二代测序简介ppt课件.ppt

1、 第二代测序技术简介第二代测序技术简介2019-1公司理念公司理念：毅新兴业以生命科学研究为本，致力于科学技术服务，为客户提供完美的科研平台 。 基因组基因组 SNPs（包括芯片、massarray） 第二代大规模测序 病毒包装 miRNA表达谱 蛋白组蛋白组 血清多肽谱 2DE LC-MS（Shotgun法） 代谢组代谢组 NMR LC-MS自主仪器自主仪器 恒温金属浴 梯度PCR仪 恒温振荡仪Squenom质谱仪质谱仪SAI质谱仪质谱仪 MALDI TOF/TOF测序仪：测序仪：Polonator G.007 试剂试剂自主研发液体蛋白磁珠SBI试剂慢病毒RNA干扰库MicroRNA研究干细

2、胞研究2019-23内容提纲内容提纲从Sanger法到新一代测序技术第二代测序平台介绍第二代测序技术应用 宏基因组学（Metagenomics） 泛基因组学（Pangenomics）2019-3Key Genomics Technologiesl 1975 - Southern DNA hybridization techniquel 1977 - Sangers chain-termination and Maxam、Gilberts chemical DNA sequencing methodsl 1980 - Automated in situ oligonucleotide synth

3、esis instrumentl 1985 - Mulliss discovery of PCR at Cetusl 1992 - Affymatrix (Fodors group) first gene-chipl 1995 - ABIs first automated DNA sequencerl 2006 - 2nd generation DNA sequencer on marketl 2007 and beyond Single molecule sequencing techniques2019-4Sangers MethodlLabeled primer (1)lSequence

4、 reactions (4)lSequence separations (4)lSequence read-out2019-51st-Generation Automated DNA SequencerParallel runs on 96 capillaries on ABI 37002019-6Limitation of 1st Gen SequencerlThroughput lTime-consuming separation of chain-terminated fragmentslHard to produce massively parallel system based el

5、ectrophoretic separation lSequencing CostlSample handling lDifficult to miniaturize2019-7Need for Faster and Cheaper Sequencing TechnologyPersonal Genome Project2019-8Trends in Next-Generation Sequencingl Large-scale and high-throughputl Amplification on solid surface l Cluster generation (bridge or

6、 polony amplification )l Emulsion PCR (fragment on beads)l In situ sequencing by chain extensionl Sequence by synthesis DNA polymerase l Sequence by ligation DNA ligasel Massively parallel processingl Array of clusters, beadsl Miniaturization through microfluidicl Single molecule detection2019-9测序技术

7、目标测序技术目标陈竺，日本血吸虫基因组人类全基因组测序的目人类全基因组测序的目标：标：1000美元美元/人人2008年预测年预测5年内实现年内实现2006年底，美国X大奖基金会设立了基因组Archon X大奖，奖金高达1000万美元。这项大奖将颁给第一个能在10天之内，用不到100万美元的费用，完成100个人类基因组测序的团队。附加条件是覆盖率不小于98%，误差不大于1/100000 bp。2019-10Next-Gen PlatformslGA Illumina/SolexalSBS with reversible fluorescent terminatorslGS FLX Roche/4

8、54 Life ScienceslSBS through pyrosequencing lSOLiD ABI/AgencourtlSBL with dual base encodinglPOLONATOR Danaher MotionlSBL with base encoding2019-11Next-Gen Sequencing WorkflowFragment Library PreparationlRandomlPair-endImmobilization of Fragment lSurface, BeadlCovalent or non-covalentSequential Sequ

9、ence Extension ReactionlPolymeraselLigaseImage Acquisition and ProcessinglFluorescencelChemiluminescenceSequence Read and AssemblyClonal AmplificationlEmulsion PCRlColony/Cluster2019-122nd Generation PerformanceGS 454SOLiDSOLEXAPOLONATOR技术原理聚合酶聚合酶/焦磷酸酶焦磷酸酶连接酶连接酶聚合酶聚合酶连接酶连接酶单运数据产量0.40.6Gb50Gb20Gb20G覆

