血凝检测原理-ppt课件.ppt

1、血凝检测原理1ppt课件仪器检测原理 凝固法(凝块形成) 发色底物法 (吸光度变化) 免疫比浊法 (乳胶粘合)2ppt课件 凝固法凝固法 PT,APTT,TT,FIB(PT-Based & FIB- Clauss), Factors II, V, VII, X, VIII, IX, XI, XII,Protein C, Protein S, APC-R, LAC,PCX,HPX 发色底物法发色底物法 Anti-thrombin,Heparin(普通&低分子), Plasminogen, Plasmin Inhibitor, 免疫比浊法免疫比浊法 D-Dimer, vWF（活性及含量）, Fre

2、e Protein S，VIII含量，HS-CRP 正在研发的实验项目： 仪器检测项目仪器检测项目3ppt课件Photo-optic method:IL instrumentationFrom ACL 100 ACL Futura ACL Topto ACL 10000 ACL Advanceto ACL Elite 凝固法凝固法 660 880 671 散射比浊散射比浊 透射比浊透射比浊 透射比浊透射比浊发色底物法发色底物法 405 405 405 吸光率吸光率 吸光率吸光率 吸光率吸光率乳胶乳胶 凝集试验凝集试验 405 405 405 or 671 Electra = 550 for c

3、lotting and 405 for chromogenic4ppt课件测量浊度的变化它并不是一种由于颜色变化引起的吸收值的变化（区别于发色底物法)为了避免干扰（胆红素，血红蛋白），通常选择高波长进行检测凝固反应凝固反应光学检测法5ppt课件胆红素胆红素血红蛋白血红蛋白乳糜乳糜胆红素，血红蛋白和乳糜在检测时吸收峰位置胆红素，血红蛋白和乳糜在检测时吸收峰位置波长波长ACLOtherOther6ppt课件凝固法检测史7ppt课件手工法检测反应在试管内发生(37 C水)凝块形成，操作人员肉眼可见操作人员记录时间8ppt课件手工法检测9ppt课件血凝常规检测血浆或稀释血浆血浆或稀释血浆 (37 (3

4、7C C孵育孵育) ) + + 试剂试剂 ( (预加热预加热 37 37C)C)- 纤维凝块形成纤维凝块形成- 纤维凝块形成所需时间纤维凝块形成所需时间10ppt课件所有的凝固反应均为纤维凝块形成过程的检测如: PT, APTT, Fibrinogen Clauss, 因子检测, 等纤维蛋白凝块检测11ppt课件持续检测光密度变化 (透射法或散射法）凝固时间由数学运算法则决定 (域值, 第一演算法,第二演算法等)光学法检测光学法检测12ppt课件 最经典的运算法则:阈值，正好能产生特定效应的界限（反应浊度的变化) 第一法则 (反应速度) 第二法则 (反应加速度)仪器的运算法则决定反应时间13p

5、pt课件运算法则运算法则: 阈值法阈值法Time凝固点浊度或光散射值阈值法（凝固起始点）浊度阈值法用于 (曲线delta的绝对值或百分比)允许识别凝固点 14ppt课件应用于下列情况:Example: 纤维蛋白原Clauss; delta信号弱, 当FIB浓度高时，曲线上升快，而浓度低时曲线上升缓慢。在某些标本中逆向检测的阈值用于曲线的末端是非常平坦的。阈值法阈值法运算法则运算法则: 阈值法阈值法15ppt课件Time凝固点一阶导数法一阶导数法It is established that the maximum speed of the reaction represents the clot

6、 point浊度或光散射值运算法则运算法则: 一阶导数法一阶导数法16ppt课件运算法则运算法则: 一阶导数法一阶导数法17ppt课件用于以下情况用于以下情况:基线不总是平坦的 通常情况下，反应速度快凝固曲线信号清晰，纤维蛋白形成过程中没有起伏凝固的时间较长 (与阈值法或二阶导数法比较) 一阶导数一阶导数运算法则运算法则: 一阶导数法一阶导数法18ppt课件应用于以下情况应用于以下情况:Example: Recombiplastin; 凝固曲线上升很快, 凝固曲线的形状清晰, 凝固时间较长 (与阈值法或二阶导数法比较)一阶导数的曲线总是正的 (or zero)一阶导数一阶导数运算法则运算法则:

7、 一阶导数法一阶导数法19ppt课件Time凝固点凝固点二阶导数二阶导数反应的最大加速度点反应的最大加速度点运算法则运算法则: 二阶导数法二阶导数法浊度或浊度或光散射值光散射值20ppt课件运算法则：二阶导数法运算法则：二阶导数法21ppt课件用于以下情况用于以下情况:基线不总是平坦的通常情况下反应加速度快凝固曲线信号清晰，在基线和凝块形成期无起伏该运算法则主要应用于凝固反应试验(i.e. APTT type)二阶导数法二阶导数法运算法则运算法则: 二阶导数法二阶导数法22ppt课件通常应用于下述情况通常应用于下述情况:Example: APTT; 凝固曲线相对清晰，反应加速度快， 曲线外观没

