2H2O）+99.5mL0.18mol/LH2SO4 (1%v/v),混匀，分混匀，分装，密封，每月更换或核实。确认方法：分装，密封，每月更换或核实。确认方法：分光光度计光光度计d=1cm、=625nm，OD=0.080.10。18操作程序操作程序n接种菌液：接种菌液：

11、n用无菌且没有毒性的棉签蘸取菌液后，将棉签在用无菌且没有毒性的棉签蘸取菌液后，将棉签在管壁上轻轻旋转挤压几次，去掉多余的菌液管壁上轻轻旋转挤压几次，去掉多余的菌液n将蘸有菌液的棉签置于琼脂表面，从平皿最顶端将蘸有菌液的棉签置于琼脂表面，从平皿最顶端开始往外均匀涂布菌液至整个平皿，然后旋转平开始往外均匀涂布菌液至整个平皿，然后旋转平板板600 ，继续从平皿顶端开始涂布，再重复，继续从平皿顶端开始涂布，再重复2次次（共（共3次），最后沿平板边缘涂抹一周。次），最后沿平板边缘涂抹一周。19操作程序操作程序n贴抗菌药物纸片：接种好菌液的平板置室温贴抗菌药物纸片：接种好菌液的平板置室温干燥干燥35分钟，

12、待平板上的水分被琼脂完全分钟，待平板上的水分被琼脂完全吸收，用镊子取纸片一张，贴在琼脂平板表吸收，用镊子取纸片一张，贴在琼脂平板表面，轻压使其贴平，贴好的纸片不可再拿起，面，轻压使其贴平，贴好的纸片不可再拿起，因纸片中的药物已扩散到培养基中。各纸片因纸片中的药物已扩散到培养基中。各纸片中心相距中心相距24 mm，纸片距平板边缘，纸片距平板边缘15 mm。即直径即直径90mm平板每个平板每个5片片 20抗菌药物纸片的贮存抗菌药物纸片的贮存n药敏纸片的贮存药敏纸片的贮存n大量长期贮存大量长期贮存-200C以下以下n常规用量常规用量40C冰箱保存冰箱保存n使用前将贮存容器移至室温平衡使用前将贮存容器

13、移至室温平衡12小时，小时，避免开启贮存容器时产生冷凝水。避免开启贮存容器时产生冷凝水。21抗菌药物的选择：抗菌药物的选择：CLSI分组分组A组组一级试验并常规报告的药物一级试验并常规报告的药物B组组一级试验有选择报告的药物一级试验有选择报告的药物C组组补充试验有选择报告的药物补充试验有选择报告的药物U组组仅用于泌尿道的补充试验的药物仅用于泌尿道的补充试验的药物O组组对该组细菌有临床适应证但一般不允许对该组细菌有临床适应证但一般不允许常规试验与报告的药物常规试验与报告的药物Inv组组对该菌群做研究用且尚未经对该菌群做研究用且尚未经FDA批准的批准的药物药物2223操作程序操作程序n孵育：将贴好

14、纸片的药敏平板放入培养箱内，孵育：将贴好纸片的药敏平板放入培养箱内，平板在孵箱内最好单独摆放，如叠放不得超平板在孵箱内最好单独摆放，如叠放不得超过过2个。个。24操作程序操作程序n孵育孵育条件条件n肠杆菌科：肠杆菌科： 35 2 ，16-18hn铜绿：铜绿： 35 2 ，16-18h，囊性纤维化病人，囊性纤维化病人需延长至需延长至24hn不动杆菌、嗜麦芽、洋葱：不动杆菌、嗜麦芽、洋葱：20-24hn葡萄球菌：葡萄球菌：33-35 （不可（不可 35 )，金葡，金葡16-18h ,SCoN24h，OXA、MET、NAF、VAN、FOX24hn肠球菌：肠球菌： 35 2 ，16-18h，VAN 2