10、盖人基因组0.217617 平均读长（bp）400501002302样品准备2天天7天天9小时小时7天天运行时间10小时小时8天天9.5天天1周周精确度9999.9498.599%单次运行价格7万元万元3.5万元万元2.5万元万元40% off2019-13Roche/454 Life Sciences Genome Sequencer2019-14Roche/454 Workflow DNA Library PrepDNA FragmentEnd repairedAsymetric Adaptors ligated (one biotinylated)Immobilized on strep

11、tavidin coated magnetic beadsDenatured - ss template DNA libraryPurifiednEmulsion AmplificationnTemplate DNA immobilized on primer coated capture beads thru hybridization (1 fragment on each bead)nThermocyle to amplify (forward primer is biotinylated)nAmplified beads enriched with streptavidin coate

12、d magnetic beads2019-15Roche/454 Workflow Bead Deposition One amplified bead per microwell Followed by enzyme beads and packing beads Enzyme beadsSulfurylaseLuciferase Packing beads help to keep DNA bead in microwellnPyrosequencingn4 nucleotides sequentially flow innIncorporation of a nucleotide rel

13、eases a pyrophosphate (PPi)nSufurylase convert PPi into ATPnATP hydrolized by luciferase using luciferin to produce light2019-16PyrosequencingConvert PPi to ATPUse ATP to generate lightRemove (d)NTPs and excess ATP 2019-17Roche/454 Workflow Image AcquisitionBy CCD camera coupled to the picotiterplat

14、eChemiluminescent intensity reflects number of nucleotide incorporated in each flow; used to determine homopolymer regionUp to 100 cycles repeatednPost-acq ProcessingnDe novo sequencingnResequencingnAmplicon variant analysisnImage ProcessingnChemiluminescent event maped to wellnFlowgram generated fo

15、r each wellnBase called2019-18Roche/454 Life Sciences Genome Sequencer 速度快，一个测序反应耗时10个小时，获得100余万个读长和4-6亿个碱基对。 测序读长最长，单个序列的读长更长，平均可达到400-500个碱基左右 准确度高，读长超过400bp时，单一读长的准确性可以超过99%； 一致性好，测序结果一致性超过99.99%； 可以进行PairEnd测序研究； 2019-19功能强大的基因组分析工具功能强大的基因组分析工具 Polonator G.007 Polonator系统是由Dr. George Church和他的研究

16、小组发明，该系统使用了美国最先进试剂处理和检测的部件，采用了最敏感的检测设备，现在已发展成为一个包含多个基因组学应用领域的研究平台，并且承担了美国“Personal Genome Project”的个人基因组测序任务。Polonator G.007最大的优势在于开机运行成本低和Linux 开放资源软件。 2019-20Polonator G.007 Workflow配对末端文库制备配对末端文库制备：配对末端文库是将基因组DNA打断后，与中间接头连接，再环化，然后用Mme1酶切，使中间接头两端各有30bp的碱基，再加上两端的接头，形成文库。乳液乳液PCR：在微反应器中加入测序模板、PCR反应元件

17、、微珠和引物，进行乳液PCR（Emulsion PCR）。微球富集和固定微球富集和固定：PCR完成之后，变性模板，富集带有延伸模板的微珠，去除多余的微珠。将微珠沉积在一块玻片上，微珠上的模板经过3修饰，可以与玻片共价结合。连接反应测序连接反应测序：polonator连接反应的底物是9碱基单链荧光探针混合物。探针的5末端分别标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料。连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对，结合的探针就提供了一个荧光检测信号，最终被仪器识别。 2019-21Polonator G.007数据量 每次运行可以得到10Gb的高质量数据

