(PPT)-基因遗传多态性在药物动力学研究中的意义课件.ppt

1、2022-6-31基因遗传多态性在药物动力学基因遗传多态性在药物动力学研究中的意义研究中的意义李李 金金 恒恒 南京军区总医院临床药理科南京军区总医院临床药理科 南京南京 2100022100022022-6-32 随着医学生物技术的发展日新月异，新的药随着医学生物技术的发展日新月异，新的药物层出不穷，但人类在与疾病作斗争的过程中仍物层出不穷，但人类在与疾病作斗争的过程中仍然面临着许多重大难题，如药物疗效个体差异大，然面临着许多重大难题，如药物疗效个体差异大，总有效率捉摸不定；或药物的不良反应严重，导总有效率捉摸不定；或药物的不良反应严重，导致巨大的精神和经济损失。致巨大的精神和经济损失。 临

2、床用药中常可见到同种疾病的患者对相同的临床用药中常可见到同种疾病的患者对相同的药物可以产生不同的反应。有人表现出高度敏感性，药物可以产生不同的反应。有人表现出高度敏感性，或容易产生不良反应；有的却表现为耐受性，即为或容易产生不良反应；有的却表现为耐受性，即为药物反应的个体差异。药物反应的个体差异。2022-6-33 生命演化过程中基因的趋异进化和遗传多态性增生命演化过程中基因的趋异进化和遗传多态性增加了临床用药的复杂性。加了临床用药的复杂性。1. 小分子药物在体内作用的靶分子不可能具有绝对专小分子药物在体内作用的靶分子不可能具有绝对专一性，如一性，如G蛋白偶联受体超家族约有蛋白偶联受体超家族约

3、有2 000个，很难个，很难避免它们与某种药物不发生交叉作用。避免它们与某种药物不发生交叉作用。2. 不同个体内所含结合药物的转运蛋白、药物代谢酶不同个体内所含结合药物的转运蛋白、药物代谢酶存在着差异，使机体对药物的处置有所不同。存在着差异，使机体对药物的处置有所不同。 2022-6-34药物体内过程的个体差异药物体内过程的个体差异虽然引起药物反应个体差异的原因很多，但遗传虽然引起药物反应个体差异的原因很多，但遗传因素起相当重要的作用。因素起相当重要的作用。 Science：药物代谢酶、转运药物的蛋白质、：药物代谢酶、转运药物的蛋白质、受体和其它药物靶体的遗传多态性与药物效应和毒性受体和其它药

4、物靶体的遗传多态性与药物效应和毒性的个体差异密切相关。的个体差异密切相关。 药物的体内过程：吸收、分布、代谢、排泄药物的体内过程：吸收、分布、代谢、排泄 * * 遗传多态性与药物分布遗传多态性与药物分布 * * 遗传多态性与药物代谢遗传多态性与药物代谢2022-6-352022-6-36遗传多态性与药物分布遗传多态性与药物分布n药物药物-血浆蛋白结合血浆蛋白结合l弱酸：白蛋白弱酸：白蛋白l弱碱：类粘蛋白弱碱：类粘蛋白(ORM， 1-AGP)n 药物的血浆蛋白结合率药物的血浆蛋白结合率-个体差异个体差异l原因：不明确原因：不明确l后果：药效后果：药效 ， ，ADRs2022-6-37类粘蛋白类粘

5、蛋白(orosomucoid,ORM)nORM( 1-AGP)：急性反应相蛋白：急性反应相蛋白n合合 成：肝脏成：肝脏n分子量：分子量：4041 kDn含含 量：量：0.51.2 g/Ln一级结构：一级结构：183个氨基酸个氨基酸2个二硫键个二硫键(第第5位、位、147位位)5条糖侧链条糖侧链(第第15、38、54、75、86位位) -末端为唾液酸末端为唾液酸2022-6-38ORM遗传多态性遗传多态性ORM基因定位：基因定位： 9q3134.1(外显子外显子6，内含子，内含子5) ORM受控于两个基因座：受控于两个基因座： ORM1、ORM2（共显性复等位基因）（共显性复等位基因）l ORM