15、4h25操作程序操作程序孵育孵育条件条件n溶血性链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌脑膜炎溶血性链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌脑膜炎奈瑟菌奈瑟菌 35 2 、5%CO2n淋病奈瑟菌淋病奈瑟菌 36 1 （不可（不可37 )、5%CO2 n溶血性链球菌、肺炎链球菌、奈瑟菌属溶血性链球菌、肺炎链球菌、奈瑟菌属20-24小时小时n流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌16-18小时小时26操作程序操作程序n抑菌环直径（抑菌环直径（mm）的测量：）的测量：n将药敏平板倒置，在直射光下测量用精确度为将药敏平板倒置，在直射光下测量用精确度为1 mm的游的游标卡尺测量抑菌环直径。抑菌环的边以肉眼见不到细菌标卡尺测量抑菌环直

16、径。抑菌环的边以肉眼见不到细菌生长为限。生长为限。n对链球菌、嗜血杆菌等因血平皿或特珠营养物质补充平对链球菌、嗜血杆菌等因血平皿或特珠营养物质补充平皿的影响，可将平皿盖移去，在反射光下测量皿的影响，可将平皿盖移去，在反射光下测量n对某些特殊的细菌和抗菌药则需要用透射光，如量取苯对某些特殊的细菌和抗菌药则需要用透射光，如量取苯唑西林或唑西林或Va对葡萄球菌的抑菌圈时，必须要观察抑菌圈对葡萄球菌的抑菌圈时，必须要观察抑菌圈内是否存在任何生长的菌落。内是否存在任何生长的菌落。27应注意溶血性细菌的结果阅读应注意溶血性细菌的结果阅读n链球菌链球菌 -溶血性链球菌溶血性链球菌 草绿色链球菌草绿色链球菌

17、肺炎链球菌等肺炎链球菌等 应忽略溶血圈，读取生长完全被抑制处应忽略溶血圈，读取生长完全被抑制处28应注意产色素细菌的结果阅读应注意产色素细菌的结果阅读n有些细菌会在生长过程中产生色素有些细菌会在生长过程中产生色素 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 黄杆菌黄杆菌 沙雷菌沙雷菌 应忽略色素分泌圈，读取生长完全被抑制处应忽略色素分泌圈，读取生长完全被抑制处29操作程序操作程序n对变形杆菌药敏及磺胺药产生的抑菌环内会对变形杆菌药敏及磺胺药产生的抑菌环内会出现轻微生长，如生长的菌膜厚度出现轻微生长，如生长的菌膜厚度20%可忽可忽略不计略不计 30操作程序操作程序n结果的判断：按结果的判断：按CLSI最新判断标准

18、判断为敏最新判断标准判断为敏感、中介或耐药感、中介或耐药 31临床意义临床意义n敏感（敏感（susceptible,S）：测试菌可被常规剂量、常）：测试菌可被常规剂量、常规给药途径在体内所能达到的血药浓度所抑制或杀规给药途径在体内所能达到的血药浓度所抑制或杀灭。灭。n中介中介(intermediate,I)：测试菌对常规剂量、常规给：测试菌对常规剂量、常规给药途径在体内所能达到的血药浓度敏感性降低，加药途径在体内所能达到的血药浓度敏感性降低，加大剂量、药物浓集部位可能有效；实验因素所致的大剂量、药物浓集部位可能有效；实验因素所致的不可判断。不可判断。n耐药耐药(resistance,R)：细菌

19、对药物的相对抗性。：细菌对药物的相对抗性。32药敏报告中的注意事项药敏报告中的注意事项n分离自脑脊液标本的细菌下列抗菌药分离自脑脊液标本的细菌下列抗菌药不能报告不能报告n口服药口服药n第一代、第二代头孢菌素第一代、第二代头孢菌素(除头孢呋辛除头孢呋辛)n克林霉素克林霉素n大环内酯类大环内酯类n四环类四环类n氟喹诺酮类氟喹诺酮类33药敏报告中的注意事项药敏报告中的注意事项n分离自尿液标本的细菌下列抗菌药分离自尿液标本的细菌下列抗菌药不常规报告不常规报告n阿奇霉素阿奇霉素n氯霉素氯霉素n克拉霉素克拉霉素n克林霉素克林霉素n红霉素红霉素34影响影响K-B法抑菌区大小的技术因素法抑菌区大小的技术因素n