18、 运行时间 80小时 读长 30bp2，每次运行可以读取1.2 1.3109个磁珠 准确性 超过99% 运行成本 仅为目前二代测序系统运行成本的60% 样品数/运行 同时支持2 8道最多16个样品测序2019-22Illumina/Solexa- Genome Analyzer Illumina Genome Analyzer是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，它基于专有的可逆终止化学反应原理。2019-23Illumina/Solexa Workflow2019-242019-252019-262019-27Solexa Genome Analyzer 测序通量高：每次运行后可获得30 G

19、B的高品质过滤数据； 简单、快速、自动化：制备样品文库可以在几小时内完成，一个星期内就能得到高精确度的数据； DNA序列的读取长度不断增加，当前达到100 bp； 单个或配对末端支持：Genome Analyzer系统支持单个片段或配对末端文库； 每张芯片有8个通道，每个通道可单独测序一个样品，也可以把多个样品混合在一起测序。2019-28ABI SOLiD Library PrepnSheared fragments are tagged with adapters (A1 and A2) to each end2019-29ABI SOLiD Emulsion PCRnEmulsion P

20、CR performed using DNA fragments from library on beads (m) coatd with one of the primers 2019-30ABI SOLiD Bead DepositionnAmplified bead enriched on polystyrene beads coated with A2 adaptor; any bead containing the extended products will bind polystyrene bead through its P2 end. This increase the th

21、roughput of beads with targeted DNA from 30% to 80%n3 end of enriched product modified to allow covalent attachement to glass slide surface randomly2019-31Fluorescent Probes2019-32ABI SOLiD Sequence by LigationnUse dual base encoding through 8-mer probes with a ligation site at the 3 end, a fluoresc

22、ent dye at the 5 end, and a cleavage site between the fifth and sixth nucleotidenEach color represents two nucleotides in which the second base of each dinucleotide unit constitutes the first base of the following dinucleotide, knowing just one base in the sequence will lead us to interpret the whol

23、e sequence 2019-33Next-Gen Research Applicationsde novo 测序测序全基因组重测序全基因组重测序/基因组结构变异基因组结构变异转录组测序转录组测序/外显子测序外显子测序小分子小分子RNA测序分析测序分析宏基因组学（宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（泛基因组学（ Pangenome ）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP测序测序 2019-3435Genome sequencing projects statisticsOrganismCompleteDraft assemblyIn progresstotalProkaryot

24、es979106710183064Archaea671338118Bacteria91210549802946Eukaryotes22189169380Animals47559138Mammals2281848Birds 213Fishes 369Insects121729Flatworms 224Roundworms191121Amphibians 11Reptiles 11Other animals 121426Plants2124458Land plants293849Green Algae 369Fungi107638124Ascomycetes8602694Basidiomycete

25、s110819Other fungi16411Protists6242454Apicomplexans111719Kinetoplasts1258Other protists41012262019-35Next-Gen Research Applicationsde novo 测序测序全基因组重测序全基因组重测序/基因组结构变异基因组结构变异转录组测序转录组测序/外显子测序外显子测序小分子小分子RNA测序分析测序分析宏基因组学（宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（泛基因组学（ Pangenome ）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP测序测序 2019-36人类基因组计划人类基因

26、组计划Human Genome Project 1000 Genomes Project Personal Genome Project Cancer Genome Project 2019-37Next-Gen Research Applicationsde novo 测序测序全基因组重测序全基因组重测序/基因组结构变异基因组结构变异转录组测序转录组测序/外显子测序外显子测序小分子小分子RNA测序分析测序分析宏基因组学（宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（泛基因组学（ Pangenome ）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP测序测序 2019-38转录组测序转录组测序/外显子

27、测序外显子测序转录本结构研究转录本结构研究：UTR鉴定、鉴定、Intron边边界鉴定、可变剪切研究等。界鉴定、可变剪切研究等。 非编码区域功能研究：非编码区域功能研究：non-coding RNA研究、研究、microRNA前体研究等。前体研究等。 基因转录水平研究基因转录水平研究 全新转录区域研究全新转录区域研究 千种植物转录组研究计划千种植物转录组研究计划 2019-39Next-Gen Research Applicationsde novo 测序测序全基因组重测序全基因组重测序/基因组结构变异基因组结构变异转录组测序转录组测序/外显子测序外显子测序小分子小分子RNA测序分析测序分析宏基