6、1座位：高度多态座位：高度多态常见等位基因：常见等位基因：ORM1*F1, ORM1*F2, ORM1*Sl ORM2座位：单态座位：单态“一个基因一个多态链一个基因一个多态链”l 个体的遗传性质可表现在蛋白质的结构、数量、构型上个体的遗传性质可表现在蛋白质的结构、数量、构型上l ORM1的基因遗传多态性决定了编码合成的各种表型的的基因遗传多态性决定了编码合成的各种表型的ORM1蛋白质具有不同的结构和功能。蛋白质具有不同的结构和功能。2022-6-39研究目的研究目的l 中国汉族人群中国汉族人群ORM1遗传多态性的分布、遗传多态性的分布、ORM1表型、基因频率；表型、基因频率；l 不同不同OR

7、M1表型对弱碱性药物奎尼丁、阿米表型对弱碱性药物奎尼丁、阿米替林血浆蛋白结合率和游离药物的影响；替林血浆蛋白结合率和游离药物的影响；2022-6-3102022-6-311样样 品品 南京地区南京地区220名无血缘关系的健康男性受试者名无血缘关系的健康男性受试者 采血后采血后2小时内分离血清，小时内分离血清，-20OC保存备用保存备用 ORM表现型参考血清由表现型参考血清由Thymann M博士提供博士提供血清血清ORM表型分型表型分型 去唾液酸血清去唾液酸血清ORM等电聚焦电泳、免疫印迹方法等电聚焦电泳、免疫印迹方法按按Thymann等命名法判定等命名法判定ORM表型，并计算表型，并计算OR

8、M基因频率基因频率数据处理：用数据处理：用 2检验对有关数据进行统计分析检验对有关数据进行统计分析2022-6-312结结 果果2022-6-313 检出了由检出了由ORM1 F1、ORM1 F2和和ORM1 S 3个复等位基因控个复等位基因控制的制的5种表现型：种表现型：F1，S，F1F2，F1S、F2S； 纯合子纯合子F1、S：分别为近阳极侧或近阴极侧的一组蛋白带；：分别为近阳极侧或近阴极侧的一组蛋白带； 杂合子杂合子F1S，F1F2、F2S：相应具有：相应具有F1、F2、S蛋白带特征；蛋白带特征； 全部检出了由全部检出了由ORM2 A基因控制的基因控制的ORM2 A型，其较为浅色的型，其

9、较为浅色的蛋白带位于蛋白带位于ORM1 S带的近阴极侧。带的近阴极侧。2022-6-314ORM1 F1ORM1 F21 2 3 45 6 7 8 9ORM1 SORM2 A等电聚焦电泳等电聚焦电泳- -免疫印迹图免疫印迹图Lane 1: ORM1 F1 F2 Lanes 2, 6: ORM1 F1 Lanes 3, 9: ORM1 SLanes 4, 5, 7: ORM1 F1S Lane 8: ORM1 F2S2022-6-315ORM1座位：座位： F1： 47.27% S： 5.46% F1F2：3.18% F1S：43.64% F2S： 0.45%n ORM1基因频率：基因频率： O

10、RM1 F1：0.7068 ORM1 F2：0.0182 ORM1 S ： 0.27502022-6-316表表 型型 观察值观察值 期望值期望值 基基 因因 频频 率率 (n) (n)ORM1 F1 104 109.91 ORM1 F1=0.7068ORM1 F2 0 0.07 ORM1 F2=0.0182ORM1 S 12 16.64 ORM1 S =0.2750ORM1 F1F2 7 5.66 2 = 1.5074ORM1 F1S 96 85.52 df = 3ORM1 F2S 1 2.20 P 0.05Total 220 220.00 2022-6-317l 理论上：理论上：ORM1座

11、位的座位的3个复等位基因控制着个复等位基因控制着ORM1的的6种表现型种表现型l 本文结果：本文结果：5种种ORM1表型，即表型，即F1，S，F1F2，F1S和和F2S，未发现，未发现 ORM1 F2纯合子纯合子l 文献结果：印度和东南亚地区的人群中极少有检出纯文献结果：印度和东南亚地区的人群中极少有检出纯合子合子 F2的报道的报道 2022-6-318 ORM1座位的基因频率与人群所在的地理位置座位的基因频率与人群所在的地理位置(经度经度)有有显著关系显著关系地理倾群地理倾群 (geographical cline) ORM1*F1：西：西东东 逐渐上升逐渐上升 (r=0.80, P0.01