20、接种密度：菌落接近融合生长为宜接种密度：菌落接近融合生长为宜n纸片放置时间纸片放置时间n孵育温度孵育温度n孵育时间孵育时间n培养皿的大小、培养基深度、抗菌药物纸片间距培养皿的大小、培养基深度、抗菌药物纸片间距n纸片中抗菌药物的含量纸片中抗菌药物的含量n培养基组分：培养基中细菌生长速度、药物扩散速培养基组分：培养基中细菌生长速度、药物扩散速度、药物活性等因素均可影响抑菌区的大小。度、药物活性等因素均可影响抑菌区的大小。35方法学评价方法学评价n优点优点n技术简单、试剂量较低、不需特殊设备、易于由技术简单、试剂量较低、不需特殊设备、易于由人判断人判断n抗菌药物可自由选择抗菌药物可自由选择n缺点缺点

21、n影响因素多，方法必须标准化和规范化影响因素多，方法必须标准化和规范化n不能定量不能定量n特殊耐药菌不能检测（如特殊耐药菌不能检测（如VISA和低水平和低水平VRE）36质量控制质量控制n质量控制的目的质量控制的目的n是保证检验结果的精确性、可靠性和可重复性，是保证检验结果的精确性、可靠性和可重复性，规范试验中使用的各种试剂，规范操作者的操作规范试验中使用的各种试剂，规范操作者的操作规程和对结果的判断。规程和对结果的判断。n质量控制的方法质量控制的方法n采用已知抗菌药物敏感的标准菌株进行测试采用已知抗菌药物敏感的标准菌株进行测试37质量控制质量控制n常用标准菌株常用标准菌株n大肠埃希氏菌大肠埃

22、希氏菌ATCC25922n金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌ATCC25923n铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌ATCC27853n大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌ATCC35218n肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌ATCC700603n粪肠球菌粪肠球菌ATCC2921238质控频率质控频率n日测试标准日测试标准n每日进行质控菌株每日进行质控菌株/特定抗菌药物试验时，特定抗菌药物试验时，20个个连续样品中，测定值在预定值范围外连续样品中，测定值在预定值范围外1次，即为次，即为95%可信。若可信。若1次则需查找误差原因并予以纠次则需查找误差原因并予以纠正正39质量控制质量控制n周测试标准周测试标准n连续连续30天测试质控菌株

23、天测试质控菌株/特定抗菌药物，测定值特定抗菌药物，测定值不在预定值范围不在预定值范围3次，可改为周测试，若次，可改为周测试，若3则则需查找原因需查找原因n在进行周测试时若出现一次不在预定值范围，则在进行周测试时若出现一次不在预定值范围，则需连续需连续5天测试，若均在预定值范围内，可恢复天测试，若均在预定值范围内，可恢复周测试，若有任何一次超出预定值，则需查找原周测试，若有任何一次超出预定值，则需查找原因，重新开始连续因，重新开始连续5天测试，日测试需进行到问天测试，日测试需进行到问题解决为止题解决为止40耐药性的概念耐药性的概念n细菌（真菌）对抗菌药物的相对抗性细菌（真菌）对抗菌药物的相对抗性

24、n固有耐药（固有耐药（intrinsic resistance,天然耐天然耐药）药）n获得性耐药获得性耐药(acquired resistance)n交叉耐药交叉耐药(cross resistance)n多重耐药多重耐药(multidrug resistance，MDR)41耐药性监测的意义耐药性监测的意义n拖延耐药基因的出现拖延耐药基因的出现n制止已出现耐药基因的播散制止已出现耐药基因的播散n耐药基因和机制的推断耐药基因和机制的推断n提高提高“医院感染控制医院感染控制”的质量的质量n耐药监测是经验用药的基础耐药监测是经验用药的基础42 - -内酰胺酶的检测内酰胺酶的检测n头孢哨噻吩（头孢哨噻