28、因组学（宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（泛基因组学（ Pangenome ）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP测序测序 2019-40小分子小分子RNA测序分析测序分析新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的预测和鉴定样品间差异表达分析miRNAs聚类和表达谱分析等 Small RNA（micro RNAs、siRNAs和 pi RNAs）是生命活动重要的调控因子，在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。2019-41Next-Gen Research Applicationsde novo 测序测序全基因组重测序全基因组重测序/基因组结构变

29、异基因组结构变异转录组测序转录组测序/外显子测序外显子测序小分子小分子RNA测序分析测序分析宏基因组学（宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（泛基因组学（ Pangenome ）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP测序测序 2019-42Metagenomics宏基因组学 （也称元基因组学、环境基因组学、生态基因组学）是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以测序分析和功能基因筛选为研究手段，研究微生物多样性、 种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间关系的新方法。对特定环境微生物种群全基因组DNA研究，可以从整体上对样品群落进行分析，不受微生物是否能培养的限

30、制，而且研究对象从单一基因组到一个基因组集合，也摆脱了对于传统基因组研究的物种限制，开辟了微生物群体基因组学研究的新路径。2019-43Next-Gen Research Applicationsde novo 测序测序全基因组重测序全基因组重测序/基因组结构变异基因组结构变异转录组测序转录组测序/外显子测序外显子测序小分子小分子RNA测序分析测序分析宏基因组学（宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（泛基因组学（ Pangenome ）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP测序测序 2019-44PangenomePangenome (whole, supra-genome) is

31、the total gene repertoire in a given species, including: core genome, which is shared by all individuals, dispensable genome, which is shared by some individuals, unique genome, which is unique to an individual. 2019-45Next-Gen Research Applicationsde novo 测序测序全基因组重测序全基因组重测序/基因组结构变异基因组结构变异转录组测序转录组测序

32、/外显子测序外显子测序小分子小分子RNA测序分析测序分析宏基因组学（宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（泛基因组学（ Pangenome ）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP测序测序 2019-46DNA甲基化分析甲基化分析在哺乳动物中，甲基化位点一般发生在CpG的C位点上，导致C碱基的5号碳原子上被加上一个甲基。DNA甲基化也是目前研究得最为深入的表观遗传学标记。重亚硫酸氢盐-基因组测序法（bisulfite sequencing）是研究DNA甲基化的有力工具。用重亚硫酸氢盐（bisulfite）处理DNA后，C碱基被转换成U碱基，而发生甲基化的C碱基则维持不变。在随后进行的

33、PCR扩增过程中，U碱基被替换成T碱基。因此，重亚硫酸氢盐的处理会反映出单个C碱基的甲基化状态。重亚硫酸氢盐法与高通量的测序方法结合后，能够无偏向的提供全基因组范围内的甲基化位点信息。 2019-47Next-Gen Research Applicationsde novo 测序测序全基因组重测序全基因组重测序/基因组结构变异基因组结构变异转录组测序转录组测序/外显子测序外显子测序小分子小分子RNA测序分析测序分析宏基因组学（宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（泛基因组学（ Pangenome ）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP测序测序 2019-48ChIP-seqChIP

34、-Seq是继ChIP-Chip之后蛋白/核酸相互作用研究领域的又一技术突破。通过对染色质免疫共沉淀（ChIP）获得的DNA片段进行大规模测序，可获得数百万条序列标签，并能把所研究蛋白的DNA结合位点精确定位到基因组上。2019-49后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料仅供参考，实际情况实际分析The user can demonstrate on a projector or computer, or print the presentation and make it into a film to be used in a wider field第二代测序平台解决方案：第二代测序平台解决方案：de novoresequencingmethylation Meta-Genomics Small RNAChIP-Seq 2019-52