PCR抑制剂和增强剂课件.ppt

1、PCR抑制剂和增强剂PCR抑制剂 SDS 苯酚 乙醇 异丙醇 乙酸钠 氯化钠 EDTA 血红素（heme） hemin（氯高铁血红素） tannic acids（丹宁酸） 肝素尿素二甲苯胺溴酚兰腐殖质 植物多糖聚苯乙烯、聚丙烯 铁离子bilirubin（胆红素） 胆酸盐抑制剂来源抑制剂来源抑制剂抑制剂来源来源胆酸盐粪便复杂多糖粪便，植物材料胶原质组织血红素（heme）血液腐植酸土壤，植物材料，自然界水黑色素头发，皮肤尿素尿血色素hemoglobin 血液靛青染料粗斜纹棉布聚苯乙烯，聚丙烯紫外线照射塑料管蛋白酶牛奶钙离子牛奶，骨头抑制剂的作用浓度SDS离子去污剂 ，蛋白变性，0.01%即可完全抑

2、制PCR反应，0.005%可显著降低产量 苯酚蛋白变性，0.5%即可完全抑制PCR反应，0.2%可显著降低产量 乙醇大于1%的浓度可抑制PCR反应，但在某些系统中可增加产量。异丙醇抑制作用比乙醇稍强乙酸钠大于5mM时抑制PCR反应氯化钠大于25mM时抑制PCR反应EDTA0.5mM可使PCR产物减少，1mM完全没有PCR产物。血色素 1mg/ml肝素0.15I.U./ml尿素20mM（相当于10l PCR体系中含0.6l尿液）氯高铁血红素0.1ng/l 丹宁酸0.1ng/l 例1：操作时温度不同产生的抑制剂 Shames等人（1995）使用PVP（polyvinylpyrollidone）在4

3、分离粪便中的细菌DNA，然后用Chelex100处理。尽管用PVP在室温也可以分离DNA，但得到的DNA用于PCR扩增效果不够好，也许因为在更高的温度释放出了更多的PCR抑制剂。 例2：间接产生的抑制剂Yoshii T等人1992年，用单根头发提取DNA扩增线粒体DNA一段333bp的非编码区。所有实验均截取5cm长的毛干后研究表明染色剂中的过氧化后研究表明染色剂中的过氧化氢可以使不溶于水的黑色素变氢可以使不溶于水的黑色素变成水溶性的。成水溶性的。头发种类截取毛干区域扩增成功率自然黑发离根部11cm内100%离根部11cm外部分成功离根部16cm外几乎不成功白头发离根部31cm外可成功染成深咖

4、啡色的黑头发完全失败染成深咖啡色的白头发可成功扩增PCR增强剂 PCR增强剂可以增加所需PCR产物的产量或减少非特异性产物。有许多的PCR增强剂，原理各不相同，这些试剂不可能对所有的PCR反应都起作用。 根据其作用和原理，可以大致分为三类： 1.用于扩增高GC含量或形成复杂二级结构的模板（共溶剂） 2.用于保护DNA聚合酶的活性和稳定性 3.用于优化引物和模板的结合1.用于扩增高GC含量或形成复杂二级结构的模板的增强剂 甜菜碱（betaine），二甲基亚砜（DMSO）和甲酰胺（formamide），甘油，适合于扩增高GC含量和形成复杂二级结构的模板。 甜菜碱1M、DMSO1-10（5%？）、甲

5、酰胺1-5、甘油1-10对某些反应可以显著提高产量，但过量的这些试剂会抑制PCR反应。 在高浓度时，许多添加剂和共溶剂都可以抑制PCR，对不同浓度的引物和模板DNA的组合都应该通过经验来确定其最适浓度。根据我们的观点，当PCR出现问题时首先考虑的不应该是使用这些增强剂，而应该是对反应体系的控制成分进行优化，尤其是镁离子和钾离子的浓度。这个普遍这个普遍规律的一个例外是规律的一个例外是GC-Melt（Clontech公司）的应用公司）的应用，我们发现它常常能够克服和解决对富含G+C的模板进行扩增时效率低下的问题。 分子克隆实验指南 Frackman et al.(1998) have demons