25、吩（Nitrocefin)法法n碘测定法碘测定法43 - -内酰胺酶阳性的临床意义内酰胺酶阳性的临床意义n预示嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和卡他莫拉预示嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和卡他莫拉菌对青霉素、氨苄西林和阿莫西林耐药菌对青霉素、氨苄西林和阿莫西林耐药n预示葡萄球菌、肠球菌对青霉素、氨苄预示葡萄球菌、肠球菌对青霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、替卡西林、羧苄西青霉素、阿莫西林、替卡西林、羧苄西林、哌拉西林耐药林、哌拉西林耐药44革兰阴性菌耐药性的检测革兰阴性菌耐药性的检测n超广谱超广谱内酰胺酶（内酰胺酶（ESBLs） n染色体介导高产头孢菌素酶（染色体介导高产头孢菌素酶（AmpC酶）酶）n碳青霉烯酶碳青霉烯酶

26、 45ESBLsESBLs的分类的分类根据基因同源性不同分为：根据基因同源性不同分为：TEM型型 80SHV型型 46CTX-M型型 37OXA型型 18其它型其它型 20http:/www.lahey.org/studies/webt.htm.CTX-M-1组组CTX-M-2组组CTX-M-8组组CTX-M-9组组46ESBLsESBLs 的的 检测检测n单纸片筛选试验单纸片筛选试验n头孢泊肟（头孢泊肟（10g/片）片）17mmn头孢他啶（头孢他啶（30g/片）片）22mmn氨曲南（氨曲南（30g/片）片）27mmn头孢噻肟（头孢噻肟（30g/片）片）27mmn头孢曲松（头孢曲松（30g/片

27、）片）25mm47ESBLsESBLs 的的 检测检测n双纸片协同实验：双纸片协同实验：内酰胺酶抑制剂内酰胺酶抑制剂n确证试验：确证试验：n头孢他啶头孢他啶/克拉维酸（克拉维酸（30/10g/片）片） 头孢头孢他啶他啶5mmn头孢噻肟头孢噻肟/克拉维酸（克拉维酸（30/10g/片）片） 头孢头孢噻肟噻肟5mm48抑制剂增强的纸片扩散法抑制剂增强的纸片扩散法头孢噻肟头孢噻肟 克拉维酸克拉维酸头孢噻肟头孢噻肟头孢他啶头孢他啶头孢他啶头孢他啶 克拉维酸克拉维酸49ESBLs Detection Methods:InhibitionESBLs Detection Methods:Inhibition

28、by Clavulanic by Clavulanic Acid Acid Ronald J. Jones （Reprinted with Permission of Author）. ESBL Etest Prescribing Information AB BIODISK50ESBLsESBLs 的耐药性的耐药性 n所有青霉素类所有青霉素类n头孢菌素类（头孢菌素类（、代）代）n氨曲南氨曲南n如已使用如已使用CLSI2010新折点，以上头孢菌素和新折点，以上头孢菌素和氨曲南的检测结果无需修正氨曲南的检测结果无需修正51头孢菌素酶头孢菌素酶哪些细菌产生哪些细菌产生AmpC酶酶?n 肠杆菌属（阴

29、沟、产气）肠杆菌属（阴沟、产气）n 弗劳地枸橼酸杆菌弗劳地枸橼酸杆菌n 摩根摩根菌摩根摩根菌n 普鲁菲登菌属普鲁菲登菌属n 粘质沙雷菌等粘质沙雷菌等52n分子量大约为分子量大约为39000左右左右n等电点大多等电点大多9.0n能分解三代头孢菌素及单环酰胺类抗生素能分解三代头孢菌素及单环酰胺类抗生素n不被不被-内酰胺酶抑制剂所抑制，但可被氯唑西内酰胺酶抑制剂所抑制，但可被氯唑西林抑制林抑制头孢菌素酶头孢菌素酶53n低基础水平持续表达低基础水平持续表达n低基础水平和高诱导产生低基础水平和高诱导产生n高基础水平持续表达：高基础水平持续表达：AmpC调节调节基因突变基因突变表型分类表型分类5455Am