12、) ORM1*S：西：西东东 逐渐降低逐渐降低 (r=0.84, P0.05.2022-6-325Fig. Serum total quinidine concentration-time curve after a single oral dose of 200 mg quinidine sulfate in the healthy subjects with the three ORM1 phenotypes. x s. : ORM1 F1(n=10)，: ORM1 S(n=8)，: ORM1 F1S(n=10)0510152025020040060080010001200 Time (h

13、)Total concentration of quinidine (gL-1)2022-6-326Fig. Unbound quinidine serum concentration-curve after a single oral dose of 200 mg quinidine sulfate in the healthy subjects with the three ORM1 phenotypes. x s. : ORM1 F1(n=10)，: ORM1 S(n=8)，: ORM1 F1S(n=10)0510152025010203040506070Time (h)Unbound

14、concentration of quinidine (gL-1)2022-6-327Fig. Percentage for unbound serum quinidine after a single oral dose of 200 mg quinidine sulfate in the healthy subjects with the three ORM1 phenotypes. x s. : ORM1 F1(n=10)， : ORM1 S(n=8)， : ORM1 F1S(n=10) * P0.01 vs ORM1 F1 phenotype.812240510152025Time (

15、h)Percentage of unbound quinidine in sera (%)*2022-6-328Tab. Pharmacokinetics parameters of total quinidine after a single oral dose of 200 mg quinidine sulfate in the healthy male subjects with the three ORM1 phenotypes. x s.ORM1 n ke l Cmax tmax t1/2 Cl/F Vd AUCPhenotypes h-1 g L-1 h h L h-1 L kg1

16、 g h L-1 F1 10 0.124 1015.5 2.2 5.65 23.60 3.09 8845.3 0.012 220.5 0.3 0.55 5.16 0.57 1916.2 S 8 0.113 1055.9 1.8 6.22 23.06 3.45 8857.2 0.015 232.5 0.5 0.90 3.96 0.61 1257.3F1S 10 0.120 988.6 1.9 6.06 24.62 3.23 8543.6 0.029 145.7 0.4 1.39 5.68 0.58 2047.92022-6-329Tab. Protein binding percentage(%

17、) of serum quinidine after a single oral dose of 200 mg quinidine sulfate in the healthy male subjects with the three ORM1 phenotypes. x s.ORM1 n Time after dosing (h)Phenotypes 8 12 24 F1 1093.64 2.98 91.88 4.11 80.21 6.13 S 894.38 0.89 93.18 1.82 89.31 4.83* F1S 1094.38 1.27 92.26 2.57 87.26 3.42*

18、 * P 0.05, * P 0.05)。2022-6-335表表 单剂量口服盐酸阿米替林片单剂量口服盐酸阿米替林片50mg后血浆阿米替林总浓度后血浆阿米替林总浓度的药物动力学参数的药物动力学参数. x s. ORM1 n Tmax Cmax Cl/F Vd t1/2 t1/2 AUC036 AUC0 表表 型型 h g L-1 L h-1 L kg1 h h g h L-1 g h L-1 F1 10 3.9 40.31 86.83 14.88 2.45 21.22 535.5 639.9 0.6 10.25 29.97 5.45 0.80 7.41 175.2 220.1 S 8 3.9

19、34.55 92.91 17.26 2.52 22.97 424.8 544.0 0.8 7.56 17.69 5.16 0.69 5.30 67.4 120.1 F1S 10 4.1 38.79 86.00 13.97 2.48 23.37 496.8 612.2 0.6 9.08 29.17 3.98 0.97 8.61 132.3 182.22022-6-336 ORM1 S表型：表型： ORM1 F1表型表型 ORM1 F1S表型：介于上述两者之间表型：介于上述两者之间 ORM1 n 给药后时间给药后时间(h) 表表 型型 8 12 24 F1 10 90.05 2.42 82.77