8、有大的起伏。二阶导数曲线可正可负。二阶导数二阶导数运算法则运算法则: 二阶导数二阶导数23ppt课件实际上，大部分凝固反应运算使用的是二阶导数。少许情况下使用一阶导数。其它一些反应使用阈值法更合适。不同的运算法则由不同的试验所选择。一种完善的算法是否存在一种完善的算法是否存在 ?凝固曲线24ppt课件发色底物法发色底物试验的基本反应是：发色底物试验的基本反应是：未稀释血浆或稀释后血浆未稀释血浆或稀释后血浆(incubated at 37C) + 试剂试剂 (酶酶)-中间复合物中间复合物+ 试剂试剂(底物底物)剩余的酶能水解特殊的底物，剩余的酶能水解特殊的底物， 去除去除pNA 分子，产生颜色反

9、分子，产生颜色反应。应。发色底物试验发色底物试验25ppt课件发色底物法(如：抗凝血酶试验)AT + HeparinAT*HeparinAT*Heparin + FXa (excess)AT-FXa- Heparin + FXa (residual)Chromogenic substrateFXa (residual)Peptide + pNA标本与肝素（外源性）一同孵育。标本与肝素（外源性）一同孵育。过量的过量的FXa 加入。加入。过量的过量的FXa水解加入的底物。水解加入的底物。pNA产生。产生。26ppt课件Chromogenic MethodpNA呈黄色，随后被分光光度计测量呈黄色，随

10、后被分光光度计测量 (at 405 nm).测量值与定标曲线比较得出浓度值。测量值与定标曲线比较得出浓度值。27ppt课件发色底物法Antithrombin:Neat plasma 100%, diluted at 50 % and 25%28ppt课件发色底物法00.10.20.30.40.50.60.7020406080100120140Antithrombin %A 405 nm-490 nmAT Linearity29ppt课件免疫比浊法，二聚体检测30ppt课件免疫学方法D-Dimer Curve31ppt课件典型的曲线像一个大的S有一个初始的基线，一个上升阶段和一个终点 (平台期)

11、 反应曲线反应曲线 32ppt课件反应曲线反应曲线时间初期; 凝血因子激活期纤维蛋白原正在转化为纤维蛋白平台期; 所有的纤维蛋白原均已转化为纤维蛋白吸光度变化33ppt课件结论：34ppt课件a ab bg g纤维蛋白的形成过程a ab bg gFibrinogen is composed of 3 chains纤维蛋白原分子的每一条链由两部分组成 the formula is: 2(a,b,g)35ppt课件纤维蛋白的形成过程纤维蛋白原转变为纤维蛋白通过三个步骤1. 蛋白水解(通过凝血酶) ThrombinFibrinogenThrombinFibrinopeptide AThrombinF

12、ibrinopeptide B凝血酶水解纤维蛋白肽36ppt课件纤维蛋白的形成过程2. 纤维蛋白单体自发聚合37ppt课件纤维蛋白的形成过程2. 纤维蛋白单体自发聚合38ppt课件纤维蛋白的形成过程2. 纤维蛋白单体自发聚合39ppt课件纤维蛋白的形成过程Fibrin fibre2. 纤维蛋白单体自发聚合40ppt课件纤维蛋白的形成过程2. 纤维蛋白形成纤维蛋白网41ppt课件纤维蛋白的形成过程3.通过铰链形成稳定的纤维蛋白Thrombin42ppt课件纤维蛋白的形成过程Thrombin3.通过铰链形成稳定的纤维蛋白43ppt课件纤维蛋白的形成过程Thrombin3.通过铰链形成稳定的纤维蛋白

13、44ppt课件纤维蛋白的形成过程3.通过铰链形成稳定的纤维蛋白45ppt课件纤维蛋白的形成过程3.通过铰链形成稳定的纤维蛋白46ppt课件3.通过铰链形成稳定的纤维蛋白纤维蛋白的形成过程47ppt课件PT衍生纤维蛋白原（PT based FIB ）Clauss法纤维蛋白原（Clauss FIB）ACL系列凝血仪纤维蛋白原检测48ppt课件FIB的检测方法PT based FIB的基本原理的基本原理 基于PT反应曲线光学差值与FIB浓度的线性关系DODDOD1DOD2DOD3250mg/dl125mg/dl62mg/dlDOD3DOD2DOD1062125250mg/dlFIB时间DODPTPT

14、PTDOD x FIB浓度浓度49ppt课件FIB的检测方法Clauss法法FIB的基本原理的基本原理时间:S 浓度：mg/dL525105101520IntrinsicExtrinsicCommon浓缩凝血酶纤维蛋白原纤维蛋白FIB凝固时间凝固时间 1 50ppt课件首选Clauss方法NCCLS推荐如考虑测试成本，可选用PT based FIB做常规筛查，超出200-400mg/dL范围样品及OAT病人样品用Clauss法复查FIB方法使用建议51ppt课件 Clause 方法与PT 衍生法结果比较口服抗凝药病人标本标本: 411 正常人正常人, 50 位口服抗凝药病人位口服抗凝药病人方法方法: Clauss 和和PT 衍生法衍生法结果结果: Clauss PT derived 正常人正常人 320124 289126 (mg/dl)口服抗凝药病人口服抗凝药病人421154 487194 (mg/dl)口服抗凝药病人口服抗凝药病人PT 衍生法结果比衍生法结果比 Clause 法高法高24% 52ppt课件 谢 谢53ppt课件