30、pC酶的检测（三维试验）酶的检测（三维试验） 酶的提取酶的提取 冻融法冻融法 超声波破碎法超声波破碎法 1个菌落个菌落 1个菌落个菌落 种入种入12ml大豆汤。大豆汤。35 0C震摇震摇4-6h 种入种入40ml大豆汤。大豆汤。35 0C震摇过夜震摇过夜 4 0C 40000rpm，离心，离心20min，去上清液，去上清液 4 0C 4000rpm，离心，离心20分钟，去上清液分钟，去上清液 沉淀物沉淀物-89 0C反复冻溶反复冻溶5次次 重悬在重悬在5mlpH7.0 的的.01MPBS中中加入加入1.5mlpH7.0的的0.01MPBS， 超声波破碎超声波破碎10秒，间隔秒，间隔15秒，重复

31、秒，重复 旋转混匀。旋转混匀。 10次次 4 0C 12,000转转rpm离心离心20分钟分钟 4 0C 12,000rpm离心离心20分钟分钟 取上清液，取上清液，-20 0C保存备用保存备用 取上清液，取上清液，-20 0C保存备用保存备用56-内酰胺酶的检测内酰胺酶的检测CTX酶粗提液酶粗提液酶粗提液酶粗提液+克拉维酸克拉维酸酶粗提液酶粗提液+氯唑西林氯唑西林酶粗提液酶粗提液+克拉维酸克拉维酸+氯唑西林氯唑西林57产产AmpC酶菌株的耐药性酶菌株的耐药性n对下列药物耐药对下列药物耐药n头霉素类（头孢西丁、头孢美唑）头霉素类（头孢西丁、头孢美唑）n第三代头孢菌素第三代头孢菌素n酶抑制剂复方

32、制剂酶抑制剂复方制剂并可同时对氟喹酮类和氨基糖苷类耐药并可同时对氟喹酮类和氨基糖苷类耐药n对第四代头孢菌素（头孢吡肟）和碳青霉烯类敏感对第四代头孢菌素（头孢吡肟）和碳青霉烯类敏感n如为如为ESBLs+AmpC酶菌株第四代头孢菌素亦耐药酶菌株第四代头孢菌素亦耐药58n指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的一类霉烯类抗生素的一类内酰胺酶内酰胺酶n分别属于分别属于Ambler分子分类中的分子分类中的A类、类、B类、类、D类酶类酶 。 碳青霉烯酶碳青霉烯酶 59n 天然来源碳青霉烯酶天然来源碳青霉烯酶 嗜麦芽寡养单胞菌的嗜麦芽寡养单胞菌的L1酶酶

33、n 获得性碳青霉烯酶（获得性碳青霉烯酶（Ambler分子分类）分子分类） B类类酶酶（金属酶）：金属酶）：IMP、VIM类及类及SPM-1 A类酶：类酶：NMC-A、KPC-1、GES-2等等 D类酶：类酶：OXA-23至至OXA-27、40、48、54碳青霉烯酶按其来源可分为碳青霉烯酶按其来源可分为60IMP纸片EDTA2-巯基丙酸阳性对照株结果阳性对照株结果临床标本结果临床标本结果IMP纸片EDTA2-巯基丙酸金属酶筛选结果金属酶筛选结果61 2001年在美国北卡罗来纳州首次报道年在美国北卡罗来纳州首次报道 属于属于A类类2f组丝氨酸碳青霉烯酶组丝氨酸碳青霉烯酶-内内酰胺酶酰胺酶 水解包括

34、碳青霉烯类抗生素在内的所水解包括碳青霉烯类抗生素在内的所有有-内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素,但对头孢他啶和但对头孢他啶和头孢西丁相对较弱头孢西丁相对较弱,不被不被EDTA抑制，加抑制，加Zn之后活性不增强之后活性不增强 酶抑制剂如克拉维酸有部分抑制作用酶抑制剂如克拉维酸有部分抑制作用 编码基因位于质粒上编码基因位于质粒上 肺炎克雷伯菌产生的碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌产生的碳青霉烯酶KPC（Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase)62n肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌n其他肠杆菌科细菌：大肠埃希菌、产酸克其他肠杆菌科细菌：大肠埃希菌、产酸克雷伯菌、沙门菌、肠杆菌属、黏质沙雷雷