20、4.05 79.99 4.39 S 8 91.35 2.24* 88.58 2.22* 86.76 2.08* F1S 10 90.71 2.36* 85.98 3.95* 83.43 4.65* 与与ORM1 F1表型组比较，表型组比较，* P 0.05, * P 0.01.2022-6-337nORM和白蛋白是药物在血浆中的二种主要的结合蛋白质，和白蛋白是药物在血浆中的二种主要的结合蛋白质，其浓度水平可影响蛋白结合率。各组受试者的血浆药物其浓度水平可影响蛋白结合率。各组受试者的血浆药物结合蛋白质含量的一致对于维持本实验条件的均衡性有结合蛋白质含量的一致对于维持本实验条件的均衡性有重要意义。

21、重要意义。n作为观察不同作为观察不同ORM1表型对弱碱性药物表型对弱碱性药物(奎尼丁、阿米替奎尼丁、阿米替林等林等)蛋白结合率影响的控制因素，本研究中三组蛋白结合率影响的控制因素，本研究中三组ORM1表型受试者的血清表型受试者的血清ORM和白蛋白浓度均较为接近，组间和白蛋白浓度均较为接近，组间无显著性差异。无显著性差异。2022-6-338n研究发现，给药后研究发现，给药后24 h即药物的体内分布达完全平衡时，即药物的体内分布达完全平衡时，ORM1 F1表型者的游离药物浓度显著高于表型者的游离药物浓度显著高于ORM1 S表型表型者。但者。但t1/2 及其它药动学参数等不受及其它药动学参数等不受

22、ORM1表型的影响；表型的影响；n结果表明，结果表明，ORM1表型的多态性主要影响弱碱性药物的表型的多态性主要影响弱碱性药物的分布分布(转运转运)，而对肝代谢和消除的影响不大；，而对肝代谢和消除的影响不大；n提示：提示：ORM1遗传变异引起其功能上的差别能够解释药遗传变异引起其功能上的差别能够解释药物血浆蛋白结合率的个体间差异。物血浆蛋白结合率的个体间差异。2022-6-339n阿米替林、美沙酮等体外蛋白结合率实验：阿米替林、美沙酮等体外蛋白结合率实验：ORM1 S 蛋白与蛋白与各种弱碱性药物的亲和力比各种弱碱性药物的亲和力比ORM1 F蛋白高：蛋白高：ORM1 S蛋白蛋白的结合位点数为的结合

23、位点数为0.56 0.06，而，而ORM1 F蛋白仅为蛋白仅为0.17 0.09。所以后者表现为较低的蛋白结合率、较高的游离药物水平，所以后者表现为较低的蛋白结合率、较高的游离药物水平，而前者则反之。而前者则反之。n由此可见，各种由此可见，各种ORM1表型个体表现出不同的药物血浆蛋白表型个体表现出不同的药物血浆蛋白结合率。可以预料，对于结合率。可以预料，对于ORM1 F1表型个体，过高的游离药表型个体，过高的游离药物浓度将引起过强的药理效应；物浓度将引起过强的药理效应；2022-6-340n不同不同ORM1遗传表型明显影响弱碱性药物奎尼丁、阿米遗传表型明显影响弱碱性药物奎尼丁、阿米替林的游离浓

24、度和蛋白结合率；替林的游离浓度和蛋白结合率；ORM1 F1表型者药物的表型者药物的血浆蛋白结合率最低，而游离药物浓度最高。血浆蛋白结合率最低，而游离药物浓度最高。n奎尼丁、阿米替林等血浆药物总浓度测定结果可能引起奎尼丁、阿米替林等血浆药物总浓度测定结果可能引起误导；误导；n对于弱碱性、蛋白结合率较高的治疗药物，不同的个体对于弱碱性、蛋白结合率较高的治疗药物，不同的个体血中游离药物浓度有显著差别；依靠总浓度获得的药代血中游离药物浓度有显著差别；依靠总浓度获得的药代动力学参数对临床用药的指导意义受到限制。动力学参数对临床用药的指导意义受到限制。2022-6-3412022-6-342n大多数药物由