6、trated (using NMR analysis) that the PCR additive provided by QIAGEN in their PCR core kit (Q-Solution) and that provided by CLONTECH in the Advantage-GC cDNA PCR kit is in fact Betaine which is available at a fraction of the cost as a 5M solution from Sigma-Aldrich (cat. # B 0300) 2.用于保护聚合酶的活性和稳定性的

7、增强剂 有的反应中，0.1mg/ml的BSA、 0.1-10的明胶（gelatin）或非离子型的去污剂，可以解决一些扩增失败的问题，这类试剂可以增加聚合酶的稳定性，减少试剂在管壁上的吸附。 BSA可以抵抗血色素、黑色素等的抑制作用. 非离子去污剂，例如Tween-20, NP-40和Triton X-100等，可以抵抗痕量的强离子去污剂的抑制作用，比如0.01%的SDS。3.用于优化引物和模板的结合 铵离子的添加，可以减少引物和模板的错配，提高反应的特异性，可以让PCR对反应条件的要求更低，所以很多PCR试剂都包含了10-20mM的硫酸铵。 氯化四甲胺tetramethyl ammonium

8、chloride（TMAC） （15-100mM ）也起到类似的作用4.其它增强剂 PEG 亚精胺 单链DNA结合蛋白例：Relief of Amplification Inhibition in PCR with Bovine Serum Albumin or T4 Gene 32 Protein 已知抑制剂：已知抑制剂： EDTA,SDS,Triton X-100，hemin（氯高铁血红素），bilirubin（胆红素），sodium glycocholate (甘胆酸钠)，sodium cholate plus deoxycholate（脱氧胆酸钠），sodium taurocholat

9、e,（牛黄胆酸钠），tannic acids（丹宁酸），humic acid(腐植酸)，氯化铁，氯化钠，采自泥炭和Suwannee河的腐植酸和fulvic acid(棕黄酸) PCR反应：扩增Bacteroides distasonis基因组 消除腐植酸抑制作用的最优BSA浓度是200-400ng/l，最优gp32浓度是100-150ng/l 因此，所有已知的抑制剂在检测时，都同时做了不含BSA和gp32的检测和含有400ng/l BSA或150ng/l gp32的检测。 抑制水平的定义：通过琼脂糖电泳观察，能够可重复性的降低PCR产量的最低抑制剂浓度。不添加任何增强剂PCR体系中加入400n

10、g/l BSAPCR体系中加入150ng/l gp32加和不加增强剂的比较结果1抑制剂不加增强剂时的抑制水平加入增强剂后的抑制水平增强剂效果EDTA 1mM 1mM 无效FeCl3 1mM 10M100倍bilirubin（胆红素） 10g/l100g/l10倍，不明显Humic acid，Hemin，tannic acid 0.1ng/l 10ng/l 100倍fulvic acid 1ng/l 100ng/l 100倍结果2 1. BSA和gp32都不能减少最小浓度的下列抑制剂的抑制作用：0.1M 氯化钠，0.1M SDS，10%Triton X-100，1-10g/l任何一种胆酸盐，ED

11、TA。 2. hemin的抑制作用可以被BSA或gp32明显减轻（1000倍），但其降解产物bilirubin却不能（小于10倍）。 3.氯化铁在含BSA或gp32时，抑制水平降低100倍（1mM VS 0.01mM），在氯化铁浓度大于1mM时，因为形成难溶的氢氧化物，释放氢离子，PCR反应体系的pH随着氯化铁浓度的增大迅速降低。没有其它抑制剂影响pH值，即使是在很高的浓度。 4.从鸡、奶牛，猪，马，绵羊粪便中提取的细菌片段，从Ohio河、大西洋、Delaware湾、一片沼泽地、一条淡水河、一条运河的过滤物中的提取物都能抑制PCR，但加入BSA或gp32后，PCR体系的容纳能力都可以提高10-1000倍。 谢谢