35、伯菌、沙门菌、肠杆菌属、黏质沙雷菌、弗劳地枸椽酸杆菌和奇异变形杆菌菌、弗劳地枸椽酸杆菌和奇异变形杆菌n铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌n恶臭假单胞菌恶臭假单胞菌产产KPC酶的菌株酶的菌株63产产KPC酶菌株的检测酶菌株的检测n 何时需进行何时需进行KPC酶的检测酶的检测n头孢他啶头孢他啶 Rn头孢噻肟头孢噻肟 Rn头孢曲松头孢曲松 Rn头孢吡肟不定头孢吡肟不定n厄他培南厄他培南 MIC2 g/ml 19-21mmn亚胺培南亚胺培南 MIC2-4 g/ml n美罗培南美罗培南 MIC2-4 g/ml 16-21mm注意：亚胺培南不用于筛选变形杆菌属注意：亚胺培南不用于筛选变形杆菌属/普罗威登菌属普罗威登

36、菌属/摩根菌属，也不用于摩根菌属，也不用于K-B法筛查（检测性能差）法筛查（检测性能差）64The modified Hodge test Mueller-Hinton agar plate was inoculated with a 1:10 dilution of a 0.5McFarland suspension of E. coli ATCC 25922 and streaked for confluent growth using a swab. A10-ug imipenem disk was placed in the center, and each test isolate

37、was streaked from the disk to the edge of the plate. Isolate A is a KPC producer and positive by the modified Hodge test. IsolatesB, C, Dand E do not produce a carbapenemase and are negative by the test.K. F. Anderson, D. R. Lonsway, J. K. Rasheed，etal. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2007, p

38、. 27232725Modified Hodge test65n单产单产KPC酶菌株表现只是对碳青霉烯类抗酶菌株表现只是对碳青霉烯类抗生素低度耐药，合并膜孔蛋白缺失，高度耐生素低度耐药，合并膜孔蛋白缺失，高度耐药。药。n可与其它质粒介导的耐药基因同时存在，可与其它质粒介导的耐药基因同时存在，如如qnr、OXA、ESBLs、AmpC、氨基糖、氨基糖苷甲基化酶基因等，可形成所有常规抗菌苷甲基化酶基因等，可形成所有常规抗菌药物耐药。药物耐药。产产KPC酶菌株的耐药性酶菌株的耐药性66关于碳青霉烯酶阳性但碳青霉烯类关于碳青霉烯酶阳性但碳青霉烯类“敏感敏感” 的菌株的菌株n对报告可作评论：对报告可作评论

39、：“这株细菌证实产碳青霉烯酶。碳青霉烯类对这株细菌证实产碳青霉烯酶。碳青霉烯类对处于敏感范围处于敏感范围(厄他培南厄他培南2 g/ml、亚胺培南、亚胺培南4 g/ml和和/或美罗培南或美罗培南4g/ml)的肠杆菌科的肠杆菌科细菌引起感染的临床功能还未明。但是在体细菌引起感染的临床功能还未明。但是在体外证实是碳青霉烯酶产生株外证实是碳青霉烯酶产生株”67n产产KPC酶菌株体外药敏试验可对所酶菌株体外药敏试验可对所有常用抗菌药物耐药，但对替加环素、有常用抗菌药物耐药，但对替加环素、多粘菌素多粘菌素B和多粘菌素和多粘菌素E敏感率较高，敏感率较高，在国外已用于治疗在国外已用于治疗n因为尿液中浓度低，替

40、加环素不推因为尿液中浓度低，替加环素不推荐用于治疗尿道感染荐用于治疗尿道感染产产KPC酶菌株的治疗酶菌株的治疗68革兰阳性菌的耐药性检测革兰阳性菌的耐药性检测nMRSA与与MRCoNSnVREnPRSPnVISA、hVISA与与VRSA69诱导性诱导性-内酰胺酶内酰胺酶70诱导性诱导性-内酰胺酶的检测内酰胺酶的检测71如何报告葡萄球菌属青霉素结果如何报告葡萄球菌属青霉素结果72MRSA的定义73MRSA的定义74 mecA-介导的金葡菌耐药检测方法比较介导的金葡菌耐药检测方法比较 敏感性敏感性:苯唑苯唑 MIC = 苯唑苯唑 纸片纸片 = 头孢西丁纸片头孢西丁纸片 = PBP2a = mecA