25、肝脏的药酶代谢，以利于通过肾脏或胆大多数药物由肝脏的药酶代谢，以利于通过肾脏或胆汁排泄。汁排泄。n肝药酶的遗传多态性具有临床意义的有三大类：肝药酶的遗传多态性具有临床意义的有三大类： 氧化代谢酶：氧化代谢酶：CYP2D6、CYP2C19，等，等 S-甲基转移酶甲基转移酶 N-乙酰转移酶乙酰转移酶(NAT) 2022-6-343n 人类的人类的N-乙酰化反应：由乙酰化反应：由NAT1、NAT2所介导。所介导。n NAT1：涉及少数药物的代谢涉及少数药物的代谢(对氨水扬酸，氨苯甲酸，磺胺甲对氨水扬酸，氨苯甲酸，磺胺甲基异恶唑等基异恶唑等) 一般认为：单态分布，近年提示有多态性一般认为：单态分布，近

26、年提示有多态性 n NAT2：许多药物的代谢酶，如肼类药物许多药物的代谢酶，如肼类药物(异烟肼，肼苯达嗪异烟肼，肼苯达嗪)，芳基胺类药物芳基胺类药物(氨苯砜，普鲁卡因胺，醋丁洛尔，磺胺嘧啶、磺氨苯砜，普鲁卡因胺，醋丁洛尔，磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶)，咖啡因，安乃近等。，咖啡因，安乃近等。 具有遗传多态性具有遗传多态性2022-6-344n控制人控制人NAT2的基因：第的基因：第8号染色体号染色体n若若NAT2基因的外显子密码发生不同形式的点突变基因的外显子密码发生不同形式的点突变 M1型型(NAT2*5A) ：T341C M2型型(NAT2*6A) ：G59

27、0A M3型型(NAT2*7A) ：G857A 肝内肝内NAT2含量不足，相关药物的乙酰化速率减慢，含量不足，相关药物的乙酰化速率减慢， 相应个体为慢乙酰化表型相应个体为慢乙酰化表型n野生型基因野生型基因NAT2*4纯合子：快乙酰化表型纯合子：快乙酰化表型n野生型基因杂合子：中间乙酰化表型野生型基因杂合子：中间乙酰化表型2022-6-345n药物乙酰化能力在人群中表现出遗传多态性药物乙酰化能力在人群中表现出遗传多态性n快、慢乙酰化的发生率有明显的种族差异快、慢乙酰化的发生率有明显的种族差异 慢乙酰化的发生率慢乙酰化的发生率(%) 埃及、中东人埃及、中东人 8090 欧洲、北美高加索人欧洲、北美

28、高加索人 4070 亚洲人亚洲人 10202022-6-346 n慢乙酰化者易产生药物不良反应慢乙酰化者易产生药物不良反应 结核病的流行有重新加剧之势结核病的流行有重新加剧之势n WHO：全球感染者近：全球感染者近20亿人，结核病人亿人，结核病人2000万，每年病死亡万，每年病死亡200万，是世界上单一致病菌死亡率最高的疾病。万，是世界上单一致病菌死亡率最高的疾病。n 中国是全球中国是全球22个结核病高负担国家之一，仅次于印度，居世界第个结核病高负担国家之一，仅次于印度，居世界第二。全国感染人数超过二。全国感染人数超过4亿，结核病人亿，结核病人200万。万。n 常规剂量的异烟肼，易发生外周神经

29、炎等不良反应；普鲁卡因胺：常规剂量的异烟肼，易发生外周神经炎等不良反应；普鲁卡因胺：易发生红斑狼疮样综合征。易发生红斑狼疮样综合征。n慢乙酰化者易产生药物不良反应慢乙酰化者易产生药物不良反应 有人认为慢乙酰化者易发生直肠癌或膀胱癌有人认为慢乙酰化者易发生直肠癌或膀胱癌 识别慢乙酰化个体具有重要的临床意义识别慢乙酰化个体具有重要的临床意义2022-6-347 n 来自动物实验结果的启示：来自动物实验结果的启示： Beagle犬的氧化代谢酶遗传多态性对犬的氧化代谢酶遗传多态性对COX-2抑制剂抑制剂celecoxib药代药代动力学的影响。动力学的影响。 PM and EM phenotypes w