41、* 99% 98% 98% 100%特异性特异性:苯唑苯唑 MIC = 苯唑苯唑 纸片纸片 =头孢西丁纸片头孢西丁纸片 = PBP2a = mecA 100% 99% 100% 100%4775MRS的表型试验的表型试验 n 纸片扩散法纸片扩散法 用头孢西丁用头孢西丁 ( 30 g) 纸片纸片金葡菌金葡菌 其结果和苯唑西林纸片法一致其结果和苯唑西林纸片法一致（mecA金葡）金葡） CoNS 优于苯唑西林纸片法（已被取消）优于苯唑西林纸片法（已被取消） 结果清晰，读起来比苯唑西林容易。结果清晰，读起来比苯唑西林容易。 报告时仍报苯唑西林，而不是头孢西丁报告时仍报苯唑西林，而不是头孢西丁 MIC试

42、验试验 仍用苯唑西林药仍用苯唑西林药4376MRS的表型试验的表型试验头孢西丁折点头孢西丁折点 头孢西丁抑菌圈头孢西丁抑菌圈 (mm) Res Susc 金葡菌和金葡菌和 21* 22* 路登葡萄球菌路登葡萄球菌 CoNS 24* 25*报告苯唑西林耐药报告苯唑西林耐药* 报告苯唑西林敏感报告苯唑西林敏感 4477MRSA的检测78针对CoNS的试验规则改变79MRSA/MRSE的耐药性的耐药性n青霉素类青霉素类n头孢菌素类头孢菌素类n碳青霉烯类碳青霉烯类n含酶抑制剂的复方制剂含酶抑制剂的复方制剂均应报告耐药，而不考虑其体外药敏结果均应报告耐药，而不考虑其体外药敏结果80葡萄球菌葡萄球菌n “

43、大环内脂类耐药的葡萄球菌可以改变、诱导克林霉素耐药大环内脂类耐药的葡萄球菌可以改变、诱导克林霉素耐药 n 由由erm基因导致基因导致 23S rRNA 甲基化耐药，与大环内脂类甲基化耐药，与大环内脂类, 林可林可霉素霉素, 和和 链阳霉素链阳霉素 B型有交叉，又叫型有交叉，又叫 MLSB 耐药耐药n 或只耐大环内脂类或只耐大环内脂类 (msrA 基因编码的泵出机制基因编码的泵出机制 ).”81机制机制基因基因红霉素红霉素克林霉素克林霉素泵出泵出msrARS改变核糖体改变核糖体(诱导诱导)ermRS*改变核糖体改变核糖体(结构结构)ermRR结构型结构型葡萄球菌葡萄球菌 红霉素红霉素 / 克林霉

44、素克林霉素82可诱导的克林霉素耐药可诱导的克林霉素耐药 (erm-介导介导)常规常规D试验试验: 阳性阳性 15 g 红霉素纸片及红霉素纸片及 2 g克林霉素之间距离为克林霉素之间距离为15-26.“D Test” 阳性反应阳性反应 83可诱导的克林霉素耐可诱导的克林霉素耐药药 (erm-介导介导)另一例子另一例子“D Test” 阳性阳性 反应反应84“D Test” 阴性阴性 反应反应无诱导无诱导(泵出泵出msrA-介导介导的红霉素耐药的红霉素耐药)85金葡菌金葡菌clindamycin R erythromycin R oxacillin R penicillin R vancomyci

45、n /“此此 金葡菌金葡菌 假定耐药，因为查出诱导型的克林霉素耐药假定耐药，因为查出诱导型的克林霉素耐药 . 但有些病人对克林霉素仍有效但有些病人对克林霉素仍有效.”“D Test” 阳性及评论阳性及评论86葡萄球菌对万古霉素的药敏试验87葡萄球菌对万古霉素的药敏试验88葡萄球菌对万古霉素的药敏试验89hVISA的意义的意义nheterogenous vancomycin-intermediate resistance S. aureus (hVISA)which had been first reported by Hiramatsu et al in 1997.nhVISA strains

46、 were reported from some Asiancountries. nThese various types of reduced susceptibility to vancomycin could lead to clinical failures of vancomycin treatment90hVISA的意义的意义91耐药肺炎链球菌的检测耐药肺炎链球菌的检测n耐药肺炎链球菌耐药肺炎链球菌:PNSP（PISP+PRSP）PNSP（脑膜炎标准）（脑膜炎标准）n对青霉素的对青霉素的MIC值值2.0g/ml=R,（PRSP）nMIC值在值在0.12g1.0g/ml之间的菌株为相

47、之间的菌株为相对耐药（低耐）菌株（对耐药（低耐）菌株（PISP）n MIC值值0.06g/ml=S92CLSI对肺炎链球菌性的对肺炎链球菌性的MIC折点折点注意：脑膜炎和非脑膜炎不同！注意：脑膜炎和非脑膜炎不同！93肺炎链球菌耐药性的检测肺炎链球菌耐药性的检测20 mm 报告青霉素敏感报告青霉素敏感青霉素的最低抑菌浓度青霉素的最低抑菌浓度=0.03mcg/ml19 mm 不能报告青霉素的结果，需进行不能报告青霉素的结果，需进行青霉素最小抑菌浓度的测试，因此时青毒素青霉素最小抑菌浓度的测试，因此时青毒素的结果可能为的结果可能为S、I或或R。青霉素的最低抑菌。青霉素的最低抑菌浓度浓度=1 mcg/

48、ml；非脑膜炎型的感染敏感；非脑膜炎型的感染敏感（例如：肺炎）（例如：肺炎）苯唑西林纸片扩散法结果可提示肺炎链球菌对青霉素的敏感性苯唑西林纸片扩散法结果可提示肺炎链球菌对青霉素的敏感性94肺炎链球菌耐药性的检测肺炎链球菌耐药性的检测n虽然虽然AMO、AMP、头孢吡肟、头孢噻肟、头、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松、头孢呋辛、孢曲松、头孢呋辛、IMP和和MRP可用于治疗可用于治疗SPN的感染，但对这些药物尚不存在可靠的的感染，但对这些药物尚不存在可靠的纸片法药敏试验，最好用纸片法药敏试验，最好用MIC法测定其体外法测定其体外抗菌活性。抗菌活性。n对从对从CSF、血液和其他深部组织分离到的肺、血液和其

49、他深部组织分离到的肺炎链球菌菌株应该常规检测其对青霉素、头炎链球菌菌株应该常规检测其对青霉素、头孢噻肟、头孢曲松、美罗配南和万古霉素的孢噻肟、头孢曲松、美罗配南和万古霉素的MIC，对临床治疗失败的菌株也一样，对临床治疗失败的菌株也一样95VRE的耐药性及检测方法的耐药性及检测方法n肠球菌对万古霉素的耐药可分为低水平肠球菌对万古霉素的耐药可分为低水平耐药（耐药（MIC，8-32mg/L）和高水平耐药）和高水平耐药（MIC，64mg/L）。）。n根据肠球菌对万古霉素和替考拉宁的不根据肠球菌对万古霉素和替考拉宁的不同耐药水平及耐药基因，同耐药水平及耐药基因，VRE分为四个分为四个表型，分别是表型，分

50、别是VanA，VanB，VanC和和VanD。96VRE的耐药性及检测方法的耐药性及检测方法n纸片扩散试验检测万古霉素的要点n用纸片扩散试验检测万古霉素的耐药性时需要孵育足24h（而不是1618h）。n仔细查看抑菌圈，如有任何小菌落或薄膜出现均报告为耐药。n如果出现中介结果，必须用MIC试验确认97VRE的耐药性及检测方法的耐药性及检测方法nVRE的检测方法的检测方法可用稀释法、纸片扩散法、可用稀释法、纸片扩散法、E test和自动仪器。和自动仪器。n在检测在检测VanA，VanB，VanC1/C2时，时，E test和琼和琼脂筛选法最好，敏感率为脂筛选法最好，敏感率为100%。n纸片扩散法检