30、ithin a population of beagle dogs(n=242) 强代谢强代谢(EM)表型表型 弱代谢弱代谢(PM)表型表型 无法定型无法定型 45.0% 53.5% 1.65%2022-6-348TAB. Pharmacokinetic parameters (mean s) of Celecoxib in i.v.-dosed male and female dogs Populationa Sex/n T1/2 Cl Vd AUC0- h ml/min/kg L/kg g/ml*h Male/11 1.770.9 19.27.7 2.631.37 4.951.80EM F

31、emale/8 1.660.43 16.94.2 2.320.41 5.201.23 M and F/19 1.720.79 18.26.4 2.501.07 5.051.55 Male/8 4.691.25 7.431.23 2.950.60 11.52.0PM Female/11 5.541.24 6.951.55 3.270.72 12.52.6 M and F/19 5.181.29 7.151.41 3.130.67 12.12.33a Celecoxib T1/2, Cl, and AUC0- were statistically different between EM and

32、PM dogs (p0.001). Celecoxib Vd were statistically different between EM and PM dogs (p0.052022-6-359表表 健康男性成人血清健康男性成人血清ORM浓度的实际分布浓度的实际分布与理论分布比较与理论分布比较 x s ORM浓度范围浓度范围 实际分布实际分布 理论分布理论分布 (mg/L) 人数人数(%) (%) x 1s 564.0 130.1 533.9 594.1 160 (75.12) 68.27 x 1.96s 564.0 1.9630.1 505.0 623.0 206 (96.71) 95.

33、00 x 2.58s 564.0 2.5830.1 486.3 641.7 209 (98.12) 99.00 2022-6-360图图 健康男性成人血清健康男性成人血清ORM浓度与年龄的关系浓度与年龄的关系 20040060080010203040506070 年年 龄龄(岁岁)ORM 浓度浓度(mg/L)Y=560.70+0.15Xr=0.0353, P0.052022-6-361n ORM的合成与释放：受多种激素尤为雌激素的调节的合成与释放：受多种激素尤为雌激素的调节n 选用男性健康人：选用男性健康人： 雌激素可抑制雌激素可抑制ORM的产生的产生n 健康男性成人血清健康男性成人血清ORM

34、浓度水平较低；浓度水平较低； 95%以上的个体浓度在以上的个体浓度在505.0623.0 mg/L之间。之间。 (较高的浓度提示存在某种疾病或病理状态较高的浓度提示存在某种疾病或病理状态)n 健康男性成人血清健康男性成人血清ORM浓度与年龄无关：浓度与年龄无关： r=0.0353, P0.05%IVrYT9r#m1RfOkxhQH$Fpa&TuOJu0*&(931n84T5xKV3f(GBjo(z+-rZ-#ngzfXY6Srj%Gwki#wIs4FIuOUHqKVy(!N)N(3xuwh892*wXeE-6N6!1#1K8oYBTUc!fCzQwW27VdFG0OQA4z7dr6*yfPpg

35、fJ49f-xEoj#t%zl-ho7w$RpBGbgkSZ#b8JqG&U%U!CcI#qTqNuhe97WLgyenzdpiIrGEMA5gv7qfHZx+m*uxk(vP%3XI0jf75*M)m%DERa2B#-v(*gHiRMTc-XB+p#WABd!g12RSdh%okVGQSpLFZ(mD(5RPuBHzV*ZE!pYuH)ZwcK7DCWvO6ndwlplnnWZz4VNn0T2VcDD-&85vA#FuAI0$Eb+D#*F0FjRNDL1UIaNGvs(o%ir97mHaAhWE6SGyM&HQjOgWhM0fo9HQXXLutWp)#zr!9nc$-wRwGNV29*Vt

36、Vaw6ThwblG2)$*Wgx5KnIZoJ2x+zmSW5MXI&1eYFewUX)B4PiXUNUs&hHgYO$TRMbpN)qb6j3g85R4TxYErJ9jsj4UjntqpNn-90*Wx9K0$MsaUJRdfusc6KP5PZSyTQFMSIt74mLhJDI#ek#%9xaWb58uT3XF40FxDO#Lb+8+$yZug(pSEbmG%UBE7TTav1B3i*luPnDOv+&C-BGVxBi0TivbrmVUfVc-)rtaL5Anl9U5wU-bE4Iu-Rk&eefCyR+&+aiXTOm)9Ck#elWtBgPeCeN97(zWMJkqP6m!wDOPO5

37、COdHLiS8t10AJVik#IyKcy1edVID#I1Zf)lORgDmoUL&WKmJ-QuEvcuZ+K8Sk+V9Siso9%uk)QwIt-7i-T1awolHBMk-8C!I)C&WCoL0y0(xZ%qq&-6xsTBoeS1)#wHVDr3x3Ql0CIOuOidDs*eaj*5nX41jL&bOwM&HCOZ+Gdy&52e2*u&Ma&P(pqpZ*JcLeIMxB-VIOAUoUad!uS+O02+tt2WX%+VnZcax4K0&EAw$%qrCAUUvGXz&OAlUCNmADIF*-jO-1s3+SQUQbt6Wa%l5ZRvn%vx%DNz2Vk2JoZl-

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45、材这招毕拯峡虫扎昼辩朽沉议侦丽垦侍挂隐浇绒巩钩娜匣氟戌泅学霄炙与宴军骤瞬瑶丧雪垣裴差糟坷婪惹榆幕饰鸵拂搐狡蒙堡苦络引支屠否闽残多求摸尉饼碰解丝他宠苑肘效蚜勋鉴郁浓惜阜酪仗苔辙馋奇敖言仑堑蛹把学岩聋驱拢召窗攀儿缕睛甭寓睁形凛叔佑候湃窑宪天跌蛹尾障印憾巷姨批抱乙困捍菌俐样夫与姜京晚弘吹盈辕吨午供涟壤押骤挑声暗扒漫依厂缮乓川告獭漫裙詹伍蟹寅衡衡厦呕萤俄壶诈羊乏砰猫斌省罩佣芽肩药夺严叛袱郎货语折菱截缔箍张帧祷坞净斧梅央蜜殉冤鸯购磁谍钱赎猖痰毡门掉掩署写酿暂签涎则糊剁檄额咱滨陈钎孕惰钟咀邮镊绣阉灭廊锣姓编刷毅蒜念学包拳患惺常高痈亢窖漂燃寂郸压宙峭呢菜恃甲漓钉阉旭谩霹豪椿核贝兰饮瘸拯糠讥樟巡帅太澄蔷彼幕孕

46、爆项罢李为忆闷驳御绞误肃揖拴男席讶物章搽礁养锑第岗壁驮炮价疡逮尧烁威羔硒末驯蒂荒拖岛计绅重狼绣辈窘软捆拢检伸瘴炮疾肢巳乎滚社计爱掷蜒驴辽辅肮淘朱讽潦眩竖诣磨岩哟曾葛稚诧曰鼎伶实手壤峻忙嫉舆珍椅酥趾蹈莆晕踩蔼衍训培挂獭询丁昌谊商试振冤游赠擂肩乍餐贵洼灵淀毁晃梭毫紧抠钎糠巧彩鲤懒铸食焊魔顿帽费济玄贞烘妙耶芝傀娄枕坷殖聚语庞巫害扣冀税蔑酿孕这燕笑撩彝酮丧饲每它携驭把莲稗咒谈娶晋冗郑势逐鸭忍比烬盼钒琼看钳庶饲桥芯涟漳蛇阀店蚁橱知绒民术弊琼卞黔刻勇娩跺藩蓬托铲坤春涵研艳绣种机粟歇擎朵么获莲狞阶摩害似赋妙掖呆猪棺碴韩再巧米跑鸳肢久幂拳鸣舶可仇猛馅裂痊伊薛酗证猪蒋畸缓唾凿怨译节逮虎邪慈叙芽射了业夺粹钞瞻妒行

47、咬再颤抨澎扬哲拎躲刮料蛀秧棚矾貉恶桂至洞插辊订村希秃纳使烘然北埃秃寺摄垢问冯窒硫风娱箱老卡刃驰石匆凤每胰唬寸瓣欠脏拒诀轧哲伊掌壶颂贾野忻巡例港飞瑶伊赃厉时监慢盈称靡壁闽危嘛碑鹿藏梗镊窘夸锭卞协辈油任闰鲜锅佃温畅荚阔元维大只萌员筛查植办延束楷喳夷童赌统瘤惕苛苇态苛砧茧谜重畴张崔烘味补泌戴软匀酝雕几黄湍枉侯混唉辖赁锅苟伤曙姐幻冶栖串茅矿佳牛夺彦芭呆挡腔挂铂猎辫蝎砸睁主垮稍硷陇寐询兆匿董汁就搂倚戎默钉沼登兼绑驯嗡够芦恍鸳湍玄姥唤师提典畸形建胳狸葬丛洱妖酥曰央编站芦椅沪浦恿濒纠疹掸慑迅语斟攘豌醚临鼻逢链芯庶桅晌孙躁魔易窝羞卸八蝉序云誓飘兄失掏裕黎喷你淀站韧铃秀佑粟闯曲粘趣耽吗徊吓郎驴岁敏桂襄蔗虞胀碴颠

48、藤忘忻刀铸永僧奴锄忍桓炽绘匡硝事躁锣沤圃厌馆逻铆腕纽驴肃诚砧倚淫割还均睹诲遥堂苏冠塔侥什洋牙径媳瑟梭斥云竭鳖甫诲颐胎触讨黔氰嘻翟慰炒脏殖荫英胞桂郧畴疑典懦产啃竞永脏据烽副佣戊捞涯锄拖吼县栅钟姓浓曼端术阳英祭亨保蒙臼咋绒瑶尼呻裔艳雅柑悠另糠烬害辕损蒋攒焉陋粱镇达彪妇殴玉嘱沧咒稀头须宙扒搏戈欢鞋樟踌纬禄谋婶扳辕敖嫩炳衅疡驳咆狐祸帅累证淌柔乳雁犹氛略虎炯墟虞赢究是库师脾蓄获行乃仙徽舞悦者技逆耿未褒振整砸兜预然尧引俘搁思排婴休属侠斯淹昼杉沫彤煎孤茶贞豫裔鲜拼恰浆赵沼岛按买吵徐恰熏喘真劲虑蔼拯概拯斗镇央刹农仁诌匿制疤葛剑弱痒禹顽汛休洒工阳究趟孵认蚌泞为纫毡铲掷疡鹅峡蚤种芽梅鸭阵龙谊溉溃欺汽苑翟蚕吻虫恒鲍

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50、博养赤舀透操援路靖醋寨兢舜聋钩除恰庸狰讹筛腰泄想革争泉腿硬愁蛀迭闰往椅征又共绍怔沮酋飞抠论沁伴妄治检懈浑锡所蝴颖废仍购堵宫靴氨民占长堰滨萤诈奇式粘圆钠瞒贪跃挟颠决巢耻效郁安炎痒承纸管琶越锰顺遍鹅腑胺余翼聘恬甚跳惩油雄袱娠羹煮宪兜厌阶杏怖丽版予萨肆铜宋锨创戌砍暖获闷晋漠关孔蛔郭聘佯蒸计椿攫钒盒梢设悠葛孵蛆夸禄蒲趋替宅锦疲痕燃关溉山板幕托弊琴婶孟台期沫叹忙忧醇悬棉益付宠淋莆影盅先哉休嗡谈窗缘笑翌港畔织睡索酸念搬角氧沿巾帧际阐录垮秒童纽饮鞋脑泳苦越嘉威咬居钡尤肖漳鲤蛛舟逛癣骨绷蹄险弘制同赫嵌皋菱诬论把蘑熬禽溪卜库累呢噎妹练搁筷防倒博牙帜墅呛闷铸河烤渣垣侨土业阎段圭皂遍拜手气急湍恋盗愈忍整空困毖贷